通過操作信使rna前體加工而提供的針對環境毒性的保護的制作方法

專利名稱：：通過操作信使rna前體加工而提供的針對環境毒性的保護的制作方法
技術領域：
：本發明涉及參與信使RNA前體加工的核酸和蛋白質用于在真核細胞和生物體中增強針對環境壓力(諸如無機鹽毒性)的耐受性的用途。
背景技術：
：對鋰和鈉毒性敏感的細胞靶的本質為我們呈現了關于真核細胞中離子穩態生理學的重要圖譜。這些靶的表征對于理解臨床問題諸如鋰對偶極紊亂治療的影響(Schou，1997,Arch.Gen.Psychiatry,54:9)或與高血壓有關的高鈉水平(Lifton,1996,Science,272676)是至關重要的。完全不同但也與離子穩態有關的另一個問題是耕地在大量灌溉后的漸進鹽化，為了在干旱地區發展足夠的農業，這使得培育耐鹽農作物成為迫切需要(Serrano,1996,Int.Rev.Cytol.，165:1；Yeo,1998,J.Exp.Bot.,49:915；Holmberg和Biilow,1998,TrendsPlantSci.,3:61)。除了離子運輸(Haro等人，1991,FEBSLett.,291:189;Gaxiola等人，1999,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,96:1480；Apse等X,1999,Science,285:1256)和滲壓劑合成(Tarczynski等人，1998,PlantJ.,16:155),操作對高離子濃度和水壓力最敏感的細胞系統提供了改進農作物鹽耐受性的候選途徑(Serrano,1996,Int.Rev.Cytol.,165:1；Tezara等人，1999,Nature,401:914)。遺傳和生化分析已經將酵母基因HAL2的產物鑒定為鹽毒性的重要生理靶(Glaser等人，1993,BIBOJ.，123105；Dichtl等人，1997,EMBOJ.，16:7184)。HAL2編碼3，，5，-二磷酸核苷酸酶,它對鋰和鈉的抑制非常敏感(Murguia等人，1995,Science,267:232)。Hal2p的鹽抑制導致有毒化合物3’-磷酸腺苷5’-磷酸(pAp)的胞內積累(Murguia等人，1996，J.Biol.Chem.,271:29029)，繼而抑制硫酸基團的還原和轉移反應，并抑制有些外切核糖核酸酶(Dichtl等人，1997，EMBOJ.，16:7184；GiI-MascarelI等人，1999，PlantJ.，17:373)。植物(Gil-Mascarell等人，1999，PlantJ.，17:373)和哺乳動物(L0pez_Coronado等人，1999，J.Biol.Chem.，27416043)中存在與HAL2同源的基因，盡管后者中所編碼的酶受到鋰但非鈉的抑制。Hal2p的野生型蛋白質和耐受鋰與鈉的突變形式的過度表達所賦予的鹽耐受性較為適中(Albert等人，2000，J.Mol.Biol.，295:927)。這說明還存在鹽毒性的其它靶，而且一旦克服了HAL2瓶頸，它們將成為限制性因素，但是尚不知道這些重要的鹽敏感過程。下面的兩項專利申請涉及滲透壓，但描述的保護機制與本發明描述的普遍機制不同ES2110918A(1998-02-16)涉及通過操作碳水化合物代謝而生成耐受性滲透壓的植物；ES2134155A1(1998-10-07)涉及通過在淡土植物中使用編碼具有過氧化物酶活性的蛋白質的基因而賦予對滲透、水、和鹽壓力的耐受性的方法。發明概述本發明隱含的技術問題是提供可用于為遭受由鹽、干旱、或寒冷和凍結壓力引起的壓力條件(像滲透壓)的細胞和生物體增強壓力耐受性的方法。本發明通過操作信使RNA加工而在細胞和生物體中提供了針對滲透壓的保護，從而解決了這個技術問題。本發明提供了能夠賦予異源宿主細胞或宿主生物體以針對壓力條件的耐受性的一套分離基因。這些基因都參與mRNA前體的加工(諸如合成、剪接、5’和3’末端修飾、運動、運輸至細胞質、代謝、等)，而且它們在分開轉化對鹽敏感的酵母突變體后都顯示抗鹽表型。由此，每種基因都能擔當壓力耐受性的有效增強劑，而無需其它因素的輔助。這套基因包括SR樣蛋白質、(核)RNA結合因子、核糖核蛋白復合物成分、轉錄因子和核移動蛋白，它們使得本領域熟練技術人員能夠在遺傳學上改變目的生物體，使之耐受性壓力處境，諸如滲透壓處境，更具體的說是無機鹽或Na+或Li+毒性。公開的每種基因都使得本領域熟練技術人員能夠通過將至少一種上述基因導入細胞來更改細胞命運和/或植物發育和/或生化和/或生理。對于例如農作物的栽培，它們中的許多對壓力條件像鹽、干旱、或寒冷敏感，本發明公開的基因提供了解決產量降低和經濟利益降低問題的可能性。本發明提供了通過操作信使RNA前體加工來解決由環境壓力引起的細胞毒性的方法，而且本發明的實施方案包括方法、核酸、多肽、載體、宿主細胞、和轉基因生物體像轉基因植物。發明詳述土壤鹽度是對植物農業而言最重要的非生物或環境壓力之一。除了普遍改進農作物鹽耐受性的實踐目的，鹽耐受性研究還是基礎植物生物學的一個重要部分。同樣，關于其它兩項主要的非生物壓力即干旱和寒冷的研究與鹽壓力工作有密切聯系。例如，受到鹽壓力調控的許多基因也響應干旱或寒冷壓力(ZhuJ.K.,1997,Molecularaspectsofosmoticstressinplants即植物中滲透壓的分子方面，CRCCrit.Rev.PlantSci.,16253-277)。因而，本領域熟練技術人員能夠推定的，當分離基因在轉染宿主生物體后賦予其以鹽耐受性時，它還能夠賦予針對寒冷和/或干旱壓力的耐受性。鹽、干旱、和寒冷被認為是滲透壓的三種最重要形式。為了在真核細胞中鑒定環境毒性的新靶，發明人表征了在酵母細胞中表達時賦予對無機鹽的耐受性增加的基因。因此，搜索了能夠通過在酵母細胞中過度表達而賦予鹽壓力耐受性的擬南芥(Arabidopsisthaliana)(Minet等人，1992,PlantJ.,2:417)和甜菜(Betavulgaris)cDNA文庫,其中通過向培養基中添加甲硫氨酸來避免pAp的積累及其毒性作用(G1ser等人，1993，EMBOJ.，12:3105；Dichtl等人，1997，EMBOJ.，16:7184；Murguia等人，1995,Science,267:232;Murguia等人，1996，J.Biol.Chem.,271:29029)。這種策略的結果就是產生了本發明。這是用于鑒定參與植物應答鹽壓力的基因和蛋白質的功能性方法。為此目的，如實施例I和實施例3所述構建了cDNA表達庫，并將感受態酵母菌株(見實施例2)用于篩選在過度表達時提高酵母鹽耐受性的cDNA。這些酵母菌株的生長通常在與削弱大多數農作物生長的NaCl或LiCl濃度相似的高濃度(150mM)下受到抑制。在用cDNA文庫轉化酵母細胞后，合并菌落，并對它們選擇存在150mMNaCl時的生長能力。實施例4進一步描述了這種篩選流程。增強鹽耐受性的擬南芥基因的分離篩選了大約7.5x10s個轉化體的擬南芥cDNA文庫，并分離得到能夠在酵母中賦予針對高鹽濃度的耐受性的3個獨立克隆(圖I)。令人驚訝的是，這3種cDNA編碼的蛋白質都參與信使RNA前體的加工。將這3種蛋白質稱為Ct-SRLl、RCYUPUlA0這些蛋白質中的兩種屬于所謂的“SR樣”或“富含交替精氨酸的”因子家族，其特征是包含具有高含量的Arg殘基與Ser、Asp、和/或Glu交替的結構域(RS結構域)(圖2)。該家族的成員參與組成性和/或旁路剪接，并且參與信使RNA的加工和代謝過程中不同步驟(轉錄、5’和3’末端修飾、和前mRNA剪接、將成熟RNA運輸至細胞質、等)的偶聯。具有SEQIDNO.3所列氨基酸序列的Ct-SRLl蛋白質是由本文鑒定為SEQIDNO.I的cDNA編碼的，它還發現于來自Pl克隆MNJ8(Genbank編號ABO17069)的擬南芥5號染色體的基因組區域。同樣，SEQIDNO.3的蛋白質序列也呈現于公開的數據庫，編號BAB09109，但是尚未指出該序列有任何功能。Ct-SRLl的cDNA不是全長的，它編碼推測的SR樣蛋白質(包含RS結構域)的羧基末端。它在酵母中的表達賦予針對鋰和鈉的耐受性(圖I)。第二個克隆編碼的推定的蛋白質具有與K型和T型細胞周期蛋白有關的N端細胞周期蛋白結構域和富含精氨酸的C端結構域(圖2A)。將這種SR樣蛋白質命名為RCY1，作為富含精氨酸的細胞周期蛋白I的變更。它在酵母中的表達賦予針對鋰和鈉的耐受性(圖I)。為了測定這種SR樣蛋白質中RS結構域在酵母中增強鹽耐受性的作用，分開克隆RCYl的細胞周期蛋白結構域和RS結構域，并轉化到酵母細胞中。在圖2A中通過標有下劃線的甲硫氨酸殘基標記了兩個結構域的分割，并將包含RS結構域的C端部分稱為SEQIDNO.21(圖5)。單獨的RS結構域的表達即賦予與全長蛋白質表達相同的表型(圖3)。這些結果證明，在“SR樣”因子的情況中，是RS結構域本身而非特定蛋白質的表達賦予針對鹽壓力的耐受性。本文將RCYl蛋白質的氨基酸組成呈現于SEQIDNO.4。本文將RCYl的cDNA鑒定為SEQIDNO.2，該序列還發現于來自克隆T9J22的擬南芥2號染色體序列的基因組區域。該基因組擬南芥克隆的核苷酸序列對應于RCYl基因的部分核苷酸序列，將它注解為推定的細胞周期蛋白(編號AAC14513.I)。來自公開數據庫的這一蛋白質預測缺乏RCYl蛋白質的前55個氨基酸。因此，將對應于氨基末端區域的RCYl蛋白質片段呈現于SEQIDNO.22。第三個擬南芥克隆編碼擬南芥的UlA蛋白質，它是Ul-snRNP的成分，后者是在前信使RNA內含子加工最初步驟之一中識別5’-剪接位點的核糖核蛋白復合物。擬南芥的UlA蛋白質先前被(Simpson等人，1995，EMBOJ.，14:4540-4550)描述為剪接體Ul-snRNP的特異成分。UlA在酵母中的表達賦予較弱的LiCl耐受性，且不賦予NaCl耐受性(圖I)。具有SEQIDNO.6所列氨基酸組成的UlA蛋白質是由本文鑒定為SEQIDNO.5的cDNA編碼的。可以在公開的數據庫中找到該蛋白質序列和核酸序列，編號分別是CAA90283.I和Z49991，而且具有充分的注解。上文所述序列呈現于圖5。在存在和缺乏甲硫氨酸時且在不同的遺傳背景中觀察上文所述表型。酵母中通過表達擬南芥克隆而得到的鹽耐受的性改進并非由于離子運輸的刺激，因為它與胞內鋰濃度的變化無關。這是如實施例5中所述測定的。同樣，該表型在液泡運輸缺陷的酵母菌株中得到維持。上述結果說明，可能是對另一細胞過程的作用引起了所觀察到的壓力耐受性。本發明人相信，信使RNA前體的加工可能是真核細胞中離子毒性的作用靶。這一觀點先前從未被描述過。與本文一致的是，發明人已經確認了前mRNA內含子加工在酵母中受到例如LiCl的存在的抑制。前mRNA體內剪接的兩項獨立測試支持本發明。首先，發明人測量了酵母細胞中由質粒合成的β_半乳糖苷酶的比活，該質粒包含由內含子人為中斷的大腸桿菌(Escherichiacoli)LacZ基因(實施例6)。在向培養基中添加LiCl時，他們檢測到這種酶的積累相對于由不含內含子的對照構建物生成的酶有降低。擬南芥SRLlRS結構域在這些酵母細胞中的同時表達部分阻斷所觀察到的抑制(未顯示數據)。這些結果已經得到了第二種測定法的確認，其中發明人如實施例7中所述通過RT-PCR技術直接測定了存在鋰時對剪接的抑制。證明了存在LiCl時內源酵母信使RNA前體例如對應于SARl基因的前mRNA的積累。因為普遍的剪接抑制將首先影響通常以較低效率得到加工的那些內含子的消除，所以發明人為這些實驗選擇了包含這種內含子的SARl前mRNA(Kao和Siliciano，1996，Mol.Cell.Biol.，16:960-967)。此外，通過將酵母細胞在鹽壓力條件下保溫，發明人觀察到SARl前mRNA的積累，和它是如何通過Ct-SRLl的同時共表達而得到部分逆轉的。發明人通過這種方法證明了存在鹽時前mRNA的加工抑制由上述擬南芥克隆之一(如Ct-SRLl)的表達而得到部分逆轉。本發明的普遍意義由過度表達Ct-SRLlcDNA的轉基因擬南芥植株的表型而得到確認。與該機制普遍特征一致的是，相同Ct-SRLlcDNA在CaMV35S啟動子控制下在擬南芥轉基因植株中的表達以與酵母中相似的方式增加它們對NaCl和LiCl的耐受性。例如，通過在含有對野生型對照種子有毒的LiCl濃度的瓊脂平板中使轉基因種子發芽，可以觀察到這種現象(圖4)。3個獨立的轉基因系能夠生長，顯示了本發明方法的效率。根據這些結果和根據分離擬南芥克隆的真正本質，可以推斷，不管具體機制如何，對信使RNA前體加工的任何刺激都能夠抵消鹽的毒性作用，而且針對鹽壓力的這種保護作用在所有真核細胞和生物體中是普遍的。本發明的普遍特征(即針對鹽壓力的保護作用不依賴物種)通過同樣賦予鹽耐受性且同樣涉及信使RNA前體加工的甜菜基因和真核基因的分離而得到了確認。增強鹽耐受性的甜菜基因的分離本發明的另一方面是篩選經NaCl誘導的甜菜葉片的cDNA文庫并隨后分離得到賦予酵母細胞以壓力耐受性的七種甜菜基因的流程。下面是用于鑒定參與植物應答鹽壓力的的甜菜基因和蛋白質的功能性方法。為此目的，如實施例I和實施例3中所述由甜菜葉片構建經NaCl誘導的cDNA表達文庫，并將對Na+敏感的酵母突變株JM26(見實施例2)用于篩選在過度表達后增加酵母鹽耐受性的甜菜cDNA。這種酵母突變體的生長通常在與削弱大多數農作物物種生長的NaCl濃度相似的濃度(150mM)下受到抑制。在用cDNA文庫轉化酵母細胞后，合并菌落，并對它們選擇存在150mMNaCl時的生長能力。實施例4進一步描述了這種篩選流程。進一步表征在高鹽濃度存活的六個陽性克隆，它們包含具有SEQIDNO.7、SEQIDNO.9、SEQIDNO.11、SEQIDNO.13、SEQIDNO.15、或SEQIDNO.17所示序列的基因。由這些基因編碼的相應蛋白質序列分別具有SEQIDNO.8、SEQIDNO.10、SEQIDNO.12、SEQIDNO.14、SEQIDNO.16、或SEQIDNO.18所列氨基酸組成。所有這些序列都呈現于圖5。令人驚訝的是，六個選定酵母克隆的每一個都受到所編碼蛋白質參與mRNA加工的基因的轉化一種蛋白質是推定的精氨酸-天冬氨酸RNA結合蛋白；兩種是推定的RNA結合蛋白；兩種是推定的轉錄因子；一種顯示與核運動蛋白有相似性。因此，正如關于本發明擬南芥基因所述且如上所述，這些蛋白質(及其編碼基因)適合作為通過操作前mRNA加工而發揮作用的壓力耐受性增強劑。因此，本發明涉及SEQIDNO.7所列新的分離甜菜核酸，它編碼推定的精氨酸-天冬氨酸RNA結合蛋白，且能夠在酵母細胞中增強鹽耐受性。自第51位核苷酸起始、至第1079位核苷酸終止的開放讀碼框編碼SEQIDNO.8所列氨基酸序列。該多肽與擬南芥推定的精氨酸-天冬氨酸RNA結合蛋白(瑞士PROT編號AAB68037)具有76%同一性和86%相似性。氨基酸比較是使用程序GAP進行的(符號比較表blosum62.cmp,CompCheck:6430,BL0SUM62氨基酸替代矩陣，參考文獻HenikoffS.和HenikoffJ.G.,1992,Aminoacidsubstitutionmatricesfromproteinblocks即來自蛋白質模塊的氨基酸替代矩陣，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:10915-10919)。該程序還用于比較下列紅甜菜多肽的氨基酸序列。本發明還涉及SEQIDNO.9所列新的分離紅甜菜核酸，它編碼推定的RNA結合蛋白，且能夠在酵母細胞中增強鹽耐受性。自第14位核苷酸起始、至第625位核苷酸終止的開放讀碼框編碼SEQIDNO.10所列氨基酸序列。該多肽與擬南芥推定的RNA結合蛋白(瑞士PROT編號AAG52616.I)具有68%同一性和78%相似性。本發明還涉及SEQIDNO.11(也稱為克隆或序列編號11)所列新的分離紅甜菜核酸，它編碼推定的轉錄因子，且能夠在酵母細胞中增強鹽耐受性。自第51位核苷酸起始、至第1119位核苷酸終止的開放讀碼框編碼SEQIDNO.12所列氨基酸序列。該多肽與菠菜(Spinaciaoleracea)核RNA結合蛋白(瑞士PROT編號AAF14145.I)具有81%同一性和86%相似性。SEQIDNO.11的第1-475位核苷酸發表于EST數據庫，編號BF011019，描述為甜菜發芽cDNA文庫的DNA片段，而且與推定的轉錄因子相似。本發明還涉及SEQIDNO.13所列新的分離紅甜菜核酸，它編碼推定的轉錄因子，且能夠在酵母細胞中增強鹽耐受性。自第51位核苷酸起始、至第1121位核苷酸終止的開放讀碼框編碼SEQIDNO.14所列氨基酸序列。該多肽與菠菜核RNA結合蛋白(瑞士PROT編號AAF14144.I)具有81%同一性和87%相似性。本發明還涉及SEQIDNO.15所列新的分離紅甜菜核酸，它編碼推定的RNA結合蛋白，且能夠在酵母細胞中增強鹽耐受性。自第2位核苷酸起始、至第970位核苷酸終止的開放讀碼框編碼SEQIDNO.16所列氨基酸序列。該多肽與稻(Oryzasativa)推定的RNA結合蛋白(瑞士PROT編號AAG59664.I)具有68%同一性和74%相似性。本發明還涉及SEQIDNO.17所列新的分離紅甜菜核酸，它編碼未知類型的蛋白質，且能夠在酵母細胞中增強鹽耐受性。自第35位核苷酸起始、至第922位核苷酸終止的開放讀碼框編碼SEQIDNO.18所列氨基酸序列。該多肽與與核運動蛋白相似的擬南芥蛋白質(瑞士PROT編號BAA97317.I)具有61%同一性和69%相似性。因此，本發明的一個優選實施方案涉及用于對生物體誘導壓力耐受性的方法，包括表達參與信使RNA前體加工的一種或多種甜菜基因。上文所述的篩選和選擇流程同樣可用于由植物以外的其它生物體選擇基因。作為范例，選擇了在酵母細胞中增強鹽耐受性的家鼠(Musmusculus)序列。如SEQIDNO.19所列的該序列編碼U2snRNP輔助因子蛋白質的推定的小亞基，且能夠在酵母細胞中增強鹽耐受性。自第37位核苷酸起始、至第969位核苷酸終止的開放讀碼框編碼SEQIDNO.20所列氨基酸序列。該多肽與擬南芥U2snRNP輔助因子小亞基(瑞士PROT編號BAB10638.I)具有78%同一性和84%相似性。該序列呈現于圖5。該結果例示了哺乳動物基因也可用于本發明的方法。本發明的方法因而可普通應用于通過操作信使RNA前體而賦予宿主細胞或生物體以壓力耐受性。如上所述選擇的有些酵母克隆的令人驚訝的強烈表型及在分離位置中和在異源背景中這些基因擔當壓力耐受性增強劑的事實使得這些基因成為非常有吸引力的工具，可用于在任何目的生物體中誘導壓力耐受性而無需輔助化合物。這些基因在如本文所述分離和轉染的酵母細胞中增強滲透壓(特別是無機鹽壓力，諸如Na+和Li+)耐受性的能力清楚證明了它們將它們自身的滲透壓耐受性賦予任何異源宿主生物體的潛力。或者，本發明的每一種壓力耐受性基因都可彼此聯合，以改變細胞命運或植物形態、植物發育、植物生化、或植物生理。依照第一個實施方案，本發明涉及在細胞和生物體中增強壓力耐受性的方法，包括操作信使RNA前體的加工過程。依照一個優選實施方案，所述壓力可以是環境壓力，諸如但不限于滲透壓、鹽壓力、干旱壓力、寒冷壓力、或凍結壓力。依照一個優選實施方案，本發明的方法涉及增強細胞和生物體的鹽耐受性。本發明的另一個實施方案涉及保護細胞和生物體免于鹽毒性的損害的方法，包括操作信使RNA(mRNA)前體的加工過程。依照一個實施方案，操作信使RNA前體加工過程的一種方式是對參與或干預信使RNA前體加工過程或mRNA前體加工途徑之一的至少一種分子進行遺傳或生化操作。術語“細胞”指任何原核或真核細胞。術語“生物體”指任何原核或真核起源的單細胞或多細胞生物體。本發明清楚描述的幾種基因和蛋白質屬于可用于增強壓力耐受性的不同基因和蛋白質類型。本發明的這些基因和蛋白質已經顯示了對mRNA加工過程有一定影響。因此，依照還有一個優選實施方案，本發明涉及任何上述方法，其中包括對具有Arg-Ser>Arg-GlujPArg-Asp二肽高含量結構域(RS結構域)的蛋白質、RNA結合蛋白、Ul-snRNP或U2-snRNP復合物成分、轉錄因子、或核運動蛋白進行遺傳或生化操作。本發明還涉及包含SEQIDNO.I所示核酸序列即編碼SEQIDNO.3所列氨基酸序列的分離核酸、或包含如SEQIDNO.2所示即編碼SEQIDNO.4所列氨基酸序列的核酸、或編碼包含SEQIDNO.22所示氨基酸序列的多肽的核酸用于至少一種上述方法的用途。SEQIDNO.I和2與編碼SR樣蛋白質的基因共享實質性同源性。本發明還涉及用于任何上述方法的包含SEQIDNO.5所示核酸序列即編碼SEQIDNO.6所列氨基酸序列的分離核酸。SEQIDNO.5與編碼Il-snRNP或U2_snRP復合物的成分的基因共享實質性同源性。本發明還涉及用于任何上述方法的包含SEQIDNO.7、9、11、13、15、17、或19任一項所示核酸序列即編碼SEQIDNO.8、10、12、14、16、18、或20任一項所列氨基酸序列的分離核酸。SEQIDNO.7、9、13、和15與編碼RNA結合蛋白的基因共享實質性同源性。SEQIDNO.19與編碼Il-snRNP或U2-snRP復合物的成分的基因共享實質性同源性。SEQIDNO.11和17與編碼轉錄因子的基因共享實質性同源性。本發明還涉及選自下組且編碼蛋白質或其免疫學活性和/或功能性片段的分離核酸(a)包含SEQIDNO.1、2、5、7、9、11、13、15、17、或19任一項所示DNA序列或其互補序列的核酸；(b)包含對應于(a)中SEQIDNO.1、2、5、7、9、11、13、15、17、或19任一項的RNA序列或其互補序列的核酸；(C)與(a)或(b)中定義的核苷酸序列特異雜交的核酸；(d)所編碼的多肽或蛋白質具有與SEQIDNO.3、4、6、8、10、12、14、16、18、20、或21所示多肽至少50%、優選至少60%、70%、或80%、更優選至少85%或90%、最優選95%同一的氨基酸序列的核酸；(e)所編碼的多肽或蛋白質具有SEQIDNO.3、4、6、8、10、12、14、16、18、20、21、或22所示氨基酸序列的核酸；(f)由于SEQIDNO.1、2、5、7、9、11、13、15、17、或19任一項所示或(a)-(e)中定義的核酸的核苷酸序列遺傳密碼而具有簡并性的核酸；(g)由于生物體之間編碼SEQIDNO.3、4、6、8、10、12、14、16、18、20、或21任一項所示多肽或蛋白質或(a)-(e)中定義的核苷酸序列的密碼子使用率差異而具有分歧的核酸；(h)由于編碼SEQIDNO.3、4、6、8、10、12、14、16、18、20、或21任一項所示多肽或蛋白質或(a)-(e)中定義的等位基因的差異而具有分歧的核酸；(i)編碼由SEQIDNO.1、2、5、7、9、11、13、15、17、或19任一項所示或(a)-(e)中定義的DNA序列編碼的多肽或蛋白質的免疫學活性和/或功能性片段的核酸；(j)編碼SEQIDNO.3、4、6、8、10、12、14、16、18、20、或21中定義的蛋白質或多肽或(a)-(i)中定義的核酸，且特征為所述序列是DNA、cDNA、基因組DNA、或合成DNA。應當理解，本發明還涉及用于任何上述方法的(a)-(j)中定義的任何核酸。本發明還涉及特異擴增本發明核酸之一(優選(a)-(j)中定義的那些核酸)或與之特異雜交的長度為至少15個核苷酸的核酸分子。本發明還涉及包含本發明核酸的載體，其中所述載體優選表達載體，其中核酸可操作連接能夠在原核和/或真核宿主細胞中表達所述序列的一種或多種控制序列。因此，本發明還涉及包含本發明核酸或載體的宿主細胞。所述宿主細胞可以選自細菌、昆蟲、真菌、酵母、植物、或動物細胞。依照還有一個實施方案，本發明涉及編碼包含上文所述“RS結構域”的蛋白質的天然或合成核酸用于本文所述任何方法的用途。本發明還涉及編碼在真核細胞中參與信使RNA前體加工過程的蛋白質的天然或合成核酸在本發明任何方法中的用途。本發明還涉及與本文所述至少一種序列具有至少50%同一性的核酸在用于增強壓力耐受性的方法中的用途，所述方法包括操作mRNA前體加工的過程或途徑。優選的是，所述核酸源自真核細胞或生物體。本發明還包括對應于至少一種本發明核酸的反義分子及其在本發明任何方法中的用途。依照還有一個實施方案，本發明涉及可以由至少一種本發明核酸編碼的多肽、或其同系物或衍生物、或其免疫學活性和/或功能性片段，所述多肽可以是天然的、合成的、富集的、分離的、不含細胞的、和/或重組的。這些多肽的每一種都可用于本發明的任何方法。優選多肽是那些包含SEQIDNO.3、4、6、8、10、12、14、16、18、20、21、或22任一項所示氨基酸序列的多肽、或其同系物或衍生物、或其免疫學活性和/或功能性片段。本發明還涉及生成本發明多肽的方法，包括在允許表達多肽的條件下培養上文所述宿主細胞并由培養物回收生成的多肽。本發明還涉及用于生成轉基因植物、植物細胞、或植物組織的方法，包括將可表達形式或本發明載體中的本發明核酸導入所述植物、植物細胞、或植物組織。本發明還涉及用于生成改變的植物、植物細胞、或植物組織的方法，包括將本發明多肽直接導入所述植物的細胞、組織、或器官。本發明還涉及用于實現本發明多肽的表達的方法，包括將可操作連接一種或多種控制序列的本發明核酸或本發明載體穩定導入植物細胞的基因組。本發明還涉及用于生成轉基因植物的方法，還包括由所述植物細胞再生植株。本發明還涉及可以通過上述方法之一獲得的轉基因植物細胞，其中所述核酸穩定整合到所述植物細胞的基因組中。依照本發明，由于表達權利要求13的至少一種核酸或權利要求25或26的至少一種多肽或權利要求23的反義分子，可以生成耐受鹽壓力的轉基因植物。所述轉基因植物也是本發明的一部分，由于表達至少一種本發明核酸或反義分子或至少一種本發明多肽而顯示表型變化的轉基因植物也屬于本發明一部分。本發明還涉及本發明植物的任何可收獲部分，優選選自下組種子、葉、果實、莖干培養物、根狀莖、根、塊莖、和鱗莖。由本發明任何植物或植物部分衍生的后代同樣是本發明的一部分。依照另一個實施方案，本發明涉及用于在植物中增強壓力耐受性的方法，包括在所述植物的細胞、組織、或部分中表達本發明的至少一種核酸或至少一種多肽或反義分子。依照另一個實施方案，本發明涉及用于在植物中改變壓力耐受性的方法，包括在所述植物的細胞、組織、或部分中表達本發明的至少一種核酸或至少一種多肽或反義分子。應當清楚，上述方法中的壓力耐受性可以指由環境引起的任何壓力，諸如但不限于滲透壓、鹽壓力、干旱壓力、凍結壓力、或寒冷壓力。另外，本發明的任何方法、核酸、反義分子、或多肽都可用于提高產量、刺激植物生長(可以是該植物的任何部分，諸如根、葉、種子)(的方法)。本發明還涉及可以通過任何上述方法獲得的植物，用于在高鹽濃度的土壤上栽培，優選鹽含量超過ImM鹽離子的土壤。由于表達本發明的任何核酸和/或蛋白質而更加耐受鹽壓力的新的酵母菌株或其它單細胞真核生物同樣構成本發明的一部分。本發明還涉及體外細胞培養系統，它包括耐受鹽的、因表達至少一種核酸、載體、多肽、或權利要求23的反義分子而獲得的上文定義的動物、植物、或宿主細胞。本發明還涉及由本文所述方法衍生的對人的至少一種治療性應用。本發明還涉及特異識別本發明多肽或其特定表位的抗體。本發明還涉及診斷組合物，它包含本發明的至少一種核酸、載體、反義分子、多肽、或抗體。定義和實施方案的詳述專業定義“對某一過程的操作”在本文中指干預或調控該過程，優選增強、催化、改變、或變更該過程。這種干預可能對該過程的每一個步驟或每一種成分或每一種產物或每一種結果產生影響。這種干預還可能對該過程的效率、速率、或產量產生影響。“對某一過程的遺傳操作”在本文中指通過對該過程所涉及的遺傳序列(如核苷酸序列、RNA、DNA)的任何類型干預來操作某一過程。除了細胞的天然遺傳活性諸如不同核酸的復制、轉錄、翻譯、和加工，術語“對某一過程的遺傳操作”還包括分子生物學技術和遺傳工程技術。本領域熟練技術人員知道這些人工遺傳技術，例如克隆、轉化、重組、表達、過度表達、沉默、等。作為“對某一過程的遺傳操作”的范例，可以干預編碼參與信使RNA前體加工過程的蛋白質的遺傳序列。或者，可以干預直接參與信使RNA前體加工過程的RNA分子(諸如小核RNA)。在所述遺傳序列編碼蛋白質且該編碼序列的表達、構造、結構、或定位遭到改變的情況中，使用術語“對某一蛋白質的遺傳操作”。更具體的說，可以改變所述編碼序列的組成或表達，或者可以在進行該過程的宿主細胞中導入或刪除所述編碼序列。更具體的說，所述蛋白質可以是參與前mRNA加工的任何成分，諸如但不限于Ul-snRNP或U2_snRNP復合物成分、轉錄因子、RNA結合蛋白、或核運動蛋白。“對某一過程的生化操作”在本文中指通過使用干預所述過程的生化方法來操作所述過程。生化方法指使用對生物學過程有影響的任何物質(化學藥品、肽、和分子)。例如，可以在進行該過程的細胞中導入肽、蛋白質、或生化或化學物質以干預該過程。更具體的說，可以在細胞中直接導入由本發明基因衍生的蛋白質或肽以增強信使RNA前體的加工過程。在所述生化方法涉及使用蛋白質或肽的情況中或者在所述生化方法導致蛋白質修飾的情況中，使用術語“對某一蛋白質的生化加工”。“細胞”在本文中理解為它的廣義，包括每一種存活細胞，諸如原核和真核細胞。“信使RNA前體”在本文中指尚未成為成熟信使RNA(由其翻譯成多肽)的任何RNA分子，因為它的組成、結構、或定位還有待改變。“信使RNA前體的加工”在本文中指改變信使RNA前體的組成、結構、或定位的任何過程。這種加工在真核細胞中的范例是轉錄過程中信使RNA前體的合成、前體5’和/或3’端的修飾像聚腺苷酸化、前體中內含子的剪接像組成性或旁路剪接、前體的代謝或前體轉移至核膜、和成熟RNA運輸至細胞質等。前體DNA的這種加工或代謝的不同步驟的偶聯也是本說明書中所用術語“信使RNA前體的加工”的一部分。前體RNA的轉錄后加工包括核內分解切割、核外分解消化、和共價修飾的復雜途徑。各個加工步驟的一般次序在真核細胞中是相當保守的，但是根本的機制在很大程度上還不知道。前mRNA加工是重要的細胞活性，而且已經在酵母細胞釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)中進行了研究(Venema和Tollervey,1995,Yeast,11(16):1629-1650)。加工步驟包括多種蛋白質-蛋白質相互作用及蛋白質-RNA和RNA-RNA相互作用。不同轉錄因子、RNA結合蛋白、其它核蛋白諸如核運動蛋白、和核RNA在前mRNA加工中的精確作用在很大程度上仍然還不知道。因此，干預信使RNA前體加工過程的蛋白質可能是許多不同類型的蛋白質。前mRNA的核運輸所涉及的幾種因子可用于本發明的方法，因為它們參與前mRNA的加工。前mRNA主要是由位于染色質結構域與染色質間區域之間介面的基因轉錄得到的。部分或完全加工并與核蛋白復合后，轉錄本離開它們的合成位點，并經由染色質間區運動至核孔，在那里，它們被輸出機器捕獲并輸出至細胞質。能夠運輸的mRNA復合了正確的核蛋白補體(回顧見Plitz和Pderson,2000,J.Struct.Biol.，129(2-3):252-257)。Ul-snRNP和U2_snRNP的作用主要在于前mRNA的剪接。Ul小核核糖核蛋白顆粒或復合物Ul-snRNP70K(U1_70K)基因的產物(一種Ul-snRNP特異蛋白質)，涉及動物及植物中前mRNA的基本及旁路剪接(Golovkin和Reddy，1996，PlantCell,8:1421-1435)在其它報告中描述了U1-70K蛋白質的不同相互作用蛋白質，諸如SC35樣蛋白質和富含絲氨酸/精氨酸的蛋白質(Golovkin和Reddy,1999，J.Biol.Chem.,245(51):36428-36438)。已經描述了U2小核核糖核蛋白輔助因子諸如U2A(Domon等人，1998，J.Biol.Chem.,273(51):34603-34610)。本發明的范圍涵蓋參與信使RNA前體剪接的任何蛋白質。已經描述了小核RNA在植物的前mRNA加工中的作用(Brown和Shaw，PlantCell,1998,10:649-657)。因此，還可以通過干預RNA分子來建立對前mRNA加工過程的操作。Jarrous等人，1999，J.CellBiol.,146(3):559-572顯示在細胞核中可找到Rpp29和Rpp38(人RNA酶P的蛋白質亞基)，而且它們位于卷曲體中，卷曲體是參與前體mRNA加工所需要的其它幾種小核核糖核蛋白的生物發生的細胞器。這些類型的蛋白質是參與前mRNA加工的核糖核蛋白核糖核酸酶復合物的一部分，因而也可用于本發明的方法。本領域尚未精確確定核運動蛋白的作用。仍有許多參與信使RNA前體加工的分子有待闡明。Blencowe等人，1999,77(4):277-291:TheprocessingofmessengerRNAprecursors(pre-mRNA)tomRNArequiresalargenumberofproteinsthatcontainsdomainsrichinalternatingarginineandserineresidues(RSdomains)(信使RNA前體(前mRNA)變成mRNA的加工需要包含富含交替精氨酸和絲氨酸殘基的結構域(RS結構域)的大量蛋白質)描述了本文所用的“SR樣蛋白質”。它們包括剪接因子SR家族的成員和在結構上和在功能上與SR家族截然不同的蛋白質，下文共同稱為SR相關蛋白質。兩組RS結構域蛋白質都在組成性和受控前mRNA剪接中發揮功能。最近，鑒定了幾種SR相關蛋白質與mRNA3’端形成有關且參與輸出。Blencowe等人，1999，77(4):277-291進一步回顧了包含RS結構域的蛋白質可能在前mRNA合成和加工的不同步驟的協調中發揮基礎作用的證據。通用定義術語蛋白質”、“肽”、“寡肽”、或“多肽”在用于本文時指任何長度的聚合形式的氨基酸。所述術語還包括已知的氨基酸修飾，諸如形成二硫鍵、半胱氨酸化、氧化、谷胱甘肽化、甲基化、乙酰化、法尼基化、生物素化、硬脂酰化、甲酰化、添加硫辛酸、磷酸化、硫酸化、遍在蛋白化、豆蘧酰化、棕櫚酰化、香葉基香葉基化、環化(如形成焦谷氨酸)、氧化、脫酰胺作用、脫水、糖基化(如戊糖、己糖胺、N-乙酰己糖胺、脫氧己糖、己糖、唾液酸、等)、酰化、和放射性標記(如125I、131I、35S、14C、32P、33P、3H)及非天然存在的氨基酸殘基、L-氨基酸殘基和D-氨基酸殘基。本發明蛋白質的“同系物”指那些相對于所述蛋白質而言包含氨基酸替代、刪除、和/或添加的肽、寡肽、多肽、蛋白質、和酶，即相對于所述蛋白質而言，它們是未曾改變它的一項或多項功能特性、特別是未曾降低所生成活性的同系物。例如，所述蛋白質的同系物將包括所述蛋白質的生物活性氨基酸序列變體。為了生成這種同系物，可以用具有相似特性(例如疏水性、親水性、疏水矩、抗原性、形成或打斷α-螺旋結構或β_折疊結構的傾向、等等)的其它氨基酸替代所述蛋白質中存在的氨基酸。本發明蛋白質的替代性變體指那些其中消除了所述蛋白質氨基酸序列中的至少一個殘基并在該位置插入了不同殘基的變體。氨基酸替代通常指單個殘基，但是根據對多肽的功能性約束可以成簇；插入通常是1-10個氨基酸殘基的數量級，刪除的范圍是大約1-20個殘基。優選的是，氨基酸替代將包括保守氨基酸替代，諸如上文所述。本發明蛋白質的插入性變體指那些其中在所述蛋白質的預定位點導入了一個或多個氨基酸殘基的變體。插入可以包括一個或多個氨基酸的氨基末端和/或羧基末端融合及序列內插入。一般而言，氨基酸序列內插入將小于氨基或羧基末端融合，數量級是大約1-10個殘基。氨基或羧基末端融合蛋白質或肽的范例包括用于酵母雙雜交系統的轉錄激活劑的結合結構域或激活結構域、噬菌體外殼蛋白、His6標簽、谷胱甘肽S-轉移酶、蛋白Α、麥芽糖結合蛋白、二氫葉酸還原酶、Tag·100表位(EETARFQPGYRS)、c_myc表位(EQKLISEEDL)、FLAG表位(DYKDDDK)、IacZ、CMP(鈣調蛋白結合肽)、HA表位(YPYDVPDYA)、蛋白C表位(EDQVDPRLIDGK)、和VSV表位(YTDIEMNRLGK)。本發明蛋白質的刪除性變體的特征是由所述蛋白質的氨基酸序列消除了一個或多個氨基酸。使用本領域眾所周知的肽合成技術(諸如固相肽合成法等)或重組DNA操作，可以容易的生成本發明蛋白質的氨基酸變體。用于生成蛋白質變體(表示為替代性、插入性、或刪除性變體)的DNA序列操作在本領域是眾所周知的。例如，用于在具有已知序列的DNA中預定位點生成替代性突變的技術對于本領域熟練技術人員而言是眾所周知的，諸如M13誘變、T7_Gen體外誘變試劑盒(USB,Cleveland,OH)、QuickChangeSiteDirectedmutagenesiskit即快速改變定點誘變試劑盒(Stratagene,SanDiego,CA)、由PCR介導的定點誘變、或其它定點誘變方案。用于生成蛋白質變體(表示為替代性、插入性、或刪除性變體)的DNA序列操作的另一種候選方案包括靶向體內基因修飾，這可以如先前所述(Palmgren,1997；Yoon等人，1996)通過嵌合RNA/DNA寡核苷酸來實現。本發明蛋白質的“衍生物”指那些包含所述多肽的至少大約五個連續氨基酸殘基但保留所述蛋白質的生物學活性的肽、寡肽、多肽、蛋白質、和酶。相對于所述多肽的天然存在形式的氨基酸序列而言，“衍生物”還可以額外包含天然存在的、不同糖基化的、酰化的、或非天然存在的氨基酸殘基。或者/另外，相對于所述多肽的天然存在形式的氨基酸序列而言，衍生物還可以包含一個或多個非氨基酸替代基，例如共價或非共價結合在氨基酸序列上的報告分子或其它配體，諸如結合在氨基酸序列上以便于其檢測的報告分子。“免疫學活性”指受到抗體的識別即與之結合的分子或其特定片段諸如表位或半抗原。本發明的內容還包括任何本發明多肽的同系物、衍生物、和/或免疫學活性片段。“抗體”包括單克隆、多克隆、合成、或重鏈抗體，以及抗體片段諸如Fab、Fv、或SCFv片段。可以通過先前所述(Liddle和Cryer，1991)技術來制備單克隆抗體，包括融合小鼠骨髓瘤細胞與衍生自免疫動物的脾細胞。術語“抗體”還包括它們的衍生物，諸如標記抗體。抗體標記包括堿性磷酸酶、？1012、？1(!126、？腿67、熒光素(FITC)、Hoechst33258、R-藻紅蛋白(PE)、羅丹明(TRITC)、QuantumRed、德克薩斯紅、Cy3、生物素、瓊脂糖、過氧化物酶、金球、和放射性標記(如125I、131I、35S、14C、32P、33P、3H)。依賴針對蛋白質的抗體的分子生物學工具包括蛋白質凝膠印跡分析、能夠鑒定基因的表達文庫篩選、蛋白質定量法包括ELISA和RIA、蛋白質的免疫親和純化、蛋白質的免疫沉淀(Magyar等人，1997)、和免疫定位。抗體(尤其是肽抗體)的其它用途包括研究蛋白水解加工(Loffler等人，1994;Woulfe等人，1994)、測定蛋白質活性位點(Lerner,1982)、研究前體和翻譯后加工(Baron和Baltimore,1982；Lerner等人，1981；Semler等人，1982)、鑒定蛋白質參與蛋白質_蛋白質相互作用的結構域(Murakami等人，1992)、和研究基因表達中的外顯子使用(Tamura等人，1991)。本發明的范圍還包括識別上文定義的本發明蛋白質或其同系物、衍生物、或片段的抗體。術語“基因”、“多核苷酸”、“核酸序列”、“核苷酸序列”、“DNA序列”、或“核酸分子”在用于本文時指任何長度的聚合形式的核苷酸(核糖核苷酸或脫氧核糖核苷酸或二者組合)。所述術語還包括雙鏈和單鏈DNA和RNA。所述術語還包括已知的核苷酸修飾，諸如甲基化、環化和“加帽”、和用類似物諸如次黃苷替代一個或多個天然存在的核苷酸。所述術語還涵蓋肽核酸(PNA)，這是一種DNA類似物，其中主鏈是由N-(2-氨乙基)-甘氨酸單位而非糖構成的假肽。PNA模擬DNA的性質，且結合互補核酸鏈。PNA的中性主鏈導致比通常更強的結合和更強的特異性。另外，已經將PNA的獨特的化學、物理、和生物學特性用于生成有力的生物分子工具、反義和反基因試劑、分子探針、和生物傳感器。“重組DNA分子”或“嵌合基因”指通過連接來自不同來源的DNA片段而生成的雜種DNA。“異源核酸序列”指與啟動子序列并非天然相關的序列。盡管該核苷酸序列對于啟動子序列而言是異源的，然而它對于植物宿主而言可能是同源的、天然的、異源的、或外源的。“有義鏈”指雙鏈DNA分子中與其mRNA轉錄本同源的那條鏈。“反義鏈”包含與有義鏈”序列互補的倒置序列。“編碼序列”或“開放讀碼框”或“0RF”定義為在置于適當調控序列的控制下時即當所述編碼序列或ORF以可表達形式存在時能夠轉錄成mRNA和/或翻譯成多肽的核苷酸序列。所述編碼序列或ORF以5’翻譯起始密碼子和3’翻譯終止密碼子為界。編碼序列或ORF可以包括但不限于RNA、mRNA、cDNA、重組核苷酸序列、合成制造的核苷酸序列、或基因組DNA。所述編碼序列或ORF可以用于預性核酸序列中斷。基本上編碼相同蛋白質但由不同來源分離的基因和編碼序列可以由充分不同的核酸序列構成。相反，充分不同的核酸序列可以設計用于實現本質上相同蛋白質的表達。所述核酸序列是例如指定基因存在的不同等位基因或遺傳密碼的簡并性或密碼子使用率的差異的結果。因而，氨基酸諸如甲硫氨酸和色氨酸是一種密碼子編碼，而其它氨基酸諸如精氨酸、亮氨酸、和絲氨酸每一種都能夠由多達六種不同密碼子翻譯而成。下文為根癌農桿菌(Agrobateriumtumefaciens)(細菌)、擬南芥、紫苜猜(Medicagosativa)(兩種雙子葉植物)、和稻(單子葉植物)例示了優選密碼子使用率的差異。這些范例摘錄自http://www.kazusa.or.jp/codon。作為一個范例,密碼子GGC(甘氨酸)是根癌農桿菌中最頻繁使用的密碼子(36.2%。)，是稻中第二個最頻繁使用的密碼子，但是在擬南芥和紫苜蓿的使用率則低得多(分別是9%。和8.4%。)。在編碼甘氨酸的四種可能密碼子中(見表2)，所述GGC密碼子在根癌農桿菌和稻中是最優選使用的。然而，在擬南芥中是GGA(和GGU)密碼子，在紫苜蓿中是GGU(和GGA)密碼子。等位基因變體還定義為包含單核苷酸多態性(SNP)及小插入/刪除多態性(INDEL;INDEL的大小通常小于IOObp)。SNP和INDEL在大多數生物體的天然發生多態性菌株中形成最大一套序列變體。它們有助于基因作圖和基因及基因功能的發現。它們還有助于鑒定參與決定性過程諸如生長速率、植株大小和植株產量、植株活力、疾病抵抗力、壓力耐受性、等的遺傳基因座(如植物基因)。現在有許多技術可用于鑒定SNP和/或INDEL，包括(I)PCR及隨后的變性高效液相層析(DHPLC;如Cho等人，1999)；(2)恒定變性劑毛細管電泳(CDCE)聯合高保真PCR(如Li-Sucholeiki等人，1999)；(3)變性梯度凝膠電泳(如Fischer和Lerman,1983)；(4)矩陣輔助激光解吸/離子化飛行時間質譜(MALDI-TOFMS;如Ross等人，2000)；(5)實時熒光監控PCR測定法(如Tapp等人，2000);(6)Acrydite凝膠技術(如Kenney等人，1998)；(7)循環雙脫氧指紋(CddF;如Langemeier等人，1994)；(8)單鏈構象多態性(SSCP)分析(如Vidal-Puig和Moller,1994);和(9)小型測序引物延伸反應(如Syvanen,1999)。上文(I)的變體“基因組中靶向誘導局部損傷”(TILLING;McCallum等人，2000a;McCallum等人，2000b)技術也可用于在例如經化學誘變后顯示有趣表型的植株個體中快速鑒定改變后的基因。“雜交”指充分同源的互補核苷酸序列彼此退火的過程。雜交過程可以完全發生于溶液中，即兩種互補核酸都處于溶液中。依賴這種過程的分子生物學工具包括聚合酶鏈式反應(PCR以及以此為基礎的所有方法)、扣除雜交、隨機引物延伸、核酸酶SI作圖、引物延伸、逆轉錄、cDNA合成、RNA差異顯示、和DNA序列測定。雜交過程還可以發生于互補核酸之一固定在基質諸如磁珠、Sepharose即瓊脂糖珠、或任何其它樹脂上的情況。依賴這種過程的分子生物學工具包括poly(A+)mRNA的分離。雜交過程還可以發生于互補核酸之一固定在固相支持物諸如硝酸纖維素或尼龍膜上或者通過例如光刻法固定在例如硅質玻璃支持物上的情況(后者稱為核酸陣列或微陣或者稱為核酸芯片)。依賴這種過程的分子生物學工具包括RNA和DNA凝膠印跡分析、菌落雜交、噬斑雜交、原位雜交、和微陣雜交。為了能夠進行雜交，通常通過熱或化學方法使核酸分子變性，從而使雙鏈熔解成兩條單鏈和/或由單鏈核酸消除發夾或其它二級結構。雜交嚴謹度受到諸如溫度、鹽濃度、和雜交緩沖液組成等條件的影響。高嚴謹度的雜交條件包括高溫和/或低鹽濃度(鹽包括NaCl和Na3-檸檬酸)和/或在雜交緩沖液中包含甲酰胺和/或降低雜交緩沖液中諸如SDS(去污劑)等化合物的濃度和/或由雜交緩沖液中排除諸如硫酸葡聚糖或聚乙二醇(促進分子擁擠)等化合物。例如Samtoook等人，1989描述了常規雜交條件，但是熟練技術人員將領會可以根據已知或預期同源性和/或核酸序列的長度設計許多不同的雜交條件。特異雜交指嚴謹條件下的雜交。足夠低的嚴謹雜交條件對于分離上文定義的DNA序列的異源核酸是特別優選的。產生所述異源性的要素包括上文討論的等位性、遺傳密碼簡并性、和優選密碼子使用率的差異。因此，本發明的范圍還涉及編碼上文定義的本發明多肽及其同系物、衍生物、和/或免疫學片段的本發明DNA序列在任何雜交方法中的用途。本發明還涉及與所述本發明DNA序列發生雜交的DNA序列。“特異擴增”在本文中指選擇性且只擴增具有特定堿基對組成的核酸序列的擴增方法(如聚合酶鏈式反應)。本發明定義的DNA序列可以由間插序列中斷。“間插序列”指中斷包含所述本發明DNA序列的編碼序列或中斷包含所述本發明DNA序列的DNA序列可表達形式的任何核酸序列。消除間插序列能夠恢復所述編碼序列或所述可表達形式。間插序列的范例包括內含子、可轉移DNA序列諸如轉座子、和DNA標簽諸如T-DNA。“可轉移DNA序列”指可以因重組事件而轉移的任何DNA序列。為了實現蛋白質在細胞、組織、或器官(優選植物起源)中的表達，可以將蛋白質直接導入所述細胞，諸如通過顯微注射或彈果手段，或者可以可表達形式將編碼所述蛋白質的分離核酸分子導入所述細胞、組織、或器官。優選的是，本發明的DNA序列包含編碼上文定義的本發明蛋白質或其同系物或衍生物或其免疫學活性片段的編碼序列或開放讀碼框(ORF)。本發明的優選蛋白質包含SEQIDNO.3、4、6、8、10、12、14、16、8、20、和21所示氨基酸序列。“載體”或“載體序列”指可以通過轉化導入生物體且可以在所述生物體中穩定維持的DNA序列。在例如大腸桿菌、根癌農桿菌、釀酒酵母、或粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)的培養物中維持載體是可能的。可以在細菌和/或病毒中維持和擴增其它載體諸如噬菌粒和粘粒載體。載體序列通常包含由限制酶識別的一套獨特位點即多克隆位點(MCS)，其中可以插入一種或多種非載體序列。“非載體序列”因此指整合到載體所含MCS的一個或多個位點中的DNA序列。“表達載體”是一小群載體，其由于包含能夠使插入的非載體序列成為可表達形式的適當調控序列，因而能夠表達由所述非載體序列編碼的蛋白質。本領域知道表達載體能夠在生物體包括細菌(如大腸桿菌)、真菌(如釀酒酵母、粟酒裂殖酵母、巴斯德畢赤酵母(Pichiapastoris))、昆蟲細胞(如桿狀病毒表達載體)、動物細胞(如COS或CHO細胞)、和植物細胞(如基于馬鈴薯病毒X的表達載體，參閱例如Vance等人，1998，W09844097)中表達蛋白質。有關典型的植物表達載體也可參閱本說明書。本發明清楚包括包含非載體DNA序列的任何載體或表達載體，所述非載體DNA序列包含依照本發明的核苷酸序列或編碼上文定義的本發明的蛋白質或其同系物、衍生物、和/或免疫學活性片段。作為在生物學系統中由表達載體介導的蛋白質生成的候選方案，可以應用蛋白質化學合成。可以液相或固相合成肽。然而，固相肽合成法(Merrifield,1963)是最常用的方法，它涉及連續添加氨基酸而形成線性肽鏈。“可表達形式”或“在表達控制序列的控制之下”指分離核酸分子處于適合于轉錄成mRNA和/或翻譯成蛋白質的形式，其或是組成性的或是在受到胞內或胞外信號(諸如環境刺激或壓力(促分裂原、缺氧、低氧、溫度、鹽、光、脫水、等)或化學化合物諸如IPTG(異丙基-β-D-硫代半乳糖苷)或諸如抗生素(四環素、氨芐青霉素、利福平、卡那霉素)、激素(如赤霉素、生長素、細胞分裂素、糖皮質激素、油菜素類固醇、乙烯、脫落酸、等)、激素類似物(碘乙酸(IAA)、2，4_D、等)、金屬(鋅、銅、鐵、等)、或地塞米松、等)的誘導之后發生轉錄和/或翻譯。正如本領域技術人員將知道的，功能性蛋白質的表達可能還需要一種或多種翻譯后修飾，諸如糖基化、磷酸化、去磷酸化、或一種或多種蛋白質-蛋白質相互作用、等。術語可表達形式”的范圍包括所有這些過程。優選的是，通過在所述細胞、組織、或器官中導入并表達編碼所述蛋白質的分離核酸分子(諸如cDNA分子、基因組基因、合成寡核苷酸分子、mRNA分子、或開放讀碼框)來實現所述蛋白質在特定細胞、組織、或器官(優選植物起源)中的表達，其中所述核酸分子可操作連接合適的調控序列，包括啟動子(優選植物可表達啟動子)和終止子序列。“調控序列”指實現其所連接編碼序列的表達所必需的控制DNA序列。這種控制序列的本質隨宿主生物體而不同。在原核生物中,控制序列通常包含啟動子、核糖體結合位點、和終止子。在真核生物中，控制細胞通常包含啟動子、終止子、和增強子或沉默子。本發明的范圍還包括本發明中定義的與任何調控序列融合的核苷酸序列。術語“控制序列”意欲在最低限度上包含表達所必需的所有成分，而且還可以包含額外的有利成分和決定何時、如何、和何處表達特定基因的成分。“啟動子”在本文中采用它的廣義，包括由經典真核基因組基因衍生的轉錄調控序列，它包含精確轉錄起始所需要的TATA盒，連同或不含CCAAT盒序列和應答發育和/或外部刺激或以組織特異方式改變基因表達的額外調控元件(即上游激活序列、增強子、和沉默子)。術語“啟動子”還包括經典原核基因的轉錄調控序列，在這種情況中，它可以包含-35盒序列和/或-10盒轉錄調控序列。術語“啟動子”還用于描述在細胞、組織、或器官中賦予、激活、或增強核酸分子表達的合成或融合分子或衍生物。啟動子可以包含一種或多種特定調控元件的額外拷貝，以進一步增強它可操作連接的核酸分子的表達和/或改變其空間表達和/或時間表達。可以將這種調控元件鄰接異源啟動子序列，以應答例如銅、糖皮質激素、地塞米松、四環素、赤霉素、cAMP、脫落酸、生長素、損傷、乙烯、茉莉酮酸酯、或唾液酸而驅動核酸分子的表達，或者將核酸分子的表達賦予特定細胞、組織、或器官諸如分生組織、葉、根、胚、花、種子、或果實。在本發明的內容中，啟動子優選植物可表達啟動子序列。然而，本發明也不排除在非植物細胞(諸如細菌、酵母細胞、昆蟲細胞、和動物細胞)中也發揮功能或只在非植物細胞中發揮功能的啟動子。“植物可表達的”指啟動子序列(包括添加或包含的任何額外調控元件)至少能夠在植物細胞、組織、或器官(優選單子葉或雙子葉植物細胞、組織、或器官)中誘導、賦予、激活、或增強表達。術語“植物可操作的”或“在植物中可操作的”在本文中用于啟動子序列時應當理解為與植物可表達啟動子序列等同。在本文中，“受控啟動子”或“可調控啟動子序列”指任選在特定條件下，能夠在植物的特定細胞、組織、或器官或一組細胞、組織、或器官中賦予結構基因的表達，然而并不是在所有條件下在整個植株中通常都賦予表達的啟動子。因此，可調控啟動子序列可以是在一套特定條件下(諸如在通過化學化合物或其它引發劑誘導基因表達后)在植株內特定部位或者在整個植株中賦予其可操作連接的基因以表達的啟動子序列。優選的是，用于進行本發明的可調控啟動子在植株內特定部位賦予表達(或是組成性的或是在誘導后)，但不是在任何環境中在整個植株中都賦予表達。這種啟動子的范圍包括細胞特異啟動子序列、組織特異啟動子序列、器官特異啟動子序列、細胞周期特異基因啟動子序列、可誘導啟動子序列、和經修飾后在特定植物部分中在任一時間賦予表達的組成性啟動子序列，諸如通過可轉座遺傳因子(AC、DS、Spm、En、或其它轉座子)內所述組成性啟動子的整合。本領域熟練技術人員將知道，“可誘導啟動子”指其轉錄活性應答發育、化學、環境、或物理刺激而得到提高或誘導的啟動子。本發明的范圍包括與壓力可誘導啟動子融合的、權利要求書中定義的核苷酸序列。相似的，熟練技術人員將理解，“組成性啟動子”指在生物體(優選植物)的大多數但不必所有部分中、在大多數但不必所有生長和發育階段有轉錄活性的啟動子。相反，術語“遍在啟動子”指在生物體(優選植物)的大多數但不必所有部分中有轉錄活性的啟動子。本領域熟練技術人員將能夠容易的由可公開獲得或可容易獲得的來源選擇適當的啟動子序列用于調控上文所述本發明蛋白質的適當表達，而無需過度的實驗。將核酸分子置于啟動子序列的調控控制之下或可操作連接啟動子序列指將放置所述核酸分子使得表達受到啟動子序列的控制。啟動子通常但不必位于其所調控核酸分子的上游或位于5’端、且距離轉錄起始位點2kb以內。在構建異源啟動子/結構基因組合時，通常優選啟動子與基因轉錄位點的距離與啟動子同它在天然環境下控制的基因(即衍生該啟動子的基因)的距離大致相同。“表達”指在細胞自身或無細胞系統中生成蛋白質或核苷酸序列。它包括由編碼所述產物的DNA轉錄成RNA產物、轉錄后修飾、和/或翻譯成蛋白質產物或多肽，以及可能的翻譯后修飾。“可操作連接”指并列，其中所述成分的相互關系使它們能夠以預定方式發揮功能。與編碼序列“可操作連接”的控制序列的連接方式能夠在與控制序列相容的條件下實現編碼序列的表達。在控制序列是啟動子的情況中，熟練技術人員清楚優選使用雙鏈核酸。術語“終止子”指位于轉錄單位末端、發出轉錄終止信號的DNA序列。終止子是包含有助于向初級轉錄本3’端添加聚腺苷酸序列的聚腺苷酸化信號的3’非翻譯DNA序列。本領域知道且描述了在衍生自病毒、酵母、霉菌、細菌、昆蟲、鳥、哺乳動物、和植物衍生的細胞中有活性的終止子。可以由細菌、真菌、病毒、動物、和/或植物分離這些終止子。特別適用于本發明基因構建物的終止子的范例包括根癌農桿菌胭脂堿合酶(NOS)基因終止子、根癌農桿菌章魚堿合酶(OCS)基因終止子序列、花椰菜花葉病毒(CaMV)35S基因終止子序列、稻ADP-葡萄糖焦磷酸化酶終止子序列(t3’Bt2)、玉蜀黍玉米醇溶蛋白基因終止子序列、rbcs-A基因終止子、和rbcs-3A基因終止子序列、等。本領域熟練技術人員將知道可能適用于進行本發明的合適啟動子序列和終止子序列。可以容易的使用這些序列而無需任何過多實驗。改變基因表達可以是下調表達。本發明的內容關注參與信使RNA前體加工過程的一些蛋白質的表達下調。當所述蛋白質是信使RNA加工的負調控劑時，這能夠導致例如對信使RNA加工和壓力耐受性的有益影響。“表達下調”在用于本文時指降低基因表達的水平和/或活性基因產物的水平和/或基因產物活性的水平。可以通過例如以相對于啟動子序列的有義取向(若導致共遏制)或反義取向添加編碼序列或其部分，而且可通過例如插入誘變(如T-DNA插入或轉座子插入)或通過基因沉默策略(Angell和Baulcombe，1988，W09836083；Lowe等人，1989，W09853083；Lederer等人，1999，W09915682;或Wang等人，1999，W09953050)來實現表達下降。以沉默基因表達為目標的遺傳構建物可以相對于啟動子序列的有義和/或反義取向包含所述基因(或其一個或多個部分)的核苷酸序列。用于下調基因表達的另一種方法包括使用核酶(Atikins等人，1999，W09400012；Lenee等人，1995，W09503404；Lutziger等人，2000，W00000619；Prinsen等人，1997，W09713865;和Scott等人，1997，W09738116)。可以通過將細胞、組織、器官、或生物體施用或暴露于所述基因產物或其同系物、類似物、衍生物、和/或免疫學活性片段來實現調控(包括降低)活性基因產物或基因產物活性的水平。免疫調控是能夠下調活性基因產物和/或基因產物活性水平的技術的另一個范例，包括在其中所述基因產物和/或基因產物活性水平有待調控的細胞、組織、器官、或生物體中施用、暴露、或表達針對所述基因產物的抗體。這些抗體包括“plantibodies”、單鏈抗體、IgG抗體、和重鏈camelantibodies及其片段。本發明的范圍還包括識別本發明蛋白質且可用于所述免疫調控的抗體。還可以通過將細胞、組織、器官、或生物體施用或暴露于所述基因產物或其活性的抑制劑或激活劑來實現調控(包括降低)活性基因產物或基因產物活性的水平。這種抑制劑或激活劑包括依照本發明鑒定的蛋白質(包括例如蛋白酶和激酶)和化學化合物。“細胞命運和/或植物發育和/或植物形態和/或生化和/或生理”指植物的一項或多項發育和/或形態和/或生化和/或生理特征因屬于本文所述發明的一個或多個步驟的執行而受到改變。“細胞命運”指在植物發育或其細胞過程中，特別是在細胞周期過程中或作為細胞周期過程的后果而生成的特定細胞的細胞類型或細胞特征。“植物發育”或術語“植物發育特征”或相似術語在用于本文時應當理解為指植物中參與確定植物細胞(特別是祖細胞將發育而成的特定組織或器官類型)的發育命運的任何細胞過程。與植物發育有關的細胞過程對于本領域熟練技術人員而言是知道的。這些過程包括例如形態發生、光形態發生、苗發育、根發育、營養發育、生殖發育、莖干延長、開花，及參與確定細胞命運的調控機制，特別是參與細胞周期的過程或調控過程。“植物形態”或術語“植物形態特征”或相似術語在用于本文時將由本領域熟練技術人員理解為指植物的外觀，包括任何一項或多項結構特征或其組合。這種結構特征包括植物的任何細胞、組織、或器官、或成組細胞、組織、或器官(包括根、莖干、葉、苗、葉柄、毛狀體、花、花瓣、柱頭、花柱、雄蕊、花粉、胚珠、種子、胚、胚乳、種皮、糊粉、纖維、果實、形成層、木材、心材、薄壁組織、通氣組織、篩分子、韌皮和維管組織、等)的形狀、大小、數目、位置、顏色、質地、排列、和圖案。“植物生化”或術語“植物生化特征”或相似術語在用于本文時將由本領域熟練技術人員理解為指植物的代謝和催化過程，包括初級和次級代謝及其產物，包括由植物生成的任何小分子、大分子、或化學化合物，諸如但不限于淀粉、糖、蛋白質、肽、酶、激素、生長因子、核酸分子、纖維素、半纖維素、胼胝質、凝集素、纖維、色素(諸如花青素)、維生素、礦質、微量營養物、或大量營養物。“植物生理學”或術語“植物生理學特征”或相似術語在用于本文時將理解為指植物的功能性過程，包括發育過程(諸如生長、擴大、和分化)、性發育、有性生殖、結子、種子發育、灌漿、無性生殖、細胞分裂、休眠、發芽、光適應、光合作用、葉片擴大、纖維生成、次級生長、或木材生成、等；植物對外部應用因子(諸如金屬、化學藥品、激素、生長因子、環境、和環境壓力因素(如缺氧、低氧、高溫、低溫、脫水、光、白晝長度、水淹、鹽、重金屬、等))的應答，包括植物對所述外部應用因子的適應性應答。術語“環境壓力”在本領域已經以不同方式進行了定義，而且與術語“滲透壓”大大交疊。例如Holmberg和Billow,1998,TrendsPlantSci.，3:61-66定義了導致非生物壓力的不同環境壓力因素。術語滲透壓在用于本文時指由鹽度、干旱、熱、寒冷、和凍結等條件誘導的壓力處境。術語“環境壓力”在用于本發明時指由非存活或非生物環境壓力生成的、作用于細胞、組織、種子、器官、或完整植株的代謝、生長、或生存力的任何不利影響。更具體的說，它還涵蓋諸如水壓力(水淹、水浸、干旱、脫水)、缺氧(低水平的氧、CO2、等)、氧壓力、滲透壓、鹽壓力、溫度壓力(熱、冷、凍結、霜凍)、營養物貧乏、污染物壓力(重金屬、有毒化學藥品)、臭氧、高光(highlight)、病原體(包括病毒、細菌、真菌、昆蟲、和線蟲)等環境因素及其組合。術語“缺氧壓力”指足以生成上文定義的壓力的任何氧水平下降，包括低氧和缺氧。術語“水淹壓力”指與將植物、植物部分、組織、或分離細胞長時間或短時間的淹沒在液體培養基中(諸如季風、多雨季節、山洪暴發、或過度灌溉等期間)有關或由其誘導的任何壓力。“寒冷壓力”和“熱壓力”分別指由低于或高于特定植物物種的最佳生長溫度范圍的溫度誘導的壓力。本領域熟練技術人員能夠容易的測定或知道這種最佳生長溫度范圍。“脫水壓力”指與細胞、組織、器官、或完整植株失水、膨脹度降低、或水含量降低有關或由其誘導的任何壓力。“干旱壓力”指由細胞、組織、器官、或生物體缺水或水供應降低誘導或與其有關的任何壓力。“氧化壓力”指升高反應性氧種類的胞內水平的任何壓力。術語“由鹽度誘導的壓力”、“鹽壓力”、或“鹽離子毒性”或無機鹽毒性或相似術語指與鹽濃度升高有關或由其誘導且導致細胞胞內或胞外環境的滲透勢微擾的任何壓力。在誘導所述鹽壓力的無機鹽中知道的最清楚的范例就是Na+和Li+。依照本發明的方法將多核苷酸和/或調控序列導入所述植物后獲得的轉基因植物獲得了針對相應野生型植株易感的環境壓力的抗性、耐受性、或增強的耐受性或抗性。術語“耐受性”和“抗性”覆蓋自遲滯至完全抑制由上文定義的環境壓力條件引起的細胞代謝改變、細胞生長降低、和/或細胞死亡的保護范圍。優選的是，依照本發明的方法獲得的轉基因植物耐受性或抵抗環境壓力條件，即所述植物能夠在相應野生型植株顯示生長、代謝、生存力、生產力降低、和/或雄性或雌性不育的環境條件下充分的正常生長。在用于本文時，“壓力耐受性”指在壓力下生長和生成生物量的能力、在壓力后再次起始生長和生成生物量的能力、和在壓力下存活的能力。術語“壓力耐受性”還覆蓋植物在壓力下完成與在非壓力條件下相似的發育程序的能力，如與在非壓力條件下相似，在壓力下由休眠轉向發芽和由營養轉向生殖階段。用于測定植物生長或壓力應答的方法學包括但不限于高度測量、葉片面積、植物水關系、開花能力、生成后代的能力、和產量，或本領域熟練技術人員知道的任何其它方法學。“生長”指植物或其部分生長并增加生物量的能力，而“產量”指植物或其部分(特別是那些有商業價值的部分)的可收獲生物量。“在壓力和非壓力條件下的生長和/或產量”指田間生長的植物幾乎總是將經歷一些形式的壓力(盡管輕微)的事實。因此，優選不區分非壓力與輕微壓力條件。由于預計本發明對生長和產量的某些有利影響在嚴重和輕微壓力條件下均會發生，因此將它們描述成在壓力和非壓力條件下增加生長和/或產量。用于將重組DNA導入植物組織或細胞的手段包括但不限于使用CaCl2的轉化及其變化形式，特別是先前所述方法(Hanahan,1983)、直接將DNA攝取到原生質體中(Krens等人，1982；Paszkowski等人，1984)、由PEG介導的攝取到原生質體中(Armstrong等人，1990)、微粒轟擊、電穿孔(Fromm等人，1985)、DNA顯微注射(Crossway等人，1986；Fromm等人，1985)、組織外植體或細胞的微粒轟擊(Christou等人，1988)、用核酸真空滲透組織、或(在植物的情況中)由T-DNA介導的由農桿菌轉移至植物組織(An等人，1985;Herrera-Estrella等人，1983a;Herrera_Estrella等人，1983b)。用于轉化單子葉植物的方法在本領域是眾所周知的，包括由農桿菌介導的轉化(Cheng等人，1997，W09748814；Hansen,1998，W09854961；Hiei等人，1994，W09400977；Hiei等人，1998，W09817813；Rikiishi等人，1999，W09904618；Saito等人，1995，W09506722)、微粒轟擊(Adams等人，1999，US5969213；Bowen等人，1998，US5736369；Chang等人，1994，W09413822；Lundquist等人，1999，US5874265/US5990390；Vasil和Vasil,1995，US5405765；ffalker等人，1999，US5955362)、DNA攝取(Eyal等人，1993，W09318168)、農桿菌細胞的顯微注射(vonHolt,1994，DE4309203)、和超聲處理(Finer等人，1997，US5693512)。依照本領域眾所周知的流程，可以由經轉化或轉染的細胞再生完整植株。可以用本發明的基因構建物轉化能夠隨后通過器官發生或胚胎發生而克隆繁殖的植物組織，并由此再生完整植株。選擇的特定組織將隨可用于或最適用于待轉化的特定物種的克隆繁殖系統而變化。例示性組織靶包括葉片、花粉、胚、子葉下、胚軸、雌配子體、愈傷組織、已有分生組織(如頂端分生組織、腋芽和根部分生組織)以及誘導的分生組織(如子葉分生組織和下胚軸分生組織)。優選的是，通過本領域公認的任何手段，諸如微粒轟擊、顯微注射、由農桿菌介導的轉化(包括“浸花”轉化法；Bechtold和Pelletier,1998;Trieu等人，2000)、原生質體融合、或電穿孔等，用負責生成蛋白質的遺傳序列轉染或轉化依照本發明方法生成的植物。最優選的是，所述植物是通過由農桿菌介導的轉化生成的。“二元轉化載體”指包含下列各項的T-DNA轉化載體包含在待轉化的真核細胞中有活性的至少一種目的基因和/或至少一種選擇標記的T-DNA區；和包含在大腸桿菌和農桿菌中有活性的至少一種復制起點和用于在大腸桿菌和農桿菌中進行選擇的標記基因的載體主鏈區。或者，二元轉化載體在農桿菌中的復制依賴分開的輔助質粒的存在。二元載體pGreen和輔助質粒pSoup構成諸如Hellens等人,2000中所述或因特網站點http://www.Pgreen,ac.uk上可獲得的系統的范例。二元轉化載體的T-DNA邊界可以衍生自章魚堿型或胭脂堿型Ti質粒或二者兼之。二元載體的T-DNA只有在聯合輔助質粒時才轉移到真核細胞中。本領域還知道用于有效植物共轉化的多種二元載體農桿菌菌株(Bidney和Scelonge，2000，W00018939)。“宿主”或“宿主細胞”或“宿主生物體”在本文中指能夠作為本發明序列的受體的任何原核或真核細胞或生物體。術語“宿主”在用于本文時包括可以進行遺傳工程改造的原核或真核生物體。這種宿主的范例參閱Maniatis等人，MolecularCloningALaboratoryManual即分子克隆實驗室手冊，冷泉港實驗室，冷泉港，紐約，1982。“植物細胞”包括衍生自任何植物且在培養過程以單細胞、細胞組、或愈傷組織存在的任何細胞。植物細胞還可以是培養中或天然生長中的發育中或成熟植物的任何細胞。“植物”包括屬于綠色植物(Viridiplantae)超家族的任何植物物種。本發明可應用于任何植物，特別是單子葉植物和雙子葉植物，包括選自下組的飼料豆科植物、觀賞植物、糧食作物、喬木、或灌木Acacisspp.(金合歡)、Acerspp.(槭)、Actinidiaspp.(稱猴桃)、Aesculusspp.(七葉樹)、Agathisaustralis(新西蘭貝殼杉)、Albiziaamara、Alsophilatricolor、Andropogonspp.(須芒草)、Arachisspp.(落花生)、Arecacatechu(模柳)、Asteliafragrans、Astragaluscicer、Baikiaeaplurijuga、Betulaspp.(禪木)、Brassicaspp.(蕓苔)、Bruguieragymnorrhiza(木攬)、Burkeaafricana、Buteafrondosa(紫鉚)、Cadabafarinose、Calliandraspp.(牛綴花)、Camelliasinensis(荼)、Cannaindica(美人蕉)、Capsicumspp.(辣椒)、Cassiaspp.(決明)、Centrosemapubescens(距辧豆)、Chaenomelesspp.(木瓜)、Cinnamomumcassia(肉桂)、Coffeaarabica(小果咖啡)、Colophospermummopane、Coronilliavaria、Cotoneasterserotina、Crataegusspp.(山植)、Cucumisspp.(舌甘瓜)、Cupressusspp.(柏木)、Cyatheadealbata、Cydoniaoblonga(媼梓)、Cryptomeriajaponica(日本柳杉)、Cymbopogonspp.(香茅)、Cyntheadealbata、Cydoniaoblonga、Dalbergiamonetaria、Davalliadivaricata、Desmodiumspp.(山蟲馬蟲黃)、Dicksoniasquarosa、Diheteropogonamplectens、Diocleaspp.、Dolichosspp.(扁顯)、Dorycniumrectum、Echinochloapyramidalis(稗)、Ehrartiaspp.(厚殼樹)、Eleusinecoracana(糝子)、Eragrestissspp.(幽眉草)、Erythrinaspp.(剌桐)、Eucalyptusspp.(按)、Eucleaschimperi、EulaliaviIIosa(金茅)、Fagopyrumspp.(養麥)、Feijoasellowiana(南美穩)、Fragariaspp.(草莓)、Flemingiaspp.(千斤拔)、Freycinetiabanksii(藤露覽樹)、Geraniumthunbergii(老鶴草)、Ginkgobiloba(銀杏)、Glycinejavanica、Gliricidiaspp.(墨西哥丁香)、Gossypiumhirsutum(陸地棉)、Grevilleaspp.(銀禪)、Guibourtiacoleosperma、Hedysarumspp.(巖黃蓍)、Hemarthriaaltissima(牛鞭草)、Heteropogoncontortus(黃茅)、HordeumvuIgare(大麥)、Hyparrheniarufa、Hypericumerectum(小連翅)、Hypertheliadissolute、Indigoincarnata(庭藤)、Irisspp.(鸞尾)、Leptarrhenapyrolifolia、Lespedezaspp.(古月枝子)、Lettucaspp.、Leucaenaleucocephala(銀合歡)、LoudetiasimplexΛLotonusbainesii、Lotusspp.(百脈根)、Macrotylomaaxillare、Malusspp.(蘋果)、Manihotesculenta(木薯)、Medicagosativa(紫苜猜)、Metasequoiaglyptostroboides(水杉)、Musasapientum(大蕉)、Nicotianumspp.(煙草)、Onobrychisspp.(馬戶豆)、Ornithopusspp.、Oryzaspp.(稻)、Peltophorumafricanum、Pennisetumspp.(狼尾草)、Perseagratissima(魚號梨)'Petuniaspp.(碧冬煎)、Phaseolusspp.(菜豆)、Phoenixcanariensis、Phormiumcookianum、Photiniaspp.(石楠)、Piceaglauca(白云杉)、Pinusspp.(松)、Pisumsativum(豌豆)、Podocarpustotara(新西蘭羅漢松)、Pogonarthriafleckii、Pogonarthriasquarrosa、Populusspp.(楊)、Prosopiscineraria(牧豆樹)、Pseudotsugamenziesii(花方萁松)、Pterolobiumstellatum、Pyruscommunis(西洋梨)、Quercusspp.(櫟)、Rhaphiolepsisumbellate(厚葉石斑木)、Rhopalostylissapida、Rhusnatalensis、Ribesgrossularia、Ribesspp.(荼薦子)、Robiniapseudoacacia(洋槐)、Rosaspp.(薔薇)、Rubusspp.(懸鉤子)、Salixspp.(柳)、Schyzachyriumsanguineum、Sciadopitysverticillata(金松)、Sequoiasempervirens(北美紅杉)、Sequoiadendrongiganteum(巨杉)、SorghumbicolorλSpinaciaspp.(菠菜)、Sporobolusfimbriatus、Stiburusalopecuroides、Stylosanthoshumilis、Tadehagispp.(葫蘆荼)、Taxodiumdistichum(落習習松)、Themedatriandra(黃背草)、Trifoliumspp.(車軸草)、Triticumspp.(小麥)、Tsugaheterophylla(異葉鐵杉)、Vacciniumspp.(烏飯樹)、Viciaspp.(蠶豆)、Vitisvinifera(葡萄)、Watsoniapyramidata、Zantedeschiaaethiopica(馬蹄蓮)、Zeamays(玉蜀黍)、莧菜、朝鮮薊、蘆筍、嫩莖花椰菜、抱子甘藍、甘藍、canola、胡蘿卜、花椰菜、芹菜、羽衣甘藍、亞麻、散葉甘藍、小扁豆、油籽、油菜、秋葵、洋蔥、馬鈴薯、稻、大豆、稻草、甜菜、甘蔗、向日葵、番茄、南瓜、和荼等，或上文具體提及的任何植物的種子，或任何上述物種的組織、細胞、或器官培養物。本發明可應用于任何植物，特別是單子葉植物和雙子葉植物，包括選自下組的飼料豆科植物、觀賞植物、糧食作物、喬木、或灌木:Acacisspp.(金合歡)、Acerspp.(械)、Actinidiaspp.(稱猴桃)、Aesculusspp.(七葉樹)、Agathisaustralis(新西蘭貝殼杉)、Albiziaamara、Alsophilatricolor、Andropogonspp.(須芒草)、Arachisspp.(落花生)、Arecacatechu(模榔)、Asteliafragrans、Astragaluscicer、Baikiaeaplurijuga、Betulaspp.(禪木)、Brassicaspp.(蕓苔)、Bruguieragymnorrhiza(木攬)、Burkeaafricana、Buteafrondosa(紫鉚)、Cadabafarinose、Calliandraspp.(牛綴花)、Camelliasinensis(荼)、Cannaindica(美人蕉)、Capsicumspp.(辣椒)、Cassiaspp.(決明)、Centrosemapubescens(距辧豆)、Chaenomelesspp.(木瓜)、Cinnamomumcassia(肉桂)、Coffeaarabica(小果咖啡)、Colophospermummopane、Coronilliavaria、Cotoneasterserotina、Crataegusspp.(山植)、Cucumisspp.(舌甘瓜)、Cupressusspp.(桕木)、Cyatheadealbata、Cydoniaoblonga(媼梓)、Cryptomeriajaponica(日本柳杉)、Cymbopogonspp.(香茅)、Cyntheadealbata、Cydoniaoblonga、Dalbergiamonetaria、Davalliadivaricata、Desmodiumspp.(山蟲馬蟲黃)、Dicksoniasquarosa、Diheteropogonamplectens、Diocleaspp.、Dolichosspp.(扁豆)、Dorycniumrectum、Echinochloapyramidalis(稗)、Ehrartiaspp.(厚殼樹)、Eleusinecoracana(糝子)、Eragrestisspp.(幽眉草)、Erythrinaspp.(剌桐)、Eucalyptusspp.(按)、Eucleaschimperi、Eulaliavillosa(金茅)、Fagopyrumspp.(養麥)、Feijoasellowiana(南美穩)、Fragariaspp.(草莓)、Flemingiaspp.(千斤拔)、Freycinetiabanksii(藤露覽樹)、Geraniumthunbergii(老鶴草)、Ginkgobiloba(銀杏)、Glycinejavanica、Gliricidiaspp.(墨西哥丁香)、Gossypiumhirsutum(陸地棉)、Grevilleaspp.(銀禪)、Guibourtiacoleosperma、Hedysarumspp.(巖黃蓍)、Hemarthriaaltissima(牛鞭草)、Heteropogoncontortus(黃茅)、Hordeumvulgare(大麥)、Hyparrheniarufa、Hypericumerectum(小連翅)、Hypertheliadissolute、Indigoincarnata(庭藤)、Irisspp.(鸞尾)、Leptarrhenapyrolifolia、Lespedezaspp.(古月枝子)、Lettucaspp.、LeucaenaIeucocephala(銀合歡)、Loudetiasimplex、Lotonusbainesii、Lotusspp.(百脈根)、Macrotylomaaxillare、Malusspp.(蘋果)、Manihotesculenta(木薯)、Medicagosativa(紫苜猜)、Metasequoiaglyptostroboides(水杉)、Musasapientum(大蕉)、Nicotianumspp.(煙草)、Onobrychisspp.(馬戶豆)、Ornithopusspp.、Oryzaspp.(稻)、Peltophorumafricanum、Pennisetumspp.(狼尾草)、Perseagratissima(鱷梨)、Petuniaspp.(碧冬煎)、Phaseolusspp.(菜豆)、Phoenixcanariensis、Phormiumcookianum、Photiniaspp.(石捕)、Piceaglauca(白云杉)、Pinusspp.(松)、Pisumsativum(豌豆)、Podocarpustotara(新西蘭羅漢松)、Pogonarthriafleckii、Pogonarthriasquarrosa、Populusspp.(楊)、Prosopiscineraria(牧豆樹)、Pseudotsugamenziesii(花方萁松)、Pterolobiumstellatum、Pyruscommunis(西洋梨)、Quercusspp.(櫟)、Rhaphiolepsisumbellate(厚葉石斑木)、Rhopalostylissapida、Rhusnatalensis、Ribesgrossularia、Ribesspp.(茶薦子)、Robiniapseudoacacia(洋槐)、Rosaspp.(薔薇)、Rubusspp.(懸鉤子)、Salixspp.(柳)、Schyzachyriumsanguineum、Sciadopitysverticillata(金松)、Sequoiasempervirens(北美紅杉)、Sequoiadendrongiganteum(巨杉)、Sorghumbicolor、Spinaciaspp.(疲菜)、Sporobolusfimbriatus、Stiburusalopecuroides、StylosanthoshumiIisΛTadehagispp.(葫蘆荼)、Taxodiumdistichum(落習習松)、Themedatriandra(黃背草)、Trifoliumspp.(車軸草)、Triticumspp.(小麥)、Tsugaheterophylla(異葉鐵杉)、Vacciniumspp.(烏飯樹)、Viciaspp.(蠶豆)、Vitisvinifera(葡萄)、Watsoniapyramidata、Zantedeschiaaethiopica(馬蹄蓮)、Zeamays(玉蜀黍)、覓菜、朝鮮薊、蘆筍、嫩莖花椰菜、抱子甘藍、甘藍、canola、胡蘿卜、花椰菜、芹菜、羽衣甘藍、亞麻、散葉甘藍、小扁豆、油籽、油菜、秋葵、洋蔥、馬鈴薯、稻、大豆、稻草、甜菜、甘蔗、向日葵、番茄、南瓜、和荼等，或上文具體提及的任何植物的種子，或任何上述物種的組織、細胞、或器官培養物。“谷類”包括具有可食用谷粒的作物，例如屬于禾本科、為了獲得其營養谷粒而栽培的植物，諸如燕麥、大麥、黑麥、小麥、稻、和玉米等。本發明的范圍還包括雙雜交系統的應用，其中將本發明的任何序列用于研究與其它因素諸如蛋白質的相互作用。“酵母雙雜交實驗”指以如下觀察結果為基礎的實驗許多真核轉錄因子包含兩種結構域，即DNA結合結構域(DB)和激活結構域(AB)，當它們在物理上分開時(即破壞共價連接)，它們不實行靶基因的表達。對于能夠相互作用的兩種蛋白質而言，將一種所述蛋白質融合DB，將另一種所述蛋白質融合AD，則它們能夠重新聯合轉錄因子的DB和AD結構域，從而導致靶基因的表達。酵母雙雜交實驗中的靶基因通常是報告基因，諸如β_半乳糖苷酶基因。因而可以通過測量報告基因產物的活性來量化酵母雙雜交實驗中蛋白質配偶體之間的相互作用(Bartel和Fields，1997)。或者，可以使用哺乳動物雙雜交系統，包括例如編碼報告基因的嵌合綠色熒光蛋白(Shioda等人，2000)。還有一種候選方案是使用例如HIS作為報告基因的細菌雙雜交系統(Joung等人，2000)。本領域熟練技術人員還將認識到，在雙雜交系統的適合形式及其它技術(如凝膠阻滯、免疫沉淀、競爭抑制)中，有可能研究蛋白質-寡核苷酸相互作用，因而使用本發明任何序列的這些技術也屬于本發明的范圍之內。術語“序列片段”或“部分序列”指所指原始序列的截短序列。截短序列(核酸或蛋白質序列)的長度可以廣泛變化；最小長度是足以提供具有所指原始序列的至少一種可比功能和/或活性的序列，而最大長度并不重要。在有些應用中，最大長度通常并不顯著大于提供原始序列期望活性和/或功能所需要的長度。通常，截短氨基酸或核苷酸序列的長度范圍將是大約5-大約60個氨基酸。然而，更通常的是，序列的最大長度將是大約50個氨基酸，優選大約60個氨基酸。通常期望選擇至少大約10、12、或15個氨基酸或核苷酸的序列，最大值可達大約20或25個氨基酸或核苷酸。本發明還包括用于高通量化合物篩選的方法。本領域熟練技術人員能夠容易的設計使用一種或幾種本發明元件的這種方法。仍然有待獲得或鑒定的化合物可以是能夠結合參與前體信使RNA加工過程因而可用于本發明方法的任何核酸、肽、或蛋白質的化合物。例如樣品(如來自植物、動物、或微生物的細胞提取物)中可能包含所述化合物或其組合。此外，所述化合物在本領域可能是已知的但迄今不知道能夠遏制或激活參與前體信使RNA加工的蛋白質。本發明的范圍還包括向植物細胞中導入一種或多種重組核酸分子，諸如在所述植物細胞中以有效量表達后所編碼蛋白質能提高或誘導依照本發明的或權利要求書中定義的內源多核苷酸表達或者誘導權利要求的多肽的活性的DNA分子。通過參考下文非限制性圖和實施例進一步描述了本發明。圖的簡述圖I表達擬南芥cDNA分離克隆UlA、Ct_SRLl、或RCYl的酵母菌株的耐鹽表型，通過“懸滴測試(droptest)”測定；其中在不含鹽或含指定LiCl或NaCl濃度的平板上測試不同菌株和包含空表達載體的對照菌株的飽和培養物的系列稀釋物。圖2由克隆RYCl(ASEQIDNO.4)和Ct-SRLl(BSEQIDNO.3)的核苷酸序列衍生的氨基酸序列。定義RS結構域的二肽Arg-Ser、Arg-Glu、和Arg-Asp以粗體字母書寫。(A)中標有下劃線的M指示在酵母中表達RCYl的RS結構域(SEQIDNO.21)時用作起始子的甲硫氨酸殘基。圖3表達RCYl的氨基末端(細胞周期蛋白)結構域、羧基末端RS結構域、或全長蛋白質的酵母菌株的耐鹽表型。如圖I的實驗進行懸滴測試。圖4轉基因擬南芥植株的耐鹽表型。將來自經CaMV35S啟動子控制下的Ct-RSLlcDNA轉化的3個獨立轉基因系(L1、L3、和L5，作為獲得的12個系的范例)的T2種子在不含(A)或含有(B)20mMLiCl的瓊脂平板上發芽。將來自野生型植株(Wt)的種子用作對照。所有轉基因系都顯示相似表型。圖5本發明的基因和蛋白質的序列。實施例實施例I:植物材料將紅甜菜(甜菜變種DITA，本文也稱為“甜菜”)種子播種在裝有沙子和蛭石混合物(Ilw/w)的陶罐中。在溫室條件(20°C8小時和25°C16小時，補充光照以刺激最少12小時的光周期)下栽培植物。用含2.4g/LCa(NO3)2·4Η20、Ig/LKN03、lg/LMgSO4·7Η20、0.3g/LKH2PO4>5.6mg/LFe-quelate(Kelantren,Bayer)、1.lmg/LZnSO4·7H20、3.3mg/LMnO4·H20,0.3mg/LCuSO4·5H20、3.8mg/LH3B03、0.18mg/L(NH4)6Mo7·4H20的營養液進行定期灌溉。為了構建cDNA文庫，在收獲前用200mMNaCl灌溉3周齡的植株達24小時。實施例2:酵母菌株和培養條件用擬南芥cDNA文庫轉化釀酒酵母感受態細胞W303_lA(MATaura3,leu2,his3,trpl,ade2,ena1-4::HIS3)。將由J.M.Mulet(UniversidadPolitecnicadeValencia,InstitutodeBiologiaMolecularyCellulardePlantas)提供的釀酒酵母菌株JM26(MAtaleu2-3,112ura3-1trpl_l，ade2-1his3-11,15can1-100,ena1-4::HIS3，nhal::TRP1)用于篩選紅甜菜cDNA文庫。菌株JM26是W303.IA(Wallis等人，1989，Cell，58:409-419)的衍生物，它具有基因ENA1-4和NHAl的無效突變，二者分別編碼在酵母中負責排出大部分鈉的Na+泵APT酶和Na+/H+反向轉運蛋白(Garciadeblas等人，1993,Mol.Gen.Genet.，236363-368；Bauelos等人，1998，Microbiology,144:2749-2758)。在基本合成葡萄糖培養基(SD)或豐富培養基(YPD)中培養酵母細胞。SD培養基含有2%葡萄糖、O.7%不含氨基酸的酵母氮堿、和50mM琥珀酸，用Tris調至pH5，依照指示添加需要的氨基酸[100μg/ml亮氨酸、30μg/ml腺嘌呤、100μg/ml甲硫氨酸]。YPD培養基含有I%酵母提取物、2%細菌用蛋白胨、和2%葡萄糖。依照圖和實施例所示向培養基中添加NaCl和LiCl。固體培養基含有2%細菌學級瓊脂。實施例3cDNA文庫的構建Minet等人，1992，PlantJ.，2(3):417-422描述了在載體pFL61中構建擬南芥cDNA文庫。為了構建經過鹽壓力誘導的甜菜cDNA文庫，使用實施例I中描述的植物材料。使用由經鹽處理的甜菜植株的葉片制備的poly(A)+RNA合成定向cDNA(cDNA合成試劑盒，Stratagene)。將cDNA連接到曬菌體入PG15載體中，并進行包裝(GigapackIIgold包裝提取物，Stratagene)。該噬菌體插入了可切除的表達質粒pYPGE15(以URA3作為選擇標記)，后者可直接用于大腸桿菌和酵母互補(Brunelli^PPali,1993,Yeast,9:1309-1318)。通過cre-lox重組酶系統(Brunelli和Pall，1993，Yeast，9:1309-1318)由λPG15回收質粒cDNA文庫。實施例4:賦予酵母以鹽耐受性的cDNA克隆的篩選和分離為了篩選在酵母中增加鹽耐受性的擬南芥cDNA，通過LiCl法(Gietz等人，1992，NucleicAcidsRes.,20:1425)將在pFL61中構建的cDNA文庫用于轉化酵母菌株W303-1A。在基本培養基添加25mM和50mMLiCl、或如圖所示、且含有400μM甲硫氨酸的平板中對轉化體篩選鹽耐受性。對抗性克隆進行由氟乳清酸誘導的質粒喪失(Boeke等人，1984，Mol.Gen.Genet.，197:354-346)，從而只選擇那些顯示依賴質粒的LiCl耐受性的克隆。結果在野生型菌株和液泡運輸缺陷的雙重突變體enal-4::HIS3tfpl::LEU2中得到了確認。為了篩選在酵母中增加鹽耐受性的甜菜cDNA，將在pYPGE15中構建的cDNA文庫用于轉化酵母突變株JM26。合并在含有亮氨酸和腺嘌呤的SD平板上通過尿嘧啶原養型選擇的轉化體，并以2xIO5細胞/板(12x12cm)的密度再次涂布在篩選培養基(含有亮氨酸、腺嘌呤、和甲硫氨酸且添加O.15MNaCl的SD)上。向選擇培養基中添加甲硫氨酸以避免選擇早已在擬南芥中發現的HAL2樣同系物(Quintero等人，1996,PlantCell,8:59-537；Gel-Mascarell等人，1999，PlantJ.,17(4):373-383)。或者，為了選擇Li+抗性酵母細胞，將轉化體再次涂布在篩選培養基(含有亮氨酸和腺嘌呤且添加20mMLiCl的SD)上。在相同的NaCl或LiCl培養基上再次篩選推定的陽性克隆。實施例5:胞內鋰含量的測定將表達本發明cDNA克隆的酵母細胞或用空載體轉化的對照菌株培養至指數期，然后向培養基中添加LiCl至終濃度30mM。在不同時間采集IOml樣品，并如先前所述(MurgClia等人，1996，J.Biol.Chem.,271=29029-29033)測定胞內鋰含量。實施例6:β-半乳糖苷酶測定用酵母表達載體中的Ct-SRLlcDNA轉化包含半乳糖誘導性啟動子控制下的大腸桿菌LacZ基因(被或未被內含子中斷)(Legrain和Rosbash，1989，Cell，75:573-583)的酵母細胞，或者用空質粒進行轉化作為對照。將培養物在含有或不含35mMLiCl的葡萄糖基本培養基中培養至指數期，然后換成半乳糖培養基并維持在相同鹽條件，以誘導β-半乳糖苷酶表達。在誘導后O(背景值)和4小時采集樣品，并如先前所述(Serrano等人，1973，Eur.J.Biochem.,34=479-482)在滲透后細胞中測量β_半乳糖苷酶活性。實施例I:RT-PCR測定將過度表達Ct-SRLlcDNA或用空載體轉化的酵母細胞培養至指數期，然后向培養基中添加LiCl至終濃度150mM，并在不同時間純化總RNA。用不含RNA酶的DNA酶I消化等量的總RNA,并使用M-MuLVRT酶(RocheMolecularBiochemicals)和與3’剪接位點下游277個核苷酸的第二個SARl外顯子發生雜交的引物preSARlrp(5’-CATCAAATCTTTCAGGG-3’,SEQIDNO.23)進行逆轉錄。隨后使用Netzyme(MolecularNetlineBioproducts)DNA聚合酶和與SARl內含子3’端發生雜交的引物preSARlfp(5’-CTTTATTTTACTGTACAG-3’，SEQIDNO.24)進行15個循環的PCR擴增。第5個循環后加入[a-32P]dCTP(740kBq,IlOTBq/mmol,Amersham),并在6%PA-尿素凝膠中分離產物,進行放射自顯影。使用FUJI(FujifilmBAS-1500)磷光成像儀測定擴增條帶的相對強度。將缺乏逆轉錄酶的樣品用作對照。實施例8:植物轉化將本發明的克隆(例如擬南芥Ct-SRLlcDNA)亞克隆到pBI121(Clontech)中取代⑶S基因，并通過電穿孔將生成的二元載體導入根癌農桿菌菌株C58C1中。如http://www.arabidopsis.org/protocoIs_Mundy2.html#trans.inf所述通過體內滲透獲得轉基因植株(像擬南芥植株)。或者，可以用本發明的基因轉化其它雙子葉或單子葉植物。因此，將它們克隆到合適的植物轉化載體(諸如二元載體)中，處于植物可操作性調控序列(諸如植物可操作啟動子和植物可操作終止子)的控制之下。可以使用本領域熟練技術人員眾所周知的標準技術(諸如由農桿菌介導的基因轉移)將包含本發明基因的這些載體轉化到植物(諸如農作物植物)中。表達本發明基因的轉基因植株預計顯示對環境壓力的耐受性增加，諸如對無機鹽毒性的耐受性增加。可以通過例如轉基因植株在含鹽培養基中發芽的能力而觀察到這種增加的耐受性。實施例9:用本發明的基因轉化稻在酵母中參與鹽耐受性的甜菜或擬南芥基因在單子葉植物(諸如稻)中的表達能夠賦予該單子葉植物以壓力耐受性。為了將本發明基因的壓力耐受性活性轉移至單子葉植物，通過本領域熟練技術人員眾所周知且下一段概述的標準技術用可操作連接啟動子的每一種上述基因(SEQIDNO.1、2、5、7、9、11、13、15、17、和19)轉化稻。在范圍為I天_1或多周的幾個時間周期后，如下所述對幼苗檢查轉化基因的表達。這里通過在器官發生培養基中栽培幼苗，并通過PCR或反向PCR檢查DNA或RNA的存在而進行的。在確認了基因表達后，如下所述對經轉化稻植株檢查對壓力環境(包括鹽、干旱、和寒冷)的耐受性的增強(參閱W097/13843)。這是通過在含有數量漸增的NaCl或LiCl的培養基中栽培經轉化稻植株而進行的。同樣，通過分別在亞最佳栽培溫度和亞最佳濕度水平下栽培經轉化植株來測試對寒冷或干旱的抵抗力的增加(參閱W097/13843)。由擬南芥介導的稻轉化將本發明的基因可操作連接啟動子，并克隆到載體中。通過電穿孔用這些載體轉化根癌農桿菌菌株LBA4404或C58，隨后在含有適當抗生素的固體瓊脂培養基上選擇經轉化細菌細胞。為了證明本發明基因在稻中的表達，將稻日本栽培種Nipponbare或Taipei的309枚成熟的、干燥的種子脫殼，滅菌，并在含有2，4_二氯苯氧基乙酸(2，4-D)的培養基上發芽。在黑暗中保溫4周后，切下由盾片衍生的胚性愈傷組織，并在相同培養基中增殖。然后將選擇的胚性愈傷組織與農桿菌共培養。將共培養后的愈傷組織在含有2，4-D的培養基上在黑暗中在存在合適濃度的適當選擇劑時培養4-5周。在此期間，形成了快速生長的抗性愈傷組織島。將此材料轉移至含有濃度降低的2，4-D的培養基并在光照下保溫后，成胚潛力得到釋放，并在隨后的4-5周內形成苗。由愈傷組織切下苗，并在含有生長素的培養基中保溫I周，然后可以由此轉移至土壤。在濕度高、白晝短的人工氣候室中栽培變硬的苗。可以在移植后3-5個月收獲種子。該方法以超過50%的比率產生單基因座轉化體(Chan等人，1993，PlantMol.Biol.，22:491-506；Hidi等人，1994，PlantJ.，6:271-282)。參考文獻AnG.,WatsonB.D.,StachelS.,GordonM.P.,&NesterE.ff.(1985)Newcloningvehiclesfortransformationofhigherplants(用于轉化高等植物的新克隆載體)·EMBOJ.4，277-284.ArmstrongC.L.,Petersenff.P.,Buchholzff.G.,BowenB.A.,&SulcS.L.(1990)FactorsaffectingPEG-mediatedstabletransformationofmaizeprotoplasts(影響由PEG介導的玉米原生質體穩定轉化的因素).PlantCellReports9,335-339.BaronΜ.H.&BaltimoreD.(1982)AntibodiesagainstthechemicalIysynthesizedgenome-1inkedproteinofpoliovirusreactwithnativevirus-specificproteins(針對化學合成的脊髓灰質炎病毒基因組連接蛋白的抗體與天然病毒特異蛋白發生反應).Cell28,395-404.BartelP.L&FieldsS.(1997)TheYeastTow-HybridSystem(酵母雙雜交系統)·OxfordUniversityPress.BechtoldN.&PelletierG.(1998)InplantaAgrobacterium-mediatedtransformationofadultArabidopsisthalianaplantsbyvaccuminfiltration(M.過真空滲透在植物中進行的由農桿菌介導的成熟擬南芥植株的轉化).MethodsMol.Biol.82,259-266.ChoR.J.,MindrinosΜ.,RichardsD.R.，SapolskyR.J.,AndersonM.,DrenkardE.，DewdneyJ.，ReuberT.L，StammersΜ.，FederspielN.，TheologisA.，YangW.H.，HubbellE.，AuM.，ChungE.Y.，LashkariD.，LemieuxB.，DeanC.，LipshutzR.J.，AusubelF.M.，DavisR.W.,&OefnerP.J.(1999)Genome-widemappingwithbiallelicmarkersinArabidopsisthaliana(使用biallelic標記在擬南芥中進行基因組范圍的作圖)·Nat.Genet.23，203-207.ChristouP.，McCabeD.Ε·，&SwainW.F.(1988)StabletransformationofsoybeancallusbyDNA-coatedgoldparticles(使用由DNA包被的金微粒進行的大豆愈傷組織的穩定轉化).PlantPhysiol.87，671-674.CrosswayA，OakesJ.V.，IrvineJ.M.，WardB.，KnaufV.C.，&ShewmakerC.K.(1986)IntegrationofforeignDNAfollowingmicroinjectionoftobaccomesophyllprotoplasts(外源DNA在顯微注射到煙草葉肉原生質體中后的整合)·Mol.Gen.Genet.202，179-185.DoddsJ.H.(1985)Plantgeneticengineering(植物遺傳工程)·CambridgeUniversityPress.FrommM.,TaylorLP.，&WalbotV.(1985)Expressionofgenestransferredintomonocotanddicotplantcellsbyelectroporation(通過電穿孔轉移到單子葉和雙子葉植物細胞中的基因的表達)·Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A82，5824-5828.HanahanD.(1983)StudiesontransformationofEscherichiacoliwithplasmids(關于用質粒轉化大腸桿菌的研究).J.Mol.Biol.166，557-580.HellensR.P.,EdwardsΕ·A.,LeylandN.R.,BeanS.，&MullineauxP.M.(2000)pGreenaversatileandflexiblebinaryTivectorforAgrobacterium-mediatedplanttransformation(pGreen:用于由農桿菌介導的植物轉化的通用且穩定的二元Ti載體).PlantMol.Biol.42，819-832.Herrera-EstrellaL，DeBlockΜ.，MessensΕ·H.J.P.，VanMontaguΜ.，&SchellJ.(1983a)Chimericgenesasdominantselectablemarkersinplantcells(在植物細胞中作為顯性選擇標記的嵌合基因).EMBOJ.2,987-995.Herrera-EstrellaL，DepickerA.，VanMontaguΜ.，&SchellJ.(1983b)ExpressionofchimaericgenestransferredintoplantcellsusingaTi-plasmid-derivedvector(使用由Ti質粒衍生的載體轉移到植物細胞中的嵌合基因的表達)·Nature303，209-213.JoungJ.K.,RammE.I.，&PaboC.O.(2000)Abacterialtwo-hybridselectionsystemforstudyingprotein-DNAandprotein-proteininteractions(用于石開究蛋白質-DNA和蛋白質-蛋白質相互作用的細菌雙雜交選擇系統).Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A97,7382-7387.KrensF.A.,MolendijkL,WullemsG.J.，&SchilperoortR.A.(1982)InvitrotransformationofplantprotoplastswithTi-plasmidDNA(使用Ti質粒DNA在體夕卜轉化植物原生質體).Nature296，72-74.LangemeierJ.L,CookR.F.,IsselC.J.，&MontelaroR.C.(1994)Applicationofcycledideoxyfingerprintingtoscreeningheterogeneouspopulationsoftheequineinfectiousanemiavirus(循環雙脫氧指紋用于篩選馬傳染性貧血病毒的異源群體的應用)·Biotechniques17，484-6，488，490.LernerR.A.(1982)Tappingtheimmunologicalrepertoiretoproduceantibodiesofpredeterminedspecificity(利用免疫庫來生成具有預定特異性的抗體).Nature299，593-596.LernerR.A.，GreenN.，AlexanderΗ.，LiuF.T.，SutcliffeJ.G.,&ShinnickT.Μ.(1981)ChemicallysynthesizedpeptidespredictedfromthenucleotidesequenceofthehepatitisBvirusgenomeelicitantibodiesreactivewiththenativeenvelopeproteinofDaneparticles(由乙肝病毒基因組的核苷酸序列預測的化學合成肽引發能夠與丹氏粒天然包膜蛋白發生反應的抗體)·Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A78,3403-3407.Li-SucholeikiX.C.，KhrapkoK.，AndreP.C.，MarcelinoL.A.，KargerB.L.,&ThillyW.G.(1999)Applicationsofconstantdenaturantcapillaryelectrophoresis/high-fidelitypolymerasechainreactiontohumangeneticanalysis(恒定變性劑毛細電泳/高保真聚合酶鏈式反應用于人類遺傳分析的應用)·Electrophoresis20，1224-1232.LiddleJ.Ε·&CryerA.(1991)APracticalGuidetoMonoclonalAntibodies(單克隆抗體實踐指南)·WileyNewYork.LofflerJ.，LanguiD.，ProbstA.，&HuberG.(1984)Accumulationof50kDaN-terminalfragmentofbeta_APP695inAlzheimer’sdiseasehippocampusandneocortex(β-ΑΡΡ695的50kDaN端片段在阿爾茨海默氏病海馬和新皮層中積累)·Neurochem.Int.24，281-288.MagyarZ.,MeszarosT.,MiskolcziP.,DeakΜ.，FeherA.,BrownS.,KondorosiΕ.，AthanasiadisA.，PongorS.，BilginΜ.，BakoL，KonczC.，&DuditsD.，(1997)CellcyclephasespecificityofputativeeyeIin-dependentkinasevariantsinsynchronizedalfalfacells(推定的細胞周期蛋白依賴性激酶變體在同步化苜猜細胞中的細胞周期階段特異性).PlantCell9，223-235.McCallumC.Μ.，ComaiL.，GreeneΕ·Α·，&HenikoffS.(2000b)Targetedscreeningforinducedmutations(用于誘導突變的革巴向篩選)·Nat.Biotechnol.18，455-457.McCallumC.M.，ComaiL.，GreeneΕ·A.，&HenikoffS.(2000a)Targetinginducedlocallesionsingenomes(TILLING)forplantfunctionalgenomics(用于植物功能基因組學的基因組中靶向誘導局部損傷).PlantPhysiol.123，439-442.MerrifieldR.B.(1963)Solidphasepeptidesynthesis.I.Thesynthesisofatetrapeptide(固相妝合成。I.四妝合成)·J.Amer.Chem.Soc.85，2149-2154.MurakamiT.,SimondsW.F.,&SpiegelA.M.(1992)Site-specificantibodiesdirectedagainstGproteinbetaandgammasubunitseffectsonalphaandbetagammasubunitinteraction(針對G蛋白β和Y亞基的位點特異抗體對α與βγ亞基相互作用的影響)·Biochemistry31，2905-2911.PalmgrenG.(1997)Transgenicplants!environmentallysafefactoriesofthefuture(轉基因植物未來對環境安全的工廠).TrendsGenet.13，348.PaszkowskiJ.，ShillitoR.D.，SaulΜ.，MandakV.，&HohnT.Η.B.P.I.(1984)Directgenetransfertoplant(直接將基因轉移至植物)·EMBOJ.3，2727-2722.RossP.，HalIL.，&HaffL.A.(2000)Quantitativeapproachtosingle-nucleotidepolymorphismanalysisusingMALDI-TOFmassspectrometry[InProcessCitation](使用MALDI-T0F質譜的單核苷酸多態性分析的定量方法)·Biotechniques29，620-629.SambrookJ.，FritschE.F.，&ManiatisT.(1989)MolecularCloningALaboratoryManual(分子克隆實驗室手冊)·ColdSpringHarborLaboratoryPress.SemlerB.L.，AndersonC.W.，HanecakR.，DornerL.F.,&WimmerE.(1982)Amembrane-associatedprecursortopoliovirusUPgidentifiedbyimmunoprecipitationwithantibodiesdirectedagainstasyntheticheptapeptide(通過使用針對合成七肽的抗體的免疫沉淀鑒定的脊髓灰質炎病毒Upg的膜相關前體).Cell28,405-412.ShiodaT.，AndrioleS.，YahataΤ·，&IsselbacherK.J.(2000)Agreenfluorescentprotein-reportermammaliantwo-hybridsystemwithextrachromosomalmaintenanceofapreyexpressionplasmid!ApplicationtointeractionSCreening(在染色體外維持捕獲物表達質粒的綠色熒光蛋白-報告基因哺乳動物雙雜交系統:用于篩選相互作用)·Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A97，5220-5224.TamuraR.N.,CooperH.M.,ColloG.，&QuarantaV.(1991)Celltype-specificintegrinvariantswithalternativealphachaincytoplasmicdomains(具有替換α鏈細胞質結構域的細胞類型特異整合蛋白變體).PiOc.Natl.Acad.Sci.U.S.A88，10183-10187.TrieuA.T.,BurleighS.H.,KardailskyI.V.,Maldonado-MendozaI.E.,VersawW.K.，BlaylockLA.，ShinH.，ChiouT.J.，KatagiH.，DewbreG.R.，WeigelD.，&HarrisonM.J.(2000)TechnicalAdvance-TransformationofMedicagotrunctulaviainfiltrationofseedlingsorfloweringplantswithAgrobacterium(技術進步通過用農桿菌滲透幼苗或正開花植株來轉化Medicagotrunctula).PlantJ.22，531-541.Vidal-PuigA.&MollerD.E.(1994)Comparativesensitivityofalternativesingle-strandconformationpolymorphism(SSCP)methods(替換單鏈構象多態性(SSCP)方法的相對敏感性)·Biotechniques17，490-2，494，496.WoulfeJ.，LafortuneL，deNadaiF.，KitabgiP.，&BeaudetA.(1994)Post-translationalprocessingoftheneurotensin/neuromedinNprecursorinthecentralnervoussystemoftherat-II.Immunohistochemicallocalizationofmaturationproducts(大鼠中樞神經系統中神經降壓肽/神經調節肽N前體的翻譯后加XoII.成熟產物的免疫組織學定位).Neuroscience60，167-181.YoonK.，Cole-StraussA.，&KmiecΕ.B.(1986)TargetedgenecorrectionofepisomalDNAinmammaliancellsmediatedbyachimericRNA.DNAoligonucleotide(哺乳動物細胞中由嵌合RNA.DNA寡核苷酸介導的游離DNA的靶向基因修正)·Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A93，2071-2076.權利要求1.增強細胞和生物體中的壓力耐受性的方法，包括操作信使RNA前體的加工過程。2.增強細胞和生物體中的鹽毒性的方法，包括操作信使RNA前體的加工過程。3.依照權利要求I或2任一項的方法，其中所述操作包括對參與或干預信使RNA前體加工過程的分子進行的遺傳或生化操作。4.依照權利要求I或3的方法，其中所述壓力耐受性包括對滲透、干旱、寒冷、或凍結壓力的耐受性。5.依照權利要求1-4任一項的方法,包括對具有Arg-Ser、Arg-Glu、和Arg-Asp二肽高含量的結構域(RS結構域)的蛋白質進行的遺傳或生化操作。6.依照權利要求1-4任一項的方法，包括對屬于RNA結合蛋白的蛋白質進行的遺傳或生化操作。7.依照權利要求1-4任一項的方法，包括對Ul-snRNP或U2_snRNP復合物的成分進行的遺傳或生化操作。8.依照權利要求1-4任一項的方法，包括對轉錄因子進行的遺傳或生化操作。9.依照權利要求1-4任一項的方法，包括對核運動蛋白進行的遺傳或生化操作。10.包含SEQIDNO.I所示核酸序列即編碼SEQIDNO.3所列氨基酸序列的分離核酸、或包含如SEQIDNO.2所示即編碼SEQIDNO.4或SEQIDNO.21所列氨基酸序列或包含SEQIDNO.22的氨基酸序列的核酸用于依照權利要求1_5的任何方法的用途。11.包含SEQIDNO.5所示核酸序列即編碼SEQIDNO:6所列氨基酸序列的分離核酸用于權利要求1-4或7的任何方法的用途。12.包含SEQIDNO.7、9、11、13、15、17、或19任一核酸序列即編碼SEQIDNO.8、10、12、14、16、18、或20任一所列氨基酸序列的分離核酸用于權利要求1-4的任何方法的用途。13.選自下組且編碼蛋白質或其免疫學活性和/或功能性片段的分離核酸a)包含SEQIDNO.1、2、5、7、9、11、13、15、17、或19任一所示DNA序列或其互補序列的核酸；b)包含對應于(a)中SEQIDNO.1、2、5、7、9、11、13、15、17、或19任一項的RNA序列或其互補序列的核酸；c)與(a)或(b)中定義的核苷酸序列特異雜交的核酸；d)所編碼的蛋白質具有與SEQID勵.3、4、6、8、10、12、14、16、18、20、或21任一項所示多肽至少95%同一的氨基酸序列的核酸；e)所編碼的蛋白質包含SEQIDΝ0·3、4、6、8、10、12、14、16、18、20、21、或22任一項所示氨基酸序列的核酸；f)由于遺傳密碼筒并性而是SEQIDNO.1、2、5、7、9、11、13、15、17、或19任一項所示或(a)-(e)中定義的核酸的簡并性的核酸；g)由于生物體之間密碼子使用率的差異而與編碼SEQIDNO.3、4、6、8、10、12、14、16、18、20、或21任一項所示蛋白質或(a)-(e)中定義的核苷酸序列具有分歧的核酸；h)由于編碼SEQIDNO.3、4、6、8、10、12、14、16、18、20、或21任一項所示蛋白質或(a)-(e)中定義的等位基因的差異而具有分歧的核酸；i)編碼由SEQIDNO.1、2、5、7、9、11、13、15、17、或19任一項所示或(a)-(e)中定義的DNA序列編碼的蛋白質的免疫學活性和/或功能性片段的核酸；j)編碼SEQIDNO.3、4、6、8、10、12、14、16、18、20、或21中定義的蛋白質或(a)-(i)中定義的核酸，其特征為所述序列是DNA、cDNA、基因組DNA、或合成DNA。14.與權利要求13的核酸特異雜交的長度為至少15個核苷酸的核酸分子。15.特異擴增權利要求13的核酸的長度為至少15個核苷酸的核酸分子。16.包含依照權利要求13的核酸的載體。17.依照權利要求16的載體，它是表達載體，其中所述核酸可操作連接能夠在原核和/或真核宿主細胞中表達所述序列的一種或多種控制序列。18.包含依照權利要求13的核酸或權利要求16或17的載體的宿主細胞。19.依照權利要求18的宿主細胞，其選自細菌、昆蟲、真菌、酵母、植物、或動物細胞。20.編碼包含權利要求5中定義的“RS結構域”的蛋白質的天然或合成核酸用于權利要求1-4的任何方法的用途。21.編碼在真核細胞中參與信使RNA前體加工過程的蛋白質的天然或合成核酸在權利要求1-9的任何方法中的用途。22.與權利要求10-13任一項中鑒定的至少一種序列具有至少50%同一性的核酸在權利要求I的方法中的用途，其中所述核酸源自真核細胞。23.對應于權利要求12中定義的至少一種核酸的反義分子。24.權利要求23的反義分子在權利要求1-4的任何方法中的用途。25.可以由權利要求13定義的至少一種核酸編碼的多肽、或其同系物或衍生物、或其免疫學活性和/或功能性片段。26.包含SEQID勵.3、4、6、8、10、12、14、16、18、20、21、或22任一項所示氨基酸序列的權利要求25的多肽、或其同系物或衍生物、或其免疫學活性和/或功能性片段。27.生成依照權利要求25或26的多肽的方法，包括在允許表達多肽的條件下培養權利要求18或19的宿主細胞并由培養物回收生成的多肽。28.用于生成轉基因植物、植物細胞、或植物組織的方法，包括將可表達形式的依照權利要求13的核酸分子或依照權利要求16或17的載體導入所述植物、植物細胞、或植物組織。29.用于生成改變后的植物、植物細胞、或植物組織的方法，包括將權利要求25或26的多肽直接導入所述植物的細胞、組織、或器官。30.用于實現權利要求25或26的多肽的表達的方法，包括將可操作連接一種或多種控制序列的權利要求13的核酸或依照權利要求16或17的載體穩定導入植物細胞的基因組。31.權利要求28或30的方法，還包括由所述植物細胞再生植株。32.可以通過權利要求31的方法獲得的轉基因植物細胞，其中所述核酸穩定整合到所述植物細胞的基因組中。33.因表達權利要求13的至少一種核酸或權利要求25或26的至少一種多肽或權利要求23的反義分子而耐受鹽壓力的轉基因植物。34.因表達權利要求13的至少一種核酸或權利要求25或26的至少一種多肽或權利要求23的反義分子而顯示表型變化的轉基因植物。35.權利要求33和34的植物的可收獲部分。36.權利要求35的植物的可收獲部分，其選自下組種子、葉、果實、莖干培養物、根狀莖、根、塊莖、和鱗莖。37.由權利要求33-36任一項任何植物或植物部分衍生的后代。38.用于在植物中增強壓力耐受性的方法，包括在所述植物的細胞、組織、或部分中表達權利要求13的至少一種核酸或權利要求25或26的至少一種多肽或權利要求23的反義分子。39.用于在植物中改變壓力耐受性的方法，包括在所述植物的細胞、組織、或部分中表達權利要求13的至少一種核酸或權利要求25或26的至少一種多肽或權利要求23的反義分子。40.權利要求38或3941.權利要求38或3942.權利要求38或3943.權利要求38或3944.權利要求38或3945.權利要求1-9、27-31、或38-44任一項的方法用于提高產量。46.權利要求13的核酸、權利要求16或17的載體、權利要求25或26的多肽用于提高產量的用途。47.權利要求13的核酸、權利要求16或17的載體、權利要求25或26的多肽用于刺激植物生長的用途，可以是在該植物的任何部分，諸如根、葉、種子中。48.可以通過權利要求1-9、28-31、或38-42的任何方法獲得的植物或者權利要求33或34的植物用于在鹽含量超過ImM鹽離子的土壤上栽培的用途。49.因表達權利要求13的任何核酸和/或權利要求25或26的蛋白質而更加耐受鹽壓力的新的酵母菌株或其它單細胞真核生物。50.體外細胞培養系統,它包括因表達權利要求13的至少一種核酸、權利要求16或17的載體、權利要求25或26的多肽、或者權利要求23的反義分子而獲得的權利要求18或19中定義的耐受鹽的動物、植物、或宿主細胞。51.由權利要求I中描述的方法衍生的對人的治療性應用。52.特異識別權利要求25或26的多肽或其特定表位的抗體。53.診斷組合物，它包含權利要求13-15的至少一種核酸、權利要求16或17的載體、權利要求25或26的多肽、或權利要求52的抗體。全文摘要本發明涉及通過操作信使RNA前體加工而提供的針對環境毒性的保護。進一步地，本發明描述了前信使RNA加工作為由例如鋰和鈉毒性引起的環境壓力的新靶的鑒定。由不同生物體過度表達參與前mRNA加工的不同類型的蛋白質(或蛋白質片段)可保護酵母免于鹽壓力的損害，這說明，不依賴其機制，對這種過程的任何刺激都可能抵消無機鹽的毒性作用。已經通過在轉基因擬南芥植株中過度表達這些類型的蛋白質而觀察到耐受性NaCl和LiCl的相似表型，證明了這種保護作用在真核細胞和生物體中的普遍性。文檔編號A61K48/00GK102586276SQ20121003744公開日2012年7月18日申請日期2001年4月19日優先權日2000年4月19日發明者J·J·弗門特米萊特,M·A·納蘭多奧利弗,M·羅丹莫迪納,O·溫森特邁納,R·A·卡諾努,R·塞拉諾薩拉姆,R·羅斯帕羅申請人:巴倫西亞多學科技術大學