金屬表面刻蝕納米孔陣列的制備方法及其用途的制作方法

專利名稱：金屬表面刻蝕納米孔陣列的制備方法及其用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種新型植入材料及其制備方法和應用，具體地說，是一種鈦表面 TiO2納米孔陣列結構的應用及其制備方法。
背景技術：
生物醫用材料是指以醫療為目的，用于與活體組織接觸并能實現某種功能的無生命材料(國際標準化組織ISO，1987. 10)。深入研究植入材料與人體的相互作用及由此產生的材料反應和宿主反應是研制理想生物醫用材料的前提和必要條件。材料表面與受面組織細胞的相互作用是骨種植體材料臨床應用效果好壞、治療成功與否的關鍵性因素之一。材料表面特性影響組織細胞的黏附和生長，還將進一步影響細胞的增殖、分化和凋亡等一系列生理過程。鈦作為醫用人體硬組織植入材料已獲得廣泛應用，生物相容性較好，且能行使比較理想的生物學功能。但鈦是一種惰性材料，它的結構和性質與骨組織相差較大，不能象生物相容性好的材料那樣可以與骨組織發生生物化學性結合。鈦與骨組織之間僅為機械性骨整合，植入骨組織后失敗的根本原因也在于此。已有的研究結果提示，植入材料表面修飾是解決這一難題的主要方法。近年來，納米材料因其結構的特殊性，表現出許多不同于傳統材料的物理、化學和生物性能，已被成功地應用于醫學領域中。在口腔學、骨科學和整形外科學領域，鈦種植體表面納米化處理技術也有研究和應用的報道，對純鈦表面進行納米形貌結構的修飾提高其生物相容性，已成為生物材料的前沿研究領域。納米TW2薄膜是一種功能性薄膜，在醫學領域也有較廣闊的應用前景。納米TiO2薄膜的制備方法很多，主要有液相制備方法、物理制備法、化學氣相沉積法和電化學方法等，其中，陽極氧化法是制備鈦表面納米TiO2薄膜最經濟、最常用的方法之一。毋庸置疑，鈦作為目前最常用的骨種植體材料，其表面粗糙法是其表面處理研究的主流方向，納米技術是目前表面處理的熱點技術之一，美國航空航天管理局(NASA)對納米技術的定義為通過對納米尺度的控制(I-IOOnm)，創造出具有新型功能的材料、裝置和系統，開發出材料的新現象和新性質(包括物理、化學和生物性質)。而納米技術材料既可以是由納米物質組成的材料，也可以是具有納米結構表面的材料。目前常用的種植體表面納米處理方法有物理壓縮法、分子自組裝技術、納米顆粒沉積法、激光刻蝕法、納米生物模擬法等，但是這些傳統方法具有表面結構不均勻、易脫層、操作復雜等缺點。同時，不同的納米尺度及形貌對細胞產生截然不同的影響，因此探索及研發有利于提高骨種植體成功率的納米形貌是研究的方向之一。在鈦表面用陽極氧化法制備TW2納米管陣列的方法已經有較多的研究報道，有體外研究證明，采用電化學陽極氧化法在鈦表面制備特定尺度和形貌的TiO2納米管陣列層， 能夠不同程度地影響成骨細胞黏附、增殖與分化能力。鈦表面不同納米化修飾對細胞生物行為的影響由鈦表面生物材料與細胞間的相互作用決定，其影響因素是材料的表面特征， 包括表面形貌、表面能、表面電荷和表面成分及其化學狀態。細胞與鈦植入材料間的相互作用僅僅發生于組織與鈦的界面上，所以鈦表面特征在這一相互作用中發揮了至關重要的作用，即鈦表面的性質及其與組織接觸過程中的變化是影響細胞-鈦相互作用的關鍵因素。 目前TiO2納米管的制備方法主要包括模板合成法、水熱合成法和陽極氧化法三種。雖然模板法能夠制備不同尺寸的TiA納米管，通過調節工藝參數來控制Ai2O3模板的孔徑尺寸，但模板合成法很難合成直徑較小的納米管，并且管壁粗糙；水熱合成法雖然操作比較簡單，而且可以制得管徑較小的TiO2納米管，但納米管的特征卻較大程度依賴于原料TiO2微粒的尺寸和晶相，并且納米管陣列不整齊；而陽極氧化法可以通過改變工藝條件來制備不同尺寸且光滑有序的納米管，其最佳的合成條件還有待于進一步探索。本課題組研究了鈦表面TiO2納米孔層陣列結構對骨髓基質細胞(bone marrow stromal cells, BMSCs)的黏附、鋪展形態等生物學特性的影響，采用電化學陽極氧化法和化學腐蝕技術，在純鈦表面制備出特定尺度和形貌的TW2納米孔層陣列結構，以BMSCs為研究對象，應用激光共聚焦顯微鏡、掃描電子顯微鏡等技術檢測細胞黏附、鋪展形態和骨架蛋白排列等生物學特性，證明陽極氧化法和化學腐蝕技術制備的鈦表面TiO2納米孔層陣列結構對BMSCs的黏附、鋪展等生物學行為起到顯著的促進作用(詳見張梅，黃其煜，周曉健，孫強等.鈦表面TiO2納米孔對骨髓基質細胞黏附和鋪展的影響[J].上海口腔醫學，2009，18(5) :493-498.)。中國專利文獻CN101792923A公開了一種鈦片表面納米尺度粗糙化的方法，通過鈦片制備二氧化鈦納米管陣列，再腐蝕鈦片得到納米尺度粗糙化表面。雖然在鈦表面用陽極氧化法制備TW2納米管的方法已經有較多的研究報道，但應用電化學陽極氧化法聯合化學腐蝕技術在鈦表面制備力學性能穩定的、特定尺度的T^2納米孔陣列結構，并對該類材料影響細胞生物學行為進行相關研究，國內外尚未見報道。

發明內容
本發明的目的是針對現有技術中的不足，提供一種鈦表面刻蝕T^2納米孔陣列結構在制備人體金屬植入物和固定物中的應用。本發明的第二個目的是，提供一種鈦表面刻蝕TiO2納米孔陣列結構。本發明的第三個目的是，提供一種鈦表面刻蝕TiA納米孔陣列結構的制備方法。為實現上述目的，本發明采取的技術方案是一種鈦表面刻蝕TiA納米孔陣列結構在制備人體金屬植入物中的應用，所述的人體金屬植入物為牙種植體、骨種植體、固定板、固定釘，所述的結構是在純鈦或鈦合金表面制備得到特定納米尺度的TiO2納米孔層陣列結構，所述的納米孔的孔徑大小為20-25nm，孔的深度為8-12nm，深寬比約為0. 3-0. 45， 納米結構分布均勻。所述結構的制備方法包括應用陽極氧化法制備TiA納米管陣列，隨后應用化學腐蝕技術制備TW2納米孔陣列，所述的陽極氧化法制備TW2納米管陣列的步驟包括1)純鈦或鈦合金，分別用丙酮、無水乙醇、去離子水各超聲清洗10-20分鐘，干燥后備用；2)分別量取98ml乙二醇、2. 5ml 2wt%的去離子水和0. 335g 0. 3wt%的NH4F配制電解液，緩慢攪拌5-15分鐘；3)保持20°C恒溫，以鈦片作為陽極，鉬電極為陰極，在20V電壓下陽極氧化 100-110分鐘；4)將制得的材料樣品分別在無水乙醇和去離子水中超聲清洗6-8分鐘，干燥備用即可。所述的化學腐蝕技術制備TiA納米孔的步驟包括1)采用25%氨水、30%雙氧水及去離子水按1:1:5的摩爾比配置腐蝕液；2)將腐蝕液加熱到70°C，并保溫1至2分鐘；3) 將權利要求4制備的已生長完TW2納米管陣列的鈦材料放入腐蝕液內，腐蝕25-30分鐘； 4)把處理過的樣品取出，用流動的去離子水沖洗5分鐘后，浸泡到去離子水中，并每隔1小時換水一次，重復三次。為實現上述第二個目的，本發明采取的技術方案是一種鈦表面刻蝕TiO2納米孔陣列結構，所述的結構是在純鈦或鈦合金表面制備得到T^2納米孔層陣列結構，所述的納米孔的孔徑為20-25nm，孔的深度為8-12nm，深寬比為0. 3-0. 45，納米結構分布均勻。所述結構的制備方法包括應用陽極氧化法制備T^2納米管陣列和化學腐蝕技術制備TW2納米孔，所述的陽極氧化法制備TiA納米管陣列的步驟包括1)純鈦或鈦合金，分別用丙酮、無水乙醇、去離子水各超聲清洗10-20分鐘，干燥后備用；2)分別量取98ml乙二醇、2. 5ml 2wt%的去離子水和0. 335g 0. 3wt%的NH4F配制電解液，緩慢攪拌5_15分鐘；
3)保持20°C恒溫，以鈦片作為陽極，鉬電極為陰極，在20V電壓下陽極氧化100-110分鐘；
4)將制得的材料樣品分別在無水乙醇和去離子水中超聲清洗6-8分鐘，干燥備用即可。所述的化學腐蝕技術制備TiA納米孔的步驟包括1)采用25%氨水、30%雙氧水及去離子水按1:1:5的摩爾比配置腐蝕液；2)將腐蝕液加熱到70°C，并保溫1至2分鐘；3) 將權利要求4制備的已生長完TW2納米管陣列的鈦材料放入腐蝕液內，腐蝕25-30分鐘； 4)把處理過的樣品取出，用流動的去離子水沖洗5分鐘后，浸泡到去離子水中，并每隔1小時換水一次，重復三次。為實現上述第三個目的，本發明采取的技術方案是一種鈦表面刻蝕TiO2納米孔結構的制備方法，所述的結構的制備方法包括在純鈦或鈦合金表面應用陽極氧化法制備 TiO2納米管陣列和化學腐蝕技術制備TiA納米孔，所述的陽極氧化法制備TiA納米管陣列的步驟包括1)純度99%的醫用純鈦或鈦合金，分別用丙酮、無水乙醇、去離子水各超聲清洗10-20分鐘，干燥后備用；2)分別量取98ml乙二醇、2. 5ml 2wt%的去離子水和0. 335g 0. 3wt%的NH4F配制電解液，緩慢攪拌5-15分鐘；3)保持20°C恒溫，以鈦作為陽極，鉬電極為陰極，在20V電壓下陽極氧化100-110小時；4)將制得的材料樣品分別在無水乙醇和去離子水中超聲清洗6-8分鐘，干燥備用即可。所述的化學腐蝕技術制備TiA納米孔的步驟包括1)采用25%氨水、30%雙氧水及去離子水按1:1:5的摩爾比配置腐蝕液；2)將腐蝕液加熱到70°C，并保溫1至2分鐘；3) 將權利要求4制備的已生長完TW2納米管陣列的鈦材料放入腐蝕液內，腐蝕25-30分鐘； 4)把處理過的樣品取出，用流動的去離子水沖洗5分鐘后，浸泡到去離子水中，并每隔1小時換水一次，重復三次。本發明優點在于
1、與現有技術相比，本發明可以在常溫常壓條件進行；
2、創新性的采用電化學陽極氧化法結合特定腐蝕技術對鈦表面進行納米級修飾，制備 TiO2納米孔陣列規整有序，方法工藝簡單，操作方便，成本低廉，工藝流程短，克服磁共濺射法、等離子噴涂法、表面塑性變形法等制備出得納米結構不夠均勻整齊，制備工藝復雜，費時成本高等缺點，是一種較有前景的種植材料表面形貌的修飾方法；
3、本發明中表面修飾TiO2納米孔層的鈦種植體在有效克服了“納米管”的容易脫層、且不具備良好的機械加工性能缺點的同時，創新性地制造特定尺度的納米孔陣列結構，在以其制作工藝簡單方便、成本低廉的優勢，成為很有應用前景的骨種植和骨內固定材料；
4、本發明的納米孔結構有利于骨髓基質細胞的粘附和增殖，并且可以誘導骨髓基質干細胞向成骨細胞分化，具有較好的生物相容性，大大提高種植體和固定板和釘的生物性能；
5、本發明的納米孔陣列結構對成纖維細胞的粘附和增殖有抑制作用，可使種植體和固定板釘與軟組織接觸的界面中成纖維細胞比例下降，而膠原成分比例增高，而這種結締組織“屏障”結構可有效阻止上皮細胞及成纖維細胞向骨-種植體界面方向移動，從而有效提高骨整合的效力；
6、骨量不足時限制種植體應用的一個主要障礙，引導骨再生技術很大程度上解決這一難題，其核心是生物屏障膜對組織中成纖維細胞形成阻擋，而本發明中的納米孔形貌本身抑制成纖維細胞在其表面粘附和增殖，可形成“天然屏障”，將極大提高手術的成功率。


圖1 TiA納米管陣列(A為俯視圖，B為側視圖)。圖2腐蝕之后鈦片表面形貌(A為掃描電鏡形貌，B為原子力顯微鏡形貌)。圖 3 SEM觀察經處理后鈦表面結構(AX6, 000，B X 200, 000, CX 100, 000, DX40, 000) A 對照組正面觀(未處理純鈦表面)，B和C 處理組鈦片正面觀(TW2納米孔形成)，D 處理組鈦片側面觀(箭頭所示)。圖4鈦表面TW2納米孔的AFM圖像，A 處理組鈦片(TW2納米孔表面)，B 對照組 (未處理純鈦表面)。圖5鈦表面TW2納米孔層的XRD圖像。圖6材料表面純水的平衡接觸角。圖7激光共聚焦顯微鏡觀察BMSCs黏附情況，A 處理組鈦片(TW2納米孔表面)， 接種細胞4hr后；B 對照組，接種細胞4hr后；C 處理組鈦片(TiO2納米孔表面)，接種細胞 8hr后；D 對照組，接種細胞8hr后。圖8激光共聚焦顯微鏡觀察BMSCs增殖情況，A 處理組鈦(TW2納米孔表面)，接種細胞Mhr后；B 對照組，接種細胞Mhr后。圖9流式細胞儀檢測BMSCs細胞周期。圖 10 BMSC 單個細胞 SEM 圖像(X 3000)。圖11 SEM觀察BMSCs伸出偽足。圖 12 BMSCs 接種 8hr 的 SEM 圖像。圖13細胞通過羅丹明-鬼筆環肽染色細胞骨架的激光掃描共聚焦顯微鏡圖像。圖14激光共聚焦顯微鏡觀察NIH/3T3細胞黏附情況，A 處理組鈦(TW2納米孔表面)，接種細胞4hr后；B 對照組，接種細胞4hr后；C 處理組鈦(TiO2納米孔表面)，接種細胞8hr后；D 對照組，接種細胞8hr后。圖15 NIH/3T3培養4 hr和8 hr后黏附情況統計直方圖。圖16激光共聚焦顯微鏡觀察NIH/3T3細胞增殖情況，A 處理組鈦(TW2納米孔表面)，接種細胞Mhr后；B 對照組，接種細胞Mhr后。圖17 NIH/3T3培養Mhr后增殖情況統計直方圖。
圖18流式細胞儀檢測NIH/3T3細胞周期。圖19NIH/3T3單個細胞SEM圖像。圖20 SEM觀察NIH/3T3伸出偽足。圖 21 NIH/3T3 接種 8hr 的 SEM 圖像。圖22單個NIH/3T3細胞鋪展面積統計直方圖。圖23鈦表面不同孔徑納米孔對細胞粘附的影響，A: 10-15nm組；B :20_25nm組； C:30nm 組；D:50nm 組。
具體實施例方式下面結合附圖對本發明提供的具體實施方式
作詳細說明。本發明的目的是應用陽極氧化法和化學腐蝕技術在純鈦或鈦合金(以下統稱為鈦)表面制備TiO2納米孔陣列結構，通過體外實驗研究材料不同細胞的黏附、鋪展和增殖等生物學特性的影響，評價其生物相容性；為新型表面納米化鈦植入材料和骨內固定材料研制和應用提供理論基礎和實驗依據。實施例1 二氧化鈦納米孔的制備主要儀器與試劑
純度為99%的鈦片(Alfa Aesar公司，中國)，氟化銨(分析純，國藥集團化學試劑有限公司，中國)，DMEM培養基(Gibco，美國)，胎牛血清(FBS，Gibco，美國)，胰蛋白酶干粉(活性1 250，Sigma，美國)，EDTA (華美生物工程公司，中國)，可編程直流電源(IT6834，蘇州歐泰斯特電子有限公司，中國)，(恒溫磁力攪拌器(94-2，上海梅穎浦儀器儀表制造有限公司，中國)，低溫恒溫槽(DC-0506，上海衡平儀器儀表廠，中國)，鉬電極(天津艾達恒晟科技發展有限公司，中國)，激光掃描共聚焦顯微鏡(Leica TCS SP2，德國)，場發射掃描電子顯微鏡(Fei Sirion 200，Philip，荷蘭)，原子力顯微鏡(Bic^cope，Veeco公司，美國)，熒光封片劑(Invitrogen，美國)，Hoechst 33342 (Sigma，美國)，羅丹明一鬼筆環肽(Molecular Probes,美國)。一、制備二氧化鈦納米管陣列
1)高純度(99%)醫用鈦(15mmX20mmX0.25mm)，分別用丙酮、無水乙醇、去離子水(DI 水)各超聲清洗10-20分鐘，干燥后備用，部分用做空白對照組，部分用于后續的處理過程；
2)分別量取98ml乙二醇、2.5ml (2wt%)去離子水和0. 335g (0. 3wt%) NH4F配制電解液，緩慢攪拌5-15分鐘；
3)保持20°C恒溫，以鈦作為陽極，鉬電極為陰極，在20V電壓下陽極氧化100-110分
鐘；
4)將制得的材料樣品分別在無水乙醇和去離子水(DI水)中超聲清洗6-8分鐘，干燥備用即可。請參照附圖1，圖1為制得的TW2納米管陣列的掃描電鏡圖像，A為俯視圖，B為側視圖。制得的納米管管徑約為20-25nm，管長約為Ιμπι左右，深寬比約為20，并且管徑均勻，納米管陣列排列整齊，管壁光滑。二、二氧化鈦納米孔的制備
由于在加工運輸和材料種植的過程中，TiO2納米管層較脆弱，易受到損傷。因此，可以通過特定方法降低T^2納米管層的厚度，使其僅為管徑的一半左右(8-12nm)，既可在鈦片表面保有TW2納米管的特征，滿足細胞粘附的要求，又可避免TW2納米管層易受損傷易脫落的缺點。制備二氧化鈦納米孔陣列采用的方法是利用特定的腐蝕液，腐蝕掉大部分的納米管，僅保留其管底部分的特征。其過程如下
1)采用25%氨水(NH4OH),30%雙氧水(H2O2)及去離子水(DI水)按1 1 5的摩爾比配置腐蝕液；
2)將腐蝕液加熱到70°C，并保溫1至2分鐘；
3)將已生長完TW2納米管陣列的鈦材料放入腐蝕液內，腐蝕25-30分鐘；
4)把處理過的樣品取出，用流動的去離子水沖洗5分鐘后，浸泡到去離子水中，并每隔 1小時換水一次，重復三次。將處理后的醫用鈦片(處理組)和未處理的醫用鈦(對照組)分別清洗、干燥、真空蒸鍍金膜技術噴金后，行掃描電子顯微鏡觀察、攝像記錄。同時，應用原子力顯微鏡，對比觀察處理組與對照組材料的表面結構特征，對三維形貌特征進行分析。測試前試樣同樣需進行超聲清洗、干燥，使材料表面保持清潔。經過腐蝕液腐蝕后的樣品表面形貌如圖2所示，圖2是腐蝕之后鈦表面形貌(A為掃描電鏡形貌，B為原子力顯微鏡形貌)。如圖所示，材料表面的納米管陣列形貌已經完全消失了，留下的是納米管底部的形貌特征，呈現出一個個均勻的納米尺度的凹坑。經由掃描電鏡(Scanning Electronic Microscope, SEM)與原子力顯微鏡(Atomic Force Microscope, AFM)的表征，其深寬比約在0. 3-0. 45之間。需要說明的是，利用電化學陽極氧化法和化學腐蝕在鈦表面能制備出特定尺度和形貌的TW2納米孔層陣列結構。孔徑約為20-25nm，孔深度約為8-12nm，深寬比約為 0. 3-0. 45，納米結構分布均勻。實施例2鈦表面TW2納米孔的表征
鈦表面不同納米化修飾對細胞生物行為的影響由鈦表面生物材料與細胞間的相互作用決定，細胞與鈦植入材料間的相互作用僅僅發生于組織與鈦的界面上，所以鈦表面特征在這一相互作用中起了重要的作用。本實施例以99%鈦片為對照組，以表面經電化學陽極氧化法制備TiO2納米孔的鈦片為處理組，采用掃描電鏡、原子力顯微鏡、X射線衍射儀、材料表面接觸角測量儀對鈦表面T^2納米孔進行表征。1.處理組與對照組表面SEM圖
見圖3，掃描電鏡觀察結果顯示，正面觀，對照組純鈦表面光滑，無特定納米結構(圖 3A);處理組鈦表面呈現多孔結構，孔徑為20-25nm，分布均勻，鈦表面形成了一層TiO2納米孔結構(圖3B、C)。側面觀，處理組鈦片未見類似TW2納米管的層結構，納米孔層與基體無明顯界限(圖3D)。2.應用原子力顯微鏡觀察處理組和對照組表面特征
原子力顯微鏡觀察結果顯示，處理組鈦表面TW2納米孔制備后，鈦表面可見分布均勻的納米孔，孔周圍類似火山丘狀形貌，孔徑為20-25nm左右，孔深為孔徑的l/3，8-12nm，深寬比約為0. 3-0. 45，(圖4A)。對照組純鈦表面光滑，可見方向一致的拋光痕跡(圖4B)。3.鈦表面TiA納米孔的XRD分析圖5見處理組鈦表面TiA納米孔層的XRD圖譜中有多個顯著的衍射峰，表明TiA納米孔層陣列結構由銳鈦礦組成。4.材料表面接觸角測量
圖6為處理組與對照組試樣測量表面接觸角時的液滴鋪展圖。顯示了各個樣品表面上純水的平衡接觸角，對照組接觸角平均為88. 42士6. 52度，處理組接觸角平均為 56. 14士6. 48度，明顯小于對照組0° = 0. 0000)。表明鈦表面經陽極氧化后形成TW2納米孔結構后，親水性得到了明顯提高。5.討論
采用材料表面接觸角測量技術，對比研究處理組與對照組材料表面與純水的接觸角。 結果顯示，鈦表面形成TW2納米孔后，與純水的接觸角變小。這就說明，鈦表面TW2納米孔有較好的親水性，與血液的相容性好。實施例3鈦表面TW2納米孔對骨髓基質細胞黏附和增殖的影響一、材料與方法
1.豬骨髓基質細胞(BMSCs)的分離培養
選3個月齡健康雜交豬，雌雄不限。氯胺酮肌注誘導及靜脈推注戊巴比妥鈉復合麻醉，于髂骨處抽取骨髓血約4mL，置于不含血清的DMEM培養液中，混勻。2000r/min，離心 20min。棄上清液及漂浮的脂肪，保留界面層及血細胞層。加入含100mL/L胎牛血清的DMEM 培養液，接種于培養皿，于37°C、5%C02飽和濕度培養箱原代培養。5d后，全量換液，換掉未貼壁的血細胞。待細胞達到80%左右融合后，用含EDTA的胰酶消化，傳代培養，每隔3d 換液，取第2-4代細胞用于實驗。2.激光共聚焦顯微鏡檢測細胞黏附和細胞骨架蛋白
鈦片高溫高壓消毒滅菌后，置于6孔板中，接種細胞3 X IO5/孔，37°C、5%0)2條件下分別培養4、8J4h。分組取材料，用預溫的IXPBS洗3次，每次Imin ；羅丹明-鬼筆環肽 (1:100稀釋，激發光M3nm，紅色熒光)染色細胞骨架，濕盒中避光孵育10min，lXPBS洗3 次，每次5min。Hoechst 33342 (1:500稀釋，激發光395nm，藍色熒光)細胞染色，避光孵育10min，lXPBS洗3次，每次5min。滴加封片劑1滴、封片，激光共聚焦顯微鏡下觀察、拍照。隨機選擇3個不同視野，Image-pro plus 6.0軟件計數細胞，計算單個視野平均細胞數量。獨立實驗重復3次。3.鈦表面TW2納米孔對骨髓基質細胞周期的影響
主要儀器和材料流式細胞儀FACScalibur (Becton Dickinsan，美國);PI/RNase染色試劑(BD公司，美國)。DMEM + 10% FBS培養液、胰酶消化液和磷酸鹽緩沖液(PBS)。流式細胞儀檢測細胞周期(1)細胞制備取第二代豬骨髓基質細胞用0. 25%胰酶 +0. 01%EDTA消化，計數備用。(2)細胞接種于材料鈦片高溫高壓消毒滅菌后置于6孔板中， 接種細胞3 X IO5/孔，37°C，5%C02條件下培養24hr。分組取材料，收集細胞1 X 106/ml，預冷 PBS洗2次。(3)用PBS稀釋乙醇至70%濃度，加入lml，4°C過夜固定。(4) PBS洗1次，棄盡液相。(5)加入400 μ 1 PI/RNase Staining Buffer,避光孵育15min。(6)流式細胞儀檢測，使用488nm激發光，Cellquest軟件收細胞至10000個，ModFitLT軟件分析細胞周期。4.電子掃描顯微鏡觀察材料表面細胞鋪展和形態
鈦片高溫高壓消毒滅菌后，置于6孔板中，接種細胞5 X IO4個/mL。置于培養箱中培養他(培養條件37°C、5% CO2及100%濕度)。到達預定時間，鈦片上的細胞密度約30%。 取出鈦片，用PBS溶液清洗去除未黏附的細胞。4%戊二醛固定液固定鈦片上的細胞。用系列梯度乙醇(30 %、50 %、70 %、90 %、95 % )在室溫下分別脫水10 min,再用100 %乙醇在室溫下脫水10 min0采用六甲基二硅胺烷(圓此)干燥法進行干燥。首先用HMDS-乙醇溶液 (ν/ν :1:2、1:1、2:1)各浸泡10 min，再用純HMDS浸泡10 min。采用真空蒸鍍金膜技術，對納米化純鈦表面噴金，然后在電子掃描顯微鏡下觀察、攝像記錄。Image-proplus 6.0軟件分析單個細胞的平均鋪展面積。4.統計學處理
使用SAS 6. 12軟件包對數據進行t檢驗，P<0. 05為差異有顯著性。二、實驗結果
1.鈦表面TiO2納米孔對BMSCs黏附的影響
圖7顯示了 BMSCs在處理組和對照組鈦表面接種4h和他后的細胞黏附情況。隨機選擇3個不同視野，Image-pro plus 6.0軟件計數細胞。4h時2組鈦片上單個視野平均細胞數處理組為(60. 67士 1. 15)個，對照組為(50. 33士 1. 53)個；處理組鈦片上的細胞黏附數是對照組的1.21倍(丨=9.347沖=0.001)。8h時2組鈦片上單個視野平均細胞數處理組為(76. 33士 1. 53)個，對照組為(66. 67士0. 58)個；處理組鈦片上的細胞黏附數是對照組的1.15倍(t=0. 253，P=O. 001)。接種4h和他后，處理組鈦片的細胞黏附數均顯著大于對照組。2.鈦表面TW2納米孔對骨髓基質細胞增殖的影響
圖8顯示了骨髓基質細胞在處理組(TW2納米孔表面)和對照組(未處理純鈦表面)接種Mhr后的增殖情況，每個樣品至少拍照3個視野，采用統計分析軟件計數。骨髓基質細胞接種Mhr后，處理組鈦片表面的細胞數量大于對照組，是對照組的1. 27倍( =13. 5680， P= 0. 0002)。3.鈦表面T^2納米孔對骨髓基質細胞周期的影響
圖9顯示了流式細胞儀檢測骨髓基質細胞接種于處理組鈦片(11 納米孔)和對照組鈦片Mhr后細胞周期分析結果。處理組中，G0/G1期細胞百分率為71. 45%，S期細胞百分率為20. 22%，G2/M期細胞百分率為8. 33%。對照組中，G0/G1期細胞百分率為69. 88%，S期細胞百分率為20. 76%，G2/M期細胞百分率為9. 36%。細胞周期比例在兩組中沒有明顯統計學差異。4.骨髓基質細胞在T^2納米孔修飾鈦表面的生長形態
圖10-12顯示了電子掃描顯微鏡觀察BMSCs接種8hr后的細胞黏附、鋪展形態。處理組表面細胞呈扁平狀、多邊形鋪展(圖10)，向多個方向伸出細長、十分豐富的胞突(圖11)， 提示BMSCs與處理組材料表面納米結構結合牢固，不易脫落。對照組表面細胞多呈三角形、 梭形或圓形鋪展(圖10)，細胞胞突較少且粗短(圖11)。Image-pro plus 6.0軟件分析3個不同視野單個細胞的平均鋪展面積(圖12) 處理組為(203. 67士 11. 94)像素，對照組為(151. 00士5. 57)像素；處理組單個細胞平均鋪展面積顯著大于對照組，是對照組的1. 35倍(t=8. 421，P=O. 001)。5.激光共聚焦顯微鏡觀察骨髓基質細胞骨架蛋白
圖13顯示了骨髓基質細胞培養48hr后通過羅丹明-鬼筆環肽染色細胞骨架后的激光掃描共聚焦顯微鏡的圖像。處理組中，細胞骨架蛋白粗大，沿細胞長軸有規律的分布，鋪展面積較大，向遠處伸出胞突。在對照組中，細胞骨架蛋白細小，在細胞內分布為多方向，鋪展面積較小。具有TiA納米孔表面的鈦板能夠使骨髓基質細胞更好的黏附和增殖，細胞在材料表面鋪展面積較大，鋪展形態較好，說明TiO2納米孔表面修飾的純鈦材料與骨髓基質細胞具有較好的生物相容性，具備作為植入材料的特性要求。實施例4鈦表面T^2納米孔對成纖維細胞黏附、增殖和形態的影響
在實施例3中，檢測了鈦表面T^2納米孔對骨髓基質細胞的黏附、增殖以及形態的影響，證明該材料有利于骨髓基質細胞的黏附與生長。而成纖維細胞也是研究植入體材料與組織細胞之間相互作用的另一類常見的細胞，實施例4以成纖維細胞為研究對象，檢測鈦表面TW2納米孔對該類細胞的黏附、增殖以及形態的影響，從而獲得TiO2納米孔修飾的純鈦材料與細胞之間相互作用的更加全面的體外實驗結果。1.鈦表面TiA納米孔對成纖維細胞黏附的影響
圖14顯示了成纖維細胞NIH/3T3細胞在處理組(TiA納米孔表面)和對照組(未處理純鈦表面)接種4hr和Shr后的黏附情況，每個樣品至少拍照3個視野，采用統計分析軟件計數，根據統計結果繪制柱狀圖(圖15)。NIH/3T3細胞接種4hr時，處理組鈦片上的細胞黏附率與對照組沒有差異(i=2. 5000,/^=0. 0668)；而接種Shr時，處理組鈦片上黏附的細胞數量明顯少于對照組，對照組鈦片的細胞黏附率是處理組的3. 35倍(i=25. 8094,/^=0. 0000)。2.鈦表面TW2納米孔對成纖維細胞增殖的影響
圖16顯示了成纖維細胞NIH/3T3在處理組(TW2納米孔表面)和對照組(未處理純鈦表面)接種Mhr后的增殖情況，每個樣品至少拍照3個視野，采用統計分析軟件計數，根據統計結果繪制柱狀圖(圖17)。NIH/3T3細胞接種Mhr后，對照組鈦片表面的細胞數量明顯大于處理組，是處理組的5. 51倍( =74. 9533，P= 0. 0000)。3.鈦表面T^2納米孔對成纖維細胞周期的影響
圖18顯示了流式細胞儀檢測ΝΙΗ/3Τ3細胞接種于處理組鈦片(TW2納米孔)和對照組鈦片Mhr后細胞周期分析結果。處理組Gl期細胞比率為97. 57%，S期2. 43% ；而對照組Gl 期細胞比率為51. 71%，S期48. 29%0處理組鈦片對ΝΙΗ/3Τ3細胞產生了明顯抑制DNA合成作用，進而對細胞增殖產生了抑制作用。4.成纖維細胞在TiO2納米孔修飾鈦表面的生長形態
圖19-21顯示了掃描電子顯微鏡觀察OTH/3T3細胞接種8hr時的細胞黏附、鋪展形態。 處理組和對照組的細胞呈梭形、長三角形扁平狀鋪展(圖19)；對照組細胞偽足短且數量較少(圖20)。處理組細胞鋪展面積較大，軟件分析3個不同視野(圖21)，處理組單個細胞平均鋪展面積是對照組的1. 21倍(圖22) ( =3. 2375，/M). 0317)。本實施例通過以上實驗方法，檢測到成纖維細胞在TW2納米孔修飾的鈦表面黏附初期細胞鋪展較好，而接種細胞8hr后細胞的黏附和增殖產生明顯的抑制作用，說明鈦表面TW2納米孔結構與成纖維細胞的黏附結合不牢固，且不利于成纖維細胞的生長增殖。鈦表面TiA納米孔對成纖維細胞的作用與鈦表面TiA納米孔促進骨髓基質細胞黏附和增殖的作用相反，說明鈦表面TiA納米孔與骨髓基質細胞的相容性更好，骨髓基質細胞能夠先于成纖維細胞大量的黏附于材料表面，并且能夠更快地在材料表面增殖。成纖維細胞與骨髓基質細胞比較，其黏附及增殖都處于競爭劣勢，該材料應用于牙列缺損或頌骨缺損修復中，可形成牢固骨性結合，有望避免產生纖維包膜。本發明采用了電化學陽極氧化法和化學腐蝕技術對純鈦表面進行納米修飾，通過細胞體外培養和檢測手段評價其生物學性能，得出結論如下
1、本發明前期通過實驗研究了不同條件下制備的不同空間納米孔對細胞的粘附增殖等生物學行為的影響后，確定利用本發明中電化學陽極氧化法和化學腐蝕條件在鈦表面能制備出特定尺度和形貌的TiO2納米孔層陣列結構。孔徑為20-25nm，孔深度約為8-12nm， 納米結構分布均勻；
2、鈦表面形成的TW2納米孔層陣列結構親水性得到提高，有利于血液相容性的改
.、1· 口 ，
3、鈦表面T^2納米孔層陣列結構對骨髓基質細胞的黏附、鋪展和增殖起到促進作用；
4、TiO2納米孔層陣列結構對NIH/3T3成纖維細胞的黏附和增殖能產生顯著的抑制作用。5、電化學陽極氧化法結合化學腐蝕在鈦表面制備的T^2納米孔層陣列結構有良好的體外生物相容性，該實驗應用的技術是一種有應用前景的鈦表面納米結構修飾方法。本發明的優點在于
(1)在研究過程中，創新性的采用了陽極氧化法在純鈦片表面生長二氧化鈦納米管陣列，之后采用特定配比的腐蝕液對鈦片材料進行腐蝕，達到降低納米管的高度的目的，使之成為具有特定深寬比，排列均勻的納米孔陣列。實驗結果表明，對鈦片表面進行如上所述納米級修飾后，以骨髓基質細胞(BMSCs)作為研究對象，該納米孔形貌有利于骨髓基質細胞的粘附、增殖，并且可以誘導骨髓基質干細胞向成骨細胞分化，具有較好的生物相容性，大大提高種植體的性能，有望在臨床上得到進一步應用。(2)本實驗細胞生物學發現，本發明所使用方法制備的納米孔結構有利于骨髓基質細胞的粘附增殖，而不利于成纖維細胞的粘附增殖，可使種植體與軟組織接觸的界面中成纖維細胞比例下降，而膠原成分比例增高，而這種結締組織“屏障”結構可有效阻止上皮細胞及成纖維細胞向骨-種植體界面方向移動，從而保持種植體周圍軟組織的穩定，可以極大提高種植體成功率。骨量不足時限制種植體應用的一個主要障礙，引導骨再生技術很大程度上解決這一難題，其核心是生物屏障膜對組織中成纖維細胞形成阻擋，而本發明中的納米孔形貌本身抑制成纖維細胞在其表面粘附增殖，可形成“天然屏障”，將極大提高手術成功率
(3)具有TW2納米孔表面修飾的純鈦材料與BMSCs結合良好，且具有較好的生物相容性。利用電化學陽極氧化法結合特定腐蝕技術對鈦片表面進行納米級修飾，制備T^2納米孔的方法工藝簡單，操作方便，成本低廉，工藝流程短，是一種較有前景的種植材料表面形貌的修飾方法。(4)應用
為了進一步改善鈦等人體金屬植入物(如牙種植體、骨種植體、固定板、固定釘)的生物相容性，增強骨整合能力，滿足機體硬組織修復的嚴格要求，提高牙種植的成功率，常常對鈦或鈦合金進行表面改性。在鈦表面用陽極氧化法制備TW2納米管的方法已經有研究報道，有體外研究證明，采用電化學陽極氧化法在鈦表面制備特定尺度和形貌的TiO2納米管層，能夠不同程度地影響鈦植入體表面成骨細胞黏附、增殖與分化能力，但是鈦表面所形成納米管結構容易脫層，并且不具備良好的機械加工性能，本發明中表面修飾TW2納米孔層的鈦種植體在有效克服“納米管”的缺點的同時保留“納米孔”的納米結構，在以其制作工藝簡單方便、成本低廉的優勢，成為很有應用前景的種植體材料。實施例5
本課題組已在中國專利文獻CN101792923A公開了一種鈦片表面納米尺度粗糙化的方法，通過鈦片制備二氧化鈦納米管陣列，再腐蝕鈦片得到納米尺度粗糙化表面。該發明為前期實驗中對鈦片表面納米尺度粗糙化的方法，制備得到的表面二氧化鈦納米孔陣列的孔徑為50nm左右，深寬比約在0. 5到1之間。但并沒有對粗糙化的鈦片表面進行細胞生物學實驗，只提供了表面的掃描電鏡和原子力顯微鏡照片。然而，不同的電解時間及不同腐蝕時間將在鈦表面產生不同孔徑及孔深的納米孔形貌，而在后期實驗中對一系列不同孔徑鈦表面T^2納米孔進行了系統的細胞生物學相容性檢測，發現只有在本發明特定制備條件下產生的鈦表面T^2納米孔形貌有利于骨髓基質細胞的粘附增殖，而不利用成纖維細胞的粘附增殖，這種特性是骨內種植體在動物體內將有利于形成骨結合，避免纖維結合，大大提高種植體的性能，使其具有較好的生物相容性，可以廣泛應用于制備人體金屬植入物，如牙種植體、骨種植體、固定板、固定釘。因此根據專利CN101792923A公開的內容和公知常識，本領域的技術人員不可能顯而易見的得到本發明的技術方案。本課題組成員張梅等研究了鈦表面TiO2納米孔層陣列結構對骨髓基質細胞(bone marrow stromal cells, BMSCs)的黏附、鋪展形態等生物學特性的影響，采用電化學陽極氧化法和化學腐蝕技術，在純鈦表面制備出特定尺度和形貌的T^2納米孔層陣列結構， 以豬BMSCs為研究對象，應用激光共聚焦顯微鏡、掃描電子顯微鏡等技術檢測細胞黏附、 鋪展形態和骨架蛋白排列等生物學特性，證明陽極氧化法和化學腐蝕技術制備的鈦表面 TiO2納米孔層陣列結構對BMSCs的黏附、鋪展等生物學行為起到顯著的促進作用。(詳見張梅，等.鈦表面TiO2納米孔對骨髓基質細胞黏附和鋪展的影響[J].上海口腔醫學，2009，18(5) :493-498.)該文獻中公開了采用陽極氧化法和化學腐蝕技術制備鈦表面 TiO2納米孔層陣列結構，制備方法為“以鈦片作為陽極，鉬電極為陰極，在由乙二醇、去離子水和NH4F配制的電解液中，60V電壓陽極氧化池。然后將陽極氧化處理后的鈦片放入 50mL專用腐蝕液內，腐蝕20min;將得到的樣品沖洗干凈，浸泡在去離子水內，每隔Ih換水1次，重復3次”(參見該文獻第494頁右側第一段)。該文獻中雖然也是采用陽極氧化法和化學腐蝕技術兩步來制備鈦表面TW2納米孔層陣列結構，但是在陽極氧化法的步驟中，只公開了電解液的成分，電壓和陽極氧化時間，但沒有公開電解液中各成分的配比，而在陽極氧化法制備TW2納米管陣列的過程中，電解液的組成配比和性質對Ti的氧化和TW2的溶解有著重要作用，是決定TW2納米管形貌最主要的因素，不同的電解液的配方得到的納米管的長度、管壁厚度和粗糙程度都有很大差別；其次，該文獻中只提到了“將陽極氧化處理后的鈦片放入50mL專用腐蝕液內”，并沒有公開腐蝕液的成分、配比和具體的制備方法；另外，該文獻中公開的陽極氧化時間及腐蝕時間不同，導致產生的納米管長度及納米孔的孔寬及孔深不同，陽極氧化及腐蝕時間的差異是決定最終的TW2納米孔的結構特征的最關鍵因素。綜合以上幾點，根據該文獻公開的內容以及公知常識，本領域的技術人員不經過創造性的勞動，不可能顯而易見的得到本發明的技術方案。鈦表面不同孔徑及孔深納米孔結構對骨髓基質干細胞及成骨細胞生物學行為產生不同影響，經本課題組對一系列鈦表面不同孔徑納米孔刻蝕處理后進行檢測發現，本發明中說明的孔徑利于骨髓基質干細胞及成骨細胞明顯粘附優于本課題組先前處理所得 30nm 及 50nm 孔徑(圖 23)。以上所述僅是本發明的優選實施方式，應當指出，對于本技術領域的普通技術人員，在不脫離本發明方法的前提下，還可以做出若干改進和補充，這些改進和補充也應視為本發明的保護范圍。
權利要求
1.一種鈦表面刻蝕TiO2納米孔陣列結構在制備人體金屬植入物中的應用，其特征在于，所述的人體金屬植入物為牙種植體、骨種植體、固定板、固定釘，所述的結構是在純鈦或鈦合金表面制備得到的TiA納米孔陣列結構，所述的納米孔的孔徑為20-25nm，孔的深度為 8-12nm，深寬比約為0. 3-0. 45，納米孔結構分布均勻。
2.根據權利要求1所述的應用，其特征在于，所述結構的制備方法包括，應用陽極氧化法制備TW2納米管陣列和化學腐蝕技術制備TW2納米孔，所述的陽極氧化法制備TW2納米管陣列的步驟包括1)純鈦或鈦合金，分別用丙酮、無水乙醇、去離子水各超聲清洗10-20 分鐘，干燥后備用；2)分別量取98ml乙二醇、2. 5ml 2wt%的去離子水和0. 335g 0. 3wt% 的NH4F配制電解液，緩慢攪拌5-15分鐘；3)保持20°C恒溫，以鈦作為陽極，鉬電極為陰極， 在20V電壓下陽極氧化100-110分鐘；4)將制得的材料樣品分別在無水乙醇和去離子水中超聲清洗6-8分鐘，干燥備用即可。
3.根據權利要求2所述的應用，其特征在于，所述的化學腐蝕技術制備T^2納米孔的步驟包括1)采用25%氨水、30%雙氧水及去離子水按1:1:5的摩爾比配置腐蝕液；2)將腐蝕液加熱到70°C，并保溫1至2分鐘；3)將權利要求2制備的已生長完TW2納米管陣列的鈦材料放入腐蝕液內，腐蝕25-30分鐘；4)把處理過的樣品取出，用流動的去離子水沖洗5 分鐘后，去離子水中浸泡，每隔1小時換水一次，重復三次。
4.一種鈦表面刻蝕T^2納米孔陣列結構，其特征在于，所述的結構是在純鈦或鈦合金表面制備得到TiO2納米孔陣列結構，所述的納米孔的孔徑為20-25nm，孔深度為8-12nm，深寬比約為0. 3-0. 45，納米結構分布均勻。
5.根據權利要求4所述的結構，其特征在于，所述的結構的制備方法包括應用陽極氧化法制備TW2納米管陣列和化學腐蝕技術制備TW2納米孔，所述的陽極氧化法制備TW2 納米管陣列的步驟包括1)純鈦或鈦合金，分別用丙酮、無水乙醇、去離子水各超聲清洗 10-20分鐘，干燥后備用；2)分別量取98ml乙二醇、2. 5ml 2wt%的去離子水和0. 335g 0. 3wt%的NH4F配制電解液，緩慢攪拌5-15分鐘；3)保持20°C恒溫，以鈦作為陽極，鉬電極為陰極，在20V電壓下陽極氧化100-110分鐘；4)將制得的材料樣品分別在無水乙醇和去離子水中超聲清洗6-8分鐘，干燥備用即可。
6.根據權利要求5所述的結構，其特征在于，所述的化學腐蝕技術制備T^2納米孔的步驟包括1)采用25%氨水、30%雙氧水及去離子水按1:1:5的摩爾比配置腐蝕液；2)將腐蝕液加熱到70°C，并保溫1至2分鐘；3)將權利要求2制備的已生長好的TW2納米管陣列的鈦材料放入腐蝕液內，腐蝕25-30分鐘；4)把處理過的樣品取出，用流動的去離子水沖洗 5分鐘后，去離子水中浸泡，并每隔1小時換水一次，重復三次。
7.—種鈦表面刻蝕TiO2納米孔結構的制備方法，其特征在于，所述的結構的制備方法包括在純鈦或鈦合金表面應用陽極氧化法制備TW2納米管陣列和化學腐蝕技術制備TiO2 納米孔，所述的陽極氧化法制備TiO2納米管陣列的步驟包括1)純鈦或鈦合金，分別用丙酮、無水乙醇、去離子水各超聲清洗10-20分鐘，干燥后備用；2)分別量取98ml乙二醇、 2. 5ml 2wt%的去離子水和0. 335g 0. 3wt%的NH4F配制電解液，緩慢攪拌5_15分鐘；3)保持20°C恒溫，以鈦作為陽極，鉬電極為陰極，在20V電壓下陽極氧化100-110分鐘；4)將制得的材料樣品分別在無水乙醇和去離子水中超聲清洗6-8分鐘，干燥備用即可。
8.根據權利要求7所述的制備方法，其特征在于，所述的化學腐蝕技術制備T^2納米孔的步驟包括1)采用25%氨水、30%雙氧水及去離子水按1:1:5的摩爾比配置腐蝕液；2) 將腐蝕液加熱到70°C，并保溫1至2分鐘；3)將權利要求2制備的已生長好的TW2納米管陣列的鈦材料放入腐蝕液內，腐蝕25-30分鐘；4)把處理過的樣品取出，用流動的去離子水沖洗5分鐘后，去離子水中浸泡，并每隔1小時換水一次，重復三次。
全文摘要
本發明涉及一種純鈦及鈦合金(以下統稱為鈦)表面刻蝕TiO2納米孔陣列形貌在制備人體金屬植入物中的應用，所述的人體金屬植入物為牙種植體、骨種植體、固定板和固定釘，所述的形貌是在鈦表面制備得到TiO2納米孔陣列結構。本發明還提供這種形貌的優化制備方法。本發明優點在于可以在常溫、常壓條件進行；制備TiO2納米孔陣列規整有序，方法工藝相對簡單，操作方便，成本低廉，工藝流程短。本發明制備的鈦表面納米孔陣列結構對不同種類細胞具有“選擇性效應”，可極大提高種植體的成功率；本發明中的納米孔陣列結構本身可抑制成纖維細胞在其表面的粘附和增殖，將極大地提高骨、牙種植手術和骨內固定手術的成功率；本發明是一種非常有臨床應用前景的骨種植材料和骨固定材料表面形貌的修飾方法。
文檔編號A61L27/06GK102552977SQ20121001649
公開日2012年7月11日 申請日期2012年1月19日 優先權日2012年1月19日
發明者嚴明, 孫強, 張梅, 徐骎, 陳萬濤, 陳姍姍, 黃其煜 申請人:上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院