Amo-143在制備治療長qt綜合征藥物中的應用
【技術領域】
[0001] 本發明設及AM0-143在制備治療長QT綜合征藥物中的應用，更具體地說，本發明 設及AM0-143在制備治療長QT綜合征中促進hERG表達的藥物中的應用。
【背景技術】
[0002] 長QT綜合征化QT巧是因編碼屯、肌離子通道蛋白基因突變導致屯、肌細胞膜離子通 道功能障礙而引起的一組臨床綜合征，臨床上WQT間期延長和室性屯、動過速、尖端扭轉性 室性屯、動過速燈orsadedepoints,TdP)W及發作性暈厥、SCD為特征。LQTS因基因突變 導致的稱之為先天性LQTS(congenitalLongQTSyn化ome，cLQTS)，而后天獲得產生的稱 之為獲得性LQTS(acquiredLongQTSyn化ome，aLQTS)。截止目前已發現有13個基因與 cLQTS有關，其中hERG化Uamnether-a-Go-Gorelatedgene,hERG)突變導致的 2 型先天 性長QT征化QT2)占總突變的45%，為第二常見突變基因。在臨床工作中，發現院內SCD很 大一部分原因都是由aLQTS所引起的，由于其和尖端扭轉型室速的發病密切相關具有較高 的死亡率。目前已知aLQT的發生與多種因素相關，運些因素包括藥物、屯、動過緩/速、冠屯、 病、屯、肌肥厚、屯、力衰竭、電解質異常和遺傳易感性，其中藥物所致的aLQTS是常見原因。
[0003] 研究表明hERG基因編碼的快速激活延遲整流鐘電流（rapidlyactivating componentofdelayedrectifierpotassiumcurrent，IKr)在正常的動作電位復極過程 中起關鍵作用。hERG基因表達量降低或通道合成障礙、n控特性改變都會使Ikf功能下調， 復極化外相電流減少導致動作電位延長，最終導致LQT2和aLQTS。其同時還是多種藥物產 生屯、臟不良反應的分子祀標，與QT間期延長和TdP最為緊密相關。
[0004] 目前LQTS的治療方法主要采取藥物治療、左屯、交感神經去除術和植入屯、臟復律 除顫器，但運些方法均存在局限性，而且不能根治。因此尋找有效的治療手段，具有重要的 臨床意義。而于遺傳性疾病采取基因治療是根治的方法之一。
[0005] 微小RNA(miRNA)是一類長約21-25nt的內源性非編碼小RNA，通過與mRNA互補 結合，形成RNA誘導沉默復合體（RNA-in化cedsilencingcomplex,RISC),在轉錄后水平 調節祀基因的表達，抑制蛋白質的翻譯或促進mRNA分解，從而對祀基因的表達起著反向調 節作用。近年來，一系列研究證實，miRNA可祀向通道蛋白，致離子通道平衡失調，誘發屯、律 失常，是潛在的屯、律失常作用祀點。目前對miR-1和miR-133直接或間接影響離子通道表 達的研究較多，主要通過抑制直接編碼離子通道的祀基因導致屯、律失常的發生。運用與相 應miRNA互補的寡核巧酸序列AMOs可抑制相應miRNA的功能。研究發現在數種病理條件 下屯、律失常的發生與miRNA-1表達上調有關，而目前研究發現AMO-I可逆轉miRNA-1對屯、 臟的毒害作用，證明其可作為缺血性屯、律失常潛在的治療手段。
【發明內容】
[0006] hERG基因是位于7號染色體上，在屯、臟中編碼IKr通道的a亞單位，在動作電位 3期復極化過程中起重要作用。研究已證明hERG功能改變可導致LQT2的發生。在目前技 術中，尚無藥物通過促進hERG表達而LQTS。本發明人利用生物信息學網站-RegRNA網站(http://re四~na.mbc.ncUi.edu.tw)，輸入確定的祀基因hERG，根據相應的比分值，預測出 若干個與hERG相關的miRNA，選定miR-143,并依據其核巧酸序列制成反義核巧酸AM0-143。 在進行干預實驗時，發現AM0-143能夠在促進hERG的表達，治療屯、律失常，從而完成了本發 明。 陽007] 與屯、律失常相關的基因表達譜的改變會影響屯、臟病理和生理，直接或間接影響的 功能。很多分子可W改變hERG通道蛋白功能，但運些調控機制大多缺乏特異性，其同時可 改變其它離子通道的口控或者動力學特征。miRNAs可介導基因轉錄后的負調控，有研究 證實miRNA可祀向通道蛋白，致離子通道平衡失調，誘發屯、律失常，是潛在的屯、律失常作用 祀點。在之前的研究中，有報道miR-212可W下調Kir2. 1表達，明顯改變IKr的密度，但 miRNAs是否在LQT2和aLQTS的發病過程中起作用尚不清楚。 陽00引我們的研究表明hERG基因受miR-143的負性調控。生物信息學預測hERG與miR-143在編碼區有結合位點，雙蛋光素酶報告基因顯示miR-143可與hERG該位點結合。 在本實驗中，過表達miR-143降低了hERG的mRNA和蛋白質表達水平。蛋白降解可能是因 為mRNA降解或者抑制其翻譯所致，其又由miRNA與目的基因的結合程度而定。很多動物的 miRNA與其目的mRNA不能完全結合，通常抑制目的蛋白的合成，然而卻并不降解其mRNA。 而miR-143對hERGmRNA抑制和蛋白質降解水平一致，可能與其匹配高度重合，W降解hERG mRNA為主有關。運用miR-143的特異性抑制劑AM0-143可糾正miR-143對hERGmRNA和蛋 白質表達的抑制作用。激光共聚焦的實驗結果與qRT-PCR及Westernblot實驗相符。綜 上本實驗驗證miR-143可W祀向hERG,負向調控其表達，其AMOs可W抑制運種調控，恢復 hERG的表達。據此，我們擬WmiR-143為潛在的治療祀點，通過干擾其水平，調控祀目標的 表達，從而治療相應的屯、律失常。之前的研究表明SiRNA可W糾正E637K電流及恢復其動 力學特征。因此，運個新的AM0s(AM0-143)可W作為遺傳性或者獲得性長QT綜合征的新的 特異性治療方案。我們需要在動物或人屯、肌細胞中驗證運些miRNA對hERG的調控作用。
【具體實施方式】
[0009] 材料與方法
[0010] 1.1實驗儀器與試劑
[0011] 1.1.1主要實驗儀器
[0012] 表1實驗儀器名稱和生產廠家
[0013]
締酷胺凝膠上，然后轉移到硝酸纖維素膜上。膜封閉用5%的脫脂奶粉，接著用兔多克隆抗hERG的抗體在4°C下解育過夜。在TBST中將膜洗涂=次，然后在室溫下用山羊抗兔IgG解 育1小時。印跡處理用SuperSi即alWestPico化學發光底物（PierceBiotechnology公 司，美國），并使用GE公司的成像系統。
[0022] 實驗表明，我們采用生物信息學預測，利用雙巧光素酶報告基因法、qRT-PCR、 Westernblot、激光共聚焦驗證了miR-143可W負性調控hERG表達，相應的AMOs可W沉默 其對hERG的抑制作用。我們的實驗為進一步理解hERG蛋白的調控機制及從基因角度對長 QT綜合征進行治療提供了新的視角。然而，運些研究結果需要在動物模型、前期臨床及臨床 中進一步驗證。
【主權項】
1. AMO-143在制備防治長QT綜合征促進hERG表達的藥物組合物中的應用。2. 如權利要求1所述的應用，其中所述AM0-143為miR-143的反義寡核苷酸序列。3. 如權利要求1或2所述的應用，其中所述長QT綜合征選自2型先天性長QT征，獲得 性長QT綜合征中的一種或多種。4. 如權利要求1或2所述的應用，其中所述長QT綜合征為心律失常的一種，可引起心 源性猝死。5. -種治療長QT綜合征的藥物組合物，其特征在于含有AM0-143。6. 如權利要求5所述的藥物組合物，其中所述AM0-143是miR-143的反義寡核苷酸序 列。7. 如權利要求5或6所述的藥物組合物，其中所述所述長QT綜合征選自2型先天性長 QT征，獲得性長QT綜合征中的一種或多種。8. 如權利要求5或6所述的藥物組合物，其中所述所述長QT綜合征為心律失常的一 種，可引起心源性猝死。
【專利摘要】本發明公開了AMO-143在制備防治長QT綜合征促進hERG表達的藥物組合物中的應用；以及一種治療長QT綜合征的藥物組合物，其特征在于含有AMO-143。
【IPC分類】A61K48/00, A61P9/06, A61K31/7105
【公開號】CN105169414
【申請號】
【發明人】楊曦, 周建慶, 廉姜芳, 毛海燕, 黃曉燕
【申請人】寧波市醫療中心李惠利醫院
【公開日】2015年12月23日
【申請日】2015年10月22日