專利名稱：經皮給藥方法、制劑和系統的制作方法
技術領域：
本發明涉及經皮給藥方法、制劑和裝置，具體而言，涉及聯合使用清潔和消毒皮膚、微針皮膚預處理、經皮給藥倉貼、促滲劑透明質酸酶、抗菌防腐劑和待遞送藥物的新型給藥方法和裝置。
背景技術：
人類皮膚的厚度在2-3_，最上層的是角質層，無痛緩釋經皮給藥一直是人類的夢想。世界上最早的無痛緩釋經皮給藥技術是中國的膏藥。近代西方發達國家的小分子脂溶性藥物無痛緩釋經皮技術構成了現在正在開發的經皮給藥技術的基礎。微針技術最早起源于不銹鋼微針陣列章(needle stamp)(圖I)，這種不銹鋼微
針陣列章針長度在O. 15-0. 25mm，主要功能是刺激表皮功能，用來除斑、除皺和美容。早在1996年，Des Fernandes博士在中華臺北的國際會議上提出了這種結構簡單、容易操作,使用起來方便的微針技術(圖I)。2004年,美國加州的Clinical Resolution Laboratory公司重新改造了不銹鋼微針陣列章，制造和生產了 MTS滾針(MTSRoller)并投放市場(圖2)，主要是做“微針美容”。最近，美歐科學家利用金屬硅和塑料等先進材料來制造一次性使用的O. 15-0. 25_微針陣列(幾十到幾百個微針排列成陣)，有實心和空心兩種。這種一次性使用的微針陣列，作為透皮貼的一次性使用組成部分，在經皮給藥過程中微針列陣一直插入在皮膚中將藥物向皮膚中傳導，直至藥物吸收后將微針陣列和經皮貼一起取出。這種利用先進材料來制造一次性使用的微針陣列的方法有專利發表，在經過某一特定藥物的人類臨床試驗的安全和藥效學認證后，有可能成為新一代市場化的無痛緩釋經皮給藥技術。皮膚和皮下組織主要成分是透明質酸(可以形象地比喻為“水泥”)和膠原纖維(可以比喻為“鋼筋”)，注射用透明質酸酶目前在臨床上是用來促進藥物在眼內和皮下的迅速擴散。另外，使用透明質酸酶可以在動物皮膚上消化“水泥”，增加皮膚對藥物的滲透性，也可以將已有的微針孔進一步擴大，促進藥物和疫苗的皮膚滲透。目前，還未見到透明質酸酶和一次性使用的O. 15-0. 25mm微針陣列經皮給藥貼在人類臨床上共同使用來介導雙體藥物 TNFR2-Fc-IL-lra、IL-lra-Fc-IL_18bp、抗 IL-12 抗體、抗 IL-23 抗體、抗 OPGL 抗體、促生長激素釋放激素(商品名Sermorelin) >GLP-1類似物(商品名Byetta)、生長抑素、抗利尿激素、胸腺五肽、腦鈉素、心鈉素、干擾素、basic FGF、紅細胞生成素、卡介苗、流感疫苗和乙肝疫苗發揮預防和治療作用的成功報道。雙體藥物TNFR2-Fc-IL-lra、IL-lra-Fc-IL-18b p、抗 IL-12 抗體、抗 IL-23 抗體、抗OPGL抗體、促生長激素釋放激素(商品名Sermorelin) >GLP-1類似物(商品名Byetta)、生長抑素、抗利尿激素、胸腺五肽、腦鈉素、心鈉素、干擾素、basic FGF、紅細胞生成素、主要是采用皮下、皮內或肌肉注射的辦法，直接皮下、皮內或肌肉注射，引起疼痛，而且不能緩釋，一次性注射藥物濃度高半衰期短，可能有副作用，不利于治療。卡介苗、流感疫苗和乙肝疫苗主要是采用皮下、皮內或肌肉注射的辦法，引起疼痛，而且可能不如經皮免疫的保護效果好。
發明內容
本發明提供了一種經皮給藥方法，包括對受試者皮膚進行清潔和消毒；用微針陣列章對受試者皮膚進行預處理以產生穿透皮膚角化層的微孔(給藥過程中不將微針留在皮膚中)；將裝載待遞送藥物的經皮給藥倉貼粘貼在受試者皮膚上，并保持一段時間；和將所述經皮給藥倉貼從受試者皮膚上取下；上述方法任一步驟時間段為O. 5-10小時；其中，所述經皮給藥倉貼中包含促滲透劑透明質酸酶、抗菌防腐劑和待送藥物或疫苗。
圖I是現有技術的美容、除皺、除疤痕用的微針陣列章。圖2是現有技術的美容、除皺、除疤痕用的MTS滾針。
圖3是可以穿透角化層的單人或一次性使用的微針陣列章的示意圖。圖4是可以穿透角化層的單人或一次性使用的微針陣列章的實物圖。圖5是經皮給藥倉貼的使用方法示意圖。圖6是經皮給藥倉貼的使用方法實物圖。圖7是裝載有藥物或疫苗的經皮給藥倉貼實物圖。圖8采用微針陣列章預處理、透明質酸酶促滲劑和抗菌防腐劑結合經皮給藥百泌肽對糖尿病患者血糖的控制情況。圖9采用微針陣列章預處理、透明質酸酶促滲劑和抗菌防腐劑結合經皮給藥百泌肽取代胰島素后對糖尿病患者血糖的控制情況。圖10是有透明質酸酶情況下，經皮給藥倉貼對不同藥物和疫苗經皮傳遞能力示意圖。圖11是無透明質酸酶情況下，經皮給藥倉貼對不同藥物和疫苗經皮傳遞能力示意圖。
具體實施例方式我們設想一種改進的新方法，即在人體上采用簡單的不銹鋼微針陣列章(needlestamp)(圖I)或MTS滾針(圖2)或塑料或鈦合金或硅材料等任何可以在皮膚上打孔的微針預處理皮膚，不將微針留在皮膚中，然后將經皮給藥倉貼裝載上透明質酸酶(作為藥物促皮膚滲透劑)和抗菌防腐劑(保護皮膚清潔和維持藥物穩定性)，再裝載上所需藥物或疫苗(即待遞送藥物)1-2小時內經皮緩釋治療。如果能成功，以上藥物的經皮緩釋或持續釋放，不需要將微針留在皮膚內，這樣給藥持續時間長，最高血藥濃度比注射給藥濃度低，其副作用可能小，有可能成為一種更簡單的、有商業價值的新方法。本發明涉及使用不銹鋼微針陣列章預處理人皮膚，在經皮貼藥倉內使用透明質酸酶(提取的或重組的，優選重組長效透明質酸酶)做為藥物皮膚促滲劑來促進藥物經皮吸收，又在經皮給藥倉內使用抗菌防腐劑例如苯扎氯銨防止皮膚感染和倉貼內待遞送藥物在緩釋過程中降解，在人體實現了有效的無痛安全經皮藥物緩釋。這些在人體上驗證的藥物包括雙體藥物 TNFR2-Fc-IL-lra、IL-lra-Fc-IL_18bp、抗 IL-12 抗體、抗 IL-23 抗體、抗OPGL抗體、促生長激素釋放激素(商品名Sermorelin)、GLP-I類似物(商品名Byetta)、生長抑素、抗利尿激素、胸腺五肽、腦鈉素、心鈉素、干擾素、basic FGF、紅細胞生成素、卡介苗、流感疫苗和乙肝疫苗。另外，含有透明質酸酶和抗菌防腐劑的經皮給藥倉貼也可以用來作為通用的不同藥物和疫苗的經皮給藥裝置。在一個實施方式中，本發明提供了一種經皮給藥系統，包括皮膚預處理用微針陣列章，微針陣列章在皮膚上制造透角化層針孔后不留在皮膚內，貼敷在所述的針孔上的經皮給藥倉貼裝載有透明質酸酶做為藥物促滲劑和抗菌防腐劑苯扎氯銨，還裝載有治療作用的雙體藥物 TNFR2-Fc-IL-lra、IL-lra-Fc-IL_18bp、抗 IL-12 抗體、抗 IL-23 抗體、抗 OPGL抗體或者促生長激素釋放激素(商品名Sermorelin)或者GLP-I類似物(商品名Byetta)或者生長抑素或者抗利尿激素或者胸腺五肽或者腦鈉素或者心鈉素或者干擾素或者basicFGF或者紅細胞生成素或者卡介苗、流感疫苗和乙肝疫苗。另外，給藥倉貼配合使用的促滲劑透明質酸酶、抗菌防腐劑苯扎氟銨和藥物也可在給藥倉貼上直接儲存，或在單獨的滴瓶內儲存(包括分離和混合裝瓶)。優選地，所述的藥物包括雙體藥物TNFR2-Fc-IL_lra、IL-lra-Fc-IL_18bp、抗 IL-12抗體、抗IL-23抗體、抗OPGL抗體、促生長激素釋放激素(商品名Sermorelin) >GLP-1類似物(商品名Byetta)、生長抑素、抗利尿激素、胸腺五肽、腦鈉素、心鈉素、干擾素、basicFGF、紅細胞生成素、卡介苗、流感疫苗和乙肝疫苗，可以用來治療炎癥性皮膚病、骨質疏松、貧血、病毒性疾病、矮小癥、衰老、艾滋病和腎病晚期、糖尿病、肥胖、免疫低下、病毒感染、結核病、腫瘤、流感、乙肝以及美容。優選地，所述的皮膚預處理微針陣列章是針長為一次性或單獨使用的O. 10-0. 25_的不銹鋼針。兒童使用O. Imm的不銹鋼針，婦女使用O. 15_的不銹鋼針，成年男人使用O. 2mm的不銹鋼針，卡介苗給藥采用O. 25mm以上的不銹鋼針。優選地，所述的微針陣列為直徑為1.5-3cm的圓形陣列，每個圓形陣列含有20-200個微針。優選地，所述的經皮給藥倉貼是由PVC軟塑料外膜和無紡布一起制成，無紡布是用來維持藥倉有效液體裝載體積。在一個實施方式中，本發明還提供了一種經皮給藥方法，包括第一步是酒精消毒皮膚，然后用單人多次使用的微針陣列章(圖3和圖4)給皮膚打能穿透皮膚角化層的微孔(預處理皮膚)；第二步是在裝有透明質酸酶和抗菌防腐劑的經皮給藥倉貼(圖5和圖6)上裝載含有藥物和疫苗的制劑；第三步是將已裝載藥物和疫苗的經皮給藥倉貼粘貼在上肢皮膚上(圖7)第四步是在1-1. 5小時后將經皮給藥倉貼從皮膚上拿掉完成經皮緩釋給藥。優選地，所述的制造透角化層針孔的方法是采用微針陣列章反復多次刺壓皮膚，但不留在皮膚中。優選地，待遞送藥物(藥物或疫苗等)可以與透明質酸酶、抗菌防腐劑混合成制劑儲存在同一藥液瓶中或裝載在無紡布給藥倉內。在一個具體實施方式
中，本發明還提供了多種經皮給藥制劑，其組成分別包括如下組分TNFR2-Fc_IL_lra 2. 5_20mg/ml、透明質酸酶(O. 01-10 單位/ml)、乙酸鈉(Sodiumacetate buffer) 10_20mM、苯扎氯銨(Benzalkonium chloride)0. 005% (mg/ml)、羧甲基纖維素(Carboxy methyl cellulose)。· 5% (mg/ml)、吐溫80(Tween 80)0. 005-0· 01 (mg/ml)、精氨酸(Arginine) 0. 05-0. I % (mg/ml)、組胺(Histamine) 5_15mM，所述的經皮給藥制劑的pH 為 4· 5-5.0。每O. 3-0. 5ml含促生長激素釋放激素(商品名Sermorelin) O. 1-0. 3mg、透明質酸酶(0. 01-10 單位 /ml)、乙酸鈉(Sodium acetate buffer) 10_20mM、苯扎氯銨(Benzalkonium chloride) 0. 005% (mg/ml)、吐溫 80 (Tween 80) 0. 005-0. 01 (mg/ml)、精氨酸(Arginine) 0. 05-0. I % (mg/ml)、組胺(Histamine) 10_15mM。每0. 3-0. 5ml含GLP-1類似物(商品名Byetta)0. 1-0. 5mg、透明質酸酶(0. 01-10 單位/ml)、乙酸鈉(Sodium acetate buffer) 10_20mM、苯扎氯銨(Benzalkoniumchloride) 0. 005 % (mg/ml)、吐溫 80 (Tween 80) 0. 005-0· 01 (mg/ml)、精氨酸(Arginine) 0. 05—0. I % (mg/ml)、組胺(Histamine) 10_15mM。
每0. 2-0. 6ml含胸腺五肽l_6mg、透明質酸酶(0. 01-10單位/ml)、乙酸鈉(Sodium acetate buffer) 10_20mM、苯扎氯銨(Benzalkonium chloride) 0. 005 % (mg/ml)、吐溫 80 (Tween 80) 0. 005-0. 01 (mg/ml)、精氨酸(Arginine) 0. 05—0. I % (mg/ml)、組胺(Histamine)10_15mMo每0. 2-0. 6ml含生長抑素0. 2-0. 6mg、透明質酸酶(0. 01-10單位/ml)、乙酸鈉(Sodium acetate buffer) 10_20mM、苯扎氯銨(Benzalkoniumchloride)0. 005% (mg/ml)、吐溫 80 (Tween 80) 0. 005-0. 01 (mg/ml)、精氨酸(Arginine) 0. 05-0. I % (mg/ml)、組胺(Histamine)10_15mMo每0. 2-0. 6ml含抗利尿激素0. 2-0. 6mg、透明質酸酶(0· 01-10單位/ml)、乙酸鈉(Sodium acetate buffer) 10_20mM、苯扎氯銨(Benzalkonium chloride)0. 005% (mg/ml)、吐溫 80 (Tween 80) 0. 005-0. 01 (mg/ml)、精氨酸(Arginine) 0. 05—0. I % (mg/ml)、組胺(Histamine)10_15mMo每0. 2-0. 6ml含腦鈉素0. 2-0. 6m g、透明質酸酶(0. 01-10單位/ml)、乙酸鈉(Sodium acetate buffer) 10_20mM、苯扎氯銨(Benzalkonium chloride) 0. 005 % (mg/ml)、吐溫 80 (Tween 80) 0. 005-0. 01 (mg/ml)、精氨酸(Arginine) 0. 05—0. I % (mg/ml)、組胺(Histamine)10_15mMo每0. 2-0. 6ml含心鈉素0. 2-0. 6m g、透明質酸酶(0. 01-10單位/ml)、乙酸鈉(Sodium acetate buffer) 10_20mM、苯扎氯銨(Benzalkonium chloride) 0. 005 % (mg/ml)、吐溫 80 (Tween 80) 0. 005-0. 01 (mg/ml)、精氨酸(Arginine) 0. 05—0. I % (mg/ml)、組胺(Histamine)10_15mMo每0. 2-0. 6ml含干擾素0. 2-0. 6mg、透明質酸酶(0. 01-10單位/ml)、乙酸鈉(Sodium acetate buffer) 10_20mM、苯扎氯銨(Benzalkoniumchlo ride) 0. 005 % (mg/ml)、吐溫 80 (Tween 80) 0. 005-0. 01 (mg/ml)、精氨酸(Arginine) 0. 05—0. I % (mg/ml)、組胺(Histamine)10_15mMo每0. 5ml含卡介苗0. 25m g、透明質酸酶(0. 01-10單位/ml)、乙酸鈉(Sodiumacetate buffer)10_20mM、苯扎氯銨(Benzalkonium chloride)0.005 % (mg/ml)、吐溫 80 (Tween 80) 0. 005-0· 01 (mg/ml)、精氨酸(Arginine) 0. 05-0. I % (mg/ml)、組胺(Histamine)10_15mM。每0. 5ml含流感疫苗30微克、透明質酸酶(O. 01-10單位/ml)、乙酸鈉(Sodiumacetate buffer) 10-20mM> 苯扎氯銨(Benzalkonium chloride)0. 005 % (mg/ml)、吐溫 80 (Tween 80) 0· 005-0. 01 (mg/ml)、精氨酸(Arginine) 0. 05-0. I % (mg/ml)、組胺(Histamine)10_15mM。每0. 5ml含乙肝疫苗20微克、透明質酸酶(O. 01-10單位/ml)、乙酸鈉(Sodiumacetate buffer) 10_20mM、苯扎氯銨(Benzalkonium chlo ride) 0. 005 % (mg/ml)、吐溫 80 (Tween 80) 0· 005-0. 01 (mg/ml)、精氨酸(Arginine) 0. 05-0. I % (mg/ml)、組胺(Histamine)10_15mM。本發明解決了藥物和疫苗等的經皮傳遞問題和使用制劑的經皮傳遞問題。發明人采用不銹鋼針來制作針長為0. 10-0. 25mm的圓形陣列章，每個圓形陣列章的直徑為I. 5-3em,含20-200個微針(圖I、圖3和圖4)。每個微針陣列章經清洗和滅菌 后，用來單人反復使用或一次性使用，這種微針陣列章是用來預處理皮膚穿透皮膚角化層的。除微針陣列章外，發明人還生產了經皮給藥倉貼和用來向微針經皮給藥倉貼上滴入的制劑等。優選地，本發明的經皮給藥倉貼是采用PVC軟塑料膜和無紡布一起制成的，示意圖和實物圖如圖5和圖6所示。經皮給藥倉貼所采用的PVC軟塑料是用來防止藥物和疫苗溶液外漏，無紡布是用來吸附和保留藥物和疫苗溶液，最終目的也是用來防止藥物和疫苗溶液外漏。經皮治療制劑和方法經皮治療藥物和疫苗(包括但不限于雙體藥物TNFR2-Fc-IL_lra、IL-lra-Fc-IL-18bp、抗IL-12抗體、抗IL-23抗體、抗OPGL抗體、促生長激素釋放激素(商品名Sermorelin) >GLP-1類似物(商品名Byetta)、生長抑素、抗利尿激素、胸腺五肽、腦鈉素、心鈉素、胰島素、干擾素、basic FGF、紅細胞生成素和卡介苗等)制劑，如I.藥物或疫苗2.乙酸鈉(Sodium acetate buffer) 10_20mM3.苯扎氯銨(Benzalkonium chloride)0. 005% mg/ml4.吐溫 80 (Tween 80) 0. 005-0. Olmg/ml5.精氨酸(Arginine) 0. 05-0. I % mg/ml6.組胺(Histamine) 10_15mM在一個實施方式中，第一步是酒精消毒皮膚，然后用單人多次使用的微針陣列章(圖3和圖4)給皮膚打出能穿透皮膚角化層的微孔(預處理皮膚)；第二步是在裝有透明質酸酶和抗菌防腐劑的經皮給藥倉貼(圖5和圖6)上滴加含有藥物和疫苗的制劑；第三步是將已裝載藥物和疫苗的經皮給藥倉貼粘貼在上肢皮膚上(圖7)。一般在1-1. 5小時后將經皮給藥倉貼從皮膚上拿掉完成經皮給藥。例如，在一個具體實施方式
中，使用促生長激素釋放激素(商品名Sermorelin)和經皮給藥方法(來治療衰老)，每日治療一次，每次劑量200ug，一個半小時之內緩釋(以一個半小時后將經皮貼揭去)，連續兩個月。兩個月后測定腹圍、體重和臉色，實驗結果顯示治療組腹圍平均下降2. 2cm，體重平均下降I. 2公斤，臉色明顯好轉。這個實驗表明促生長激素釋放激素經皮給藥可以用來預防衰老。在一個具體實施方式
中，使用GLP-I類似物(商品名Byetta，也稱百泌肽)經皮給藥來治療二型糖尿病和肥胖，每日早餐和晚餐前治療兩次，每次劑量200ug，一個半小時之內緩釋，連續兩個月，兩個月后測定空腹血糖、腹圍和體重，實驗結果顯示治療組空腹血糖平均下降12% (圖8)，腹圍平均下降I. 2cm，體重平均下降O. 8公斤。對已經使用胰島素治療的患者，我們采用Byetta經皮給藥，完全取代了胰島素，病人已不再使用胰島素，只用Byetta經皮給藥就可以維持血糖在正常范圍內(圖9)。在一個具體實施方式
中，使用促生長激素釋放激素(商品名Sermorelin)、GLP-I類似物(商品名Byetta)、胸腺五肽、胰島素、抗IL-12/23抗體、抗OPGL抗體、卡介苗、乙肝疫苗和滅活流感疫苗、純化透明質酸酶、重組透明質酸酶和重組Fc/HSA融合的長效透明質酸酶，結合使用以上各類成分的抗體，我們采用皮膚活檢和抗體染色的辦法進行了動物和人以上各類成分經皮滲透的研究。初步研究結果表明，在透明質酸酶存在的情況下，經皮貼可以有效的將促生長激素釋放激素、GLP-I類似物和胸腺五肽釋放入血，并產生人體生物效應和治療效果(圖10)。在透明質酸酶存在的情況下，分子超大的病毒和細菌不能通過皮膚 免疫屏障，透明質酸酶由于和皮膚粘多糖發生反應，也不能滲透入血，也沒有產生人體生物效應(圖10)。在沒有透明質酸酶存在的情況下，相同劑量的促生長激素釋放激素、GLP-I類似物和胸腺五肽只能少量透過皮膚入血，沒有產生人體生物效應和相應的治療效果(圖11)。與現有技術相比，本發明的優點有有效的經皮傳遞藥物和疫苗一直是世界難題，我們通過利用藥物或疫苗(雙體藥物 TNFR2-Fc-IL-lra、IL-lra-Fc-IL_18bp、抗 IL-12 抗體、抗 IL-23 抗體、抗 OPGL 抗體、促生長激素釋放激素(商品名Sermorelin) >GLP-1類似物(商品名Byetta)、生長抑素、抗利尿激素、胸腺五肽、腦鈉素、心鈉素、胰島素、干擾素、basic FGF、紅細胞生成素、卡介苗、流感疫苗和乙肝疫苗等)進行多次動物和人的實驗，建立了一個微針皮膚預處理、結合透明質酸酶促滲劑和抗菌防腐劑、PVC無紡布經皮給藥倉貼和幾種藥物的新型經皮給藥方法和制劑。下面結合實施例，更具體地說明本發明的內容。應當理解，本發明的實施并不局限于下面的實施例，在不脫離本發明的精神的情況下，對本發明所做的任何形式上的變通和/或改變都將落入本發明保護范圍。在本發明中，若非特指，所有的份、百分比均為重量單位，所有的設備和原料等均可從市場購得或是本行業常用的。若無特別指明，實施例采用的方法為本領域通用技術。對實施例的幾點說明(I)實施例中的經皮給藥方法按如下操作第一步是酒精消毒皮膚，然后用單人多次使用的微針陣列章(圖3和圖4)給皮膚打能穿透皮膚角化層的微孔(預處理皮膚)；第二步是在裝有透明質酸酶和抗菌防腐劑的經皮給藥倉貼(圖5和圖6)上滴加含有藥物和疫苗的制劑；第三步是將已裝載藥物和疫苗的經皮給藥倉貼粘貼在上肢皮膚上(圖7)。一般在1-1. 5小時后將經皮藥物治療貼從皮膚上拿掉完成經皮給藥。(2)實施例中的最終經皮給藥制劑
I.藥物(雙體藥物 TNFR2-Fc-IL-lra、IL-lra-Fc-IL_18bp、抗 IL-12 抗體、抗IL-23抗體、抗OPGL抗體、促生長激素釋放激素(商品名SermoreIin)、GLP-I類似物(商品名Byetta)、生長抑素、抗利尿激素、胸腺五肽、腦鈉素、心鈉素、胰島素、干擾素等)2.透明質酸酶(O. 01-10單位/ml)3.乙酸鈉(Sodium acetate buffer) 10_20mM4.苯扎氯銨(Benzalkonium chloride)O. 005% mg/ml
5.吐溫 80 (Tween 80) 0. 005-0. Olmg/ml6.精氨酸(Arginine) 0. 05-0. 1% mg/ml7.組胺(Histamine) 10_15mM實施例I使用TNFR2-IL_lra經皮治療抗體蛋白質制劑(杭州安瑞普生物科技有限公司制備)和經皮給藥方法來治療炎性皮膚病(異位性皮炎)，隔日治療一次，每次劑量I. 0-5. Omg0實驗結果顯示炎癥引起的瘙癢在給藥后一小時內消失，皮損處的紅色炎性斑點在三小時后開始消退，皮損在兩周后大部消失(圖7)。以上實驗結果還提示TNFR2-IL-lra有可能成為炎癥性皮膚病(如治療牛皮癬)的有效藥物。TNFR2-FC是目前治療牛皮癬的主要藥物，牛皮癬與皮膚炎癥類似，沒有真正的牛皮癬模式，但抗TNF藥物就是治牛皮癬的。實施例2使用IL-lra-Fc-IL-18bp(哈藥生物制備，按本發明方法制備成經皮治療抗體蛋白質制劑)和經皮給藥方法來治療炎性皮膚病(異位性皮炎)，每次劑量I. 0-5. Omg,隔日治療一次。實驗結果顯示炎癥引起的瘙癢在給藥后一小時開始消失，損處的紅色炎性斑點在三小時后開始消退，皮損在一周后開始消失。實施例3使用一種抗IL-12/23抗體經皮治療抗體蛋白質制劑(杭州安瑞普生物科技有限公司制備)和經皮給藥方法來治療炎性皮膚病(異位性皮炎)，隔日治療一次，每次劑量1.0-5. Omgoo實驗結果顯示炎癥引起的瘙癢在給藥后一小時內消失，皮損處的紅色炎性斑點在三小時后開始消退，皮損在兩周后大部消失。實施例4使用一種抗OPGL抗體經皮治療抗體蛋白質制劑(杭州安瑞普生物科技有限公司制備)和經皮給藥方法來治療女性更年期后骨質疏松，每次劑量I. 0-5. Omg,隔日治療一次，連續兩周，經兩周治療后，第三個月使用DXA(dual energy χ-ray absorptiometry)來檢測骨密度增加的百分率(Bone Mineral Density Percent Change)。實驗結果顯示抗OPGL抗體經皮給藥平均增加了骨密度2. I %。實施例5使用促生長激素釋放激素(商品名Sermorelin)和經皮給藥方法(來治療衰老)，每日治療一次，每次劑量200ug，一個半小時之內緩釋(以I各半小時后將經皮貼揭去)，連續兩個月。兩個月后測定腹圍、體重和臉色，實驗結果顯示治療組腹圍平均下降2. 2cm，體重平均下降I. 2公斤，臉色明顯好轉。這個實驗表明促生長激素釋放激素經皮給藥可以用來預防衰老。實施例6
使用GLP-I類似物(商品名Byetta)經皮給藥來治療二型糖尿病和肥胖，每日早餐和晚餐前治療兩次，每次劑量200ug，一個半小時之內緩釋，連續兩個月，兩個月后測定空腹血糖、腹圍和體重，實驗結果顯示治療組空腹血糖平均下降12% (圖8)，腹圍平均下降I. 2cm，體重平均下降O. 8公斤。對已經使用胰島素治療的患者，我們采用Byetta經皮給藥，完全取代了胰島素，病人已不再使用胰島素，只用Byetta經皮給藥就可以維持血糖在正常范圍內(圖9)。實施例7使用促生長激素釋放激素(商品名Sermorelin) >GLP-1類似物(商品名Byetta)、胸腺五肽、胰島素、抗IL-12/23抗體、抗OPGL抗體、卡介苗、乙肝疫苗和滅活流感疫苗、純化透明質酸酶、重組透明質酸酶和重組Fc/HSA融合的長效透明質酸酶，結合使用以上各類成分的抗體，我們采用皮膚活檢和抗體染色的辦法進行了動物和人以上各類成分經皮滲透的研究。初步研究結果表明，在透明質酸酶存在的情況下，經皮貼可以有效的將促生長激素釋放激素、GLP-I類似物和胸腺五肽釋放入血，并產生人體生物效應和治療效果(圖10)。在透 明質酸酶存在的情況下，分子超大的病毒和細菌可以誘發皮內的免疫反應，但不能通過皮膚免疫屏障，透明質酸酶由于和皮膚粘多糖發生反應，也不能滲透入血，也沒有產生人體生物效應(圖10)。在沒有透明質酸酶存在的情況下，相同劑量的促生長激素釋放激素、GLP-I類似物和胸腺五肽只能少量透過皮膚入血，沒有產生人體生物效應和相應的治療效果(圖11)。實施例8使用胰島素經皮給藥來治療糖尿病，每次劑量200ug，一個半小時之內緩釋，一日三餐每餐前和餐后兩小時測定血糖濃度，連續兩個月，實驗結果顯示經皮給藥可以取代皮下注射的給藥方法，并且有緩釋效果。實施例9使用有效劑量(60-300單位/平方厘米)的basic FGF (珠海億勝生物制藥有限公司，按本發明方法制備成經皮治療抗體蛋白質制劑)和經皮給藥方法做面膜美容治療，隔日治療一次。實驗結果顯示在治療四次后面部皮膚質量和顏色明顯改善。實施例10聯合使用TNFR2-IL_lra制劑(杭州安瑞普生物科技有限公司制備)和使用有效劑量(30-300單位/平方厘米)的basic FGF (珠海億勝生物制藥有限公司，按本發明方法制備成經皮治療抗體蛋白質制劑)和經皮給藥方法做面膜美容治療，隔日治療一次。實驗結果顯示在治療三次后面部皮膚質量和顏色明顯改善。實施例11卡介苗是結核菌的減毒活疫苗，主要用來免疫兒童預防結核病、治療小兒哮喘性支氣管炎、預防感冒和提高免疫力治療腫瘤。我們使用皮內注射用卡介苗O. 25mg/0. 5ml對已有結核病感染的7例成人經皮給藥，用藥后2 8小時，病人產生局部紅斑、硬結或潰瘍，表明經皮給藥方法有效。本經皮實驗結果與7例皮內注射卡介苗O. 25mg/0. 5ml對比，產生了同樣的效果。這個經皮給藥方法能在不用醫護人員的情況下在家自行操作，有可能取代有疼痛的皮內注射方法和成為發展中國家可以廣泛使用的經皮卡介苗給藥方法。實施例12
流感疫苗主要是預防流行性感冒，每年在流行季節接種I次，免疫力可以持續一年。一般采用上臂三角肌肌肉注射，每針劑量30微克/0.5ml。2011年美國開始使用皮內注射的流感疫苗，結果表明皮內注射比肌肉注射更能產生保護性的反應。我們使用經皮方法給藥12例健康人，并和12例健康人肌肉注射接種HINI流感疫苗進行比較，實驗結果表明接種后21天采集血清檢測的HINI抗體應達水平，發現兩組人群100%都產生了免疫性保護。實施例13乙肝疫苗是一種預防乙型肝炎的藥物，主要使用方法為三角肌肌肉注射，同時有報道稱皮內接種效果更好。其大劑量長期使用也用來減少乙肝表面抗原和治療乙肝。我們將成人和兒重共14例，其中肌肉注射7例，經皮給藥7例，在首次給藥后的I個月、6個月再分別給藥20微克。I年后檢測乙肝表面抗體，兩組用藥結果均為100%陽性。表明經皮給藥是有效的方法。
實施例14純化透明質酸酶從牛睪丸中采用乙醇沉淀、殼聚糖沉淀、季銨鹽沉淀或者膜分離鹽析的方法分離純化獲得，其活性檢測方法是以過量透明質酸鈉或透明質酸鉀為底物，透明質酸酶催化反應，未反應的底物與血清蛋白形成渾濁液，在640nm處有吸光值，透明質酸活性單位濃度與吸光值降低值成正比。實施例15重組PH20可溶區段的表達和活性鑒定中性透明質酸酶全長片段為509個氨基酸(其中信號肽長35aa，加工過程切除)，由N490位的GPI錨定位點錨定于細胞質膜上。去除錨定位點后，不影響其發揮生理功能，并且C端可部分截短，最短到N464位仍有活性，但活性有所降低。將活性優化后需保留序列至N482。采用IgK信號肽相比采用天然信號肽PH20表達量更高，因此將IgK信號肽與PH20的N36-N482序列融合，轉入CHO細胞表達。CHO細胞完善的翻譯后加工系統，對于PH20糖基化與二硫鍵的正確配對都非常有利。活性檢測以過量透明質酸鈉或透明質酸鉀為底物，透明質酸酶催化反應，未反應的底物與血清蛋白形成渾濁液，在640nm處有吸光值，透明質酸活性單位濃度與吸光值降低值成正比。PH20N36-N482 核苷酸序列CTGAATTTCAGAGCACCTCCTGTTATTCCAAATGTGCCTTTCCTCTGGGCCTGGAATGCCCCAAGTGAATTTTGTCTTGGAAAATTTGATGAGCCACTAGATATGAGCCTCTTCTCTTTCATAGGAAGCCCCCGAATAAACGCCACCGGGCAAGGTGTTACAATATTTTATGTTGATAGACTTGGCTACTATCCTTACATAGATTCAATCACAGGAGTAACTGTGAATGGAGGAATCCCCCAGAAGATTTCCTTACAAGACCATCTGGACAAAGCTAAGAAAGACATTACATTTTATATGCCAGTAGACAATTTGGGAATGGCTGTTATTGACTGGGAAGAATGGAGACCCACTTGGGCAAGAAACTGGAAACCTAAAGATGTTTACAAGAATAGGTCTATTGAATTGGTTCAGCAACAAAATGTACAACTTAGTCTCACAGAGGCCACTGAGAAAGCAAAACAAGAATTTGAAAAGGCAGGGAAGGATTTCCTGGTAGAGACTATAAAATTGGGAAAATTACTTCGGCCAAATCACTTGTGGGGTTATTATCTTTTTCCGGATTGTTACAACCATCACTATAAGAAACCCGGTTACAATGGAAGTTGCTTCAATGTAGAAATAAAAAGAAATGATGATCTCAGCTGGTTGTGGAATGAAAGCACTGCTCTTTACCCATCCATTTATTTGAACACTCAGCAGTCTCCTGTAGCTGCTACACTCTATGTGCGCAATCGAGTTCGGGAAGCCATCAGAGTTTCCAAAATACCTGATGCAAAAAGTCCACTTCCGGTTTTTGCATATACCCGCATAGTTTTTACTGATCAAGTTTTGAAATTCCTTTCTCAAGATGAACTTGTGTATACATTTGGCGAAACTGTTGCTCTGGGTGCTTCTGGAATTGTAATATGGGGAACCCTCAGTATAATGCGAAGTATGAAATCTTGCTTGCTCCTAG ACAATTACATGGAGACTATACTGAATCCTTACATAATCAACGTCACACTAGCAGCCAAAATGTGTAGTCAAGTGCTTTGCCAGGAGCAAGGAGTGTGTATAAGGAAAAACTGGAACTCAAGTGACTATCTTCACCTCAACCCAGATAATTTTGCTATTCAACTTGAGAAAGGTGGAAAGTTCACAGTACGTGGAAAACCGACACTTGAAGACCTGGAGCAATTTTCTGAAAAATTTTATTGCAGCTGTTATAGCACCTTGAGTTGTAAGGAGAAAGCTGATGTAAAAGACACTGATGCTGTTGATGTGTGTATTGCTGATGGTGTCTGTATAGATGCTTTTCTAAAACCTCCCATGGAGACAGAAGAACCTCAAATTTTCTACPH20N36-N482 氨基酸序列
LNFRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLDMSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYYPYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITFYMPVDNLGMAVIDffEEffRPTffARNWKPKDVYKNRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKAGKDFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYPSIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKIPDAKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTFGETVALGASGIVIWGTLSIMRSMKSCLLLDNYMETILNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKPTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTDAVDVCIADGVCIDAFLKPPMETEEPQIFY實施例16PH20-Fc融合蛋白表達與活性鑒定通過重疊PCR將PH20N36-N482與IgG2的Fe段融合，分別將IgG2的Fe段融合在PH20的C端與N端，然后與IgK信號肽重疊，與克隆載體連接測序正確后連入表達載體，轉染CHO細胞表達，經過克隆篩選挑取高表達細胞株，對細胞培養液進行分離純化，獲得PH20-FC的重組蛋白。活性檢測以過量透明質酸鈉或透明質酸鉀為底物，透明質酸酶催化反應，未反應的底物與血清蛋白形成渾濁液，在640nm處有吸光值，透明質酸活性單位濃度與吸光值降低值成正比。收集重組細胞的細胞培養液進行小鼠皮下臺盼藍擴散試驗，以透明質酸酶提純產品作為陽性對照，結果證明培養液中蛋白活性約lU/ug。PH20-FC核苷酸序列CTGAATTTCAGAGCACCTCCTGTTATTCCAAATGTGCCTTTCCTCTGGGCCTGGAATGCCCCAAGTGAATTTTGTCTTGGAAAATTTGATGAGCCACTAGATATGAGCCTCTTCTCTTTCATAGGAAGCCCCCGAATAAACGCCACCGGGCAAGGTGTTACAATATTTTATGTTGATAGACTTGGCTACTATCCTTACATAGATTCAATCACAGGAGTAACTGTGAATGGAGGAATCCCCCAGAAGATTTCCTTACAAGACCATCTGGACAAAGCTAAGAAAGACATTACATTTTATATGCCAGTAGACAATTTGGGAATGGCTGTTATTGACTGGGAAGAATGGAGACCCACTTGGGCAAGAAACTGGAAACCTAAAGATGTTTACAAGAATAGGTCTATTGAATTGGTTCAGCAACAAAATGTACAACTTAGTCTCACAGAGGCCACTGAGAAAGCAAAACAAGAATTTGAAAAGGCAGGGAAGGATTTCCTGGTAGAGACTATAAAATTGGGAAAATTACTTCGGCCAAATCACTTGTGGGGTTATTATCTTTTTCCGGATTGTTACAACCATCACTATAAGAAACCCGGTTACAATGGAAGTTGCTTCAATGTAGAAATAAAAAGAAATGATGATCTCAGCTGGTTGTGGAATGAAAGCACTGCTCTTTACCCATCCATTTATTTGAACACTCAGCAGTCTCCTGTAGCTGCTACACTCTATGTGCGCAATCGAGTTCGGGAAGCCATCAGAGTTTCCAAAATACCTGATGCAAAAAGTCCACTTCCGGTTTTTGCATATACCCGCATAGTTTTTACTGATCAAGTTTTGAAATTCCTTTCTCAAGATGAACTTGTGTATACATTTGGCGAAACTGTTGCTCTGGGTGCTTCTGGAATTGTAATATGGGGAACCCTCAGTATAATGCGAAGTATGAAATCTTGCTTGCTCCTAGACAATTACATGGAGACTATACTGAATCCTTACATAATCAACGTCACACTAGCAGCCAAAATGTGTAGTCAAGTGCTTTGCCAGGAGCAAGGAGTGTGTATAAGGAAAAACTGGAACTCAAGTGACTATCTTCACCTCAACCCAGATAATTTTGCTATTCAACTTGAGAAAGGTGGAAAGTTCACAGTAC
GTGGAAAACCGACACTTGAAGACCTGGAGCAATTTTCTGAAAAATTTTATTGCAGCTGTTATAGCACCTTGAGTTGT
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CCTGTCTCCGGGTAAAPH20-FC氨基酸序列LNFRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLDMSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYYPYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITFYMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNffKPKDVYKNRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKAGKDFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYPSIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKIPDAKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTFGETVALGASGIVIWGTLSIMRSMKSCLLLDNYMETILNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKPTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTDAVDVCIADGVCIDAFLKPPMETEEPQIFYVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK實施例17PH20-HSA融合蛋白表達與活性鑒定成熟HSA(人血清白蛋白)為585個氨基酸，包含結構同源的3個區段。我們通過重疊PCR將PH20N36-N482與HSA的第一區段(N1-N197)融合，分別將HSA融合在PH20的C端和N端，然后與IgK信號肽重疊，與克隆載體連接測序正確后連入表達載體，轉染CHO細胞表達，經過克隆篩選挑取高表達細胞株，對細胞培養液進行分離純化，獲得PH20-HSA 191的重組蛋白。活性檢測以過量透明質酸鈉或透明質酸鉀為底物，透明質酸酶催化反應，未反應的底物與血清蛋白形成渾濁液，在640nm處有吸光值，透明質酸活性單位濃度與吸光值降低值成正比。PH20-HSA核苷酸序列CTGAATTTCAGAGCACCTCCTGTTATTCCAAATGTGCCTTTCCTCTGGGCCTGGAATGCCCCAAGTGAATTTTGTCTTGGAAAATTTGATGAGCCACTAGATATGAGCCTCTTCTCTTTCATAGGAAGCCCCCGAATAAACGCCACCGGGCAAGGTGTTACAATATTTTATGTTGATAGACTTGGCTACTATCCTTACATAGATTCAATCACAGGAGTAACTGTGAATGGAGGAATCCCCCAGAAGATTTCCTTACAAGACCATCTGGACAAAGCTAAGAAAGACATTACATTTTATATGCCAGTAGACAATTTGGGAATGGCTGTTATTGACTGGGAAGAATGGAGACCCACTTGGGCAAGAAACTGGAAACCTAAAGATGTTTACAAGAATAGGTCTATTGAATTGGTTCAGCAACAAAATGTACAACTTAGTCTCACAGAGGCCACTGAGAAAGCAAAACAAGAATTTGAAAAGGCAGGGAAGGATTTCCTGGTAGAGACTATAAAATTGGGAAAATTACTTCGGCCA
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TCTGCCAAACAGAGA PH20-HSA氨基酸序列LNFRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLDMSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYYPYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITFYMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYKNRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKAGKDFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYPSIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKIPDAKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTFGETVALGASGIVIWGTLSIMRSMKSCLLLDNYMETILNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKPTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTDAVDVCIADGVCIDAFLKPPMETEEPQIFYDAHKSPVCHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQR盡管發明人已經對本發明的技術方案做了較為詳細的闡述和列舉，應當理解，對于本領域一個熟練的技術人員來說，對上述實施例作出修改和/或變通或者采用等同的替代方案是顯然的，都不脫離本發明的精神實質。
權利要求
1.一種經皮給藥方法，包括 對受試者皮膚進行消毒； 用微針陣列章對受試者皮膚進行預處理以產生穿透皮膚角化層的微孔，并不將微針留在皮膚中； 將裝載待遞送藥物和促滲劑透明質酸酶經皮給藥倉貼粘貼在受試者皮膚上，并保持一段時間持續給藥； 和將所述經皮給藥倉貼從受試者皮膚上取下， 其中，所述經皮給藥倉貼中包含抗菌防腐劑。
2.權利要求I的方法，其中在臨使用前，將待遞送藥物、透明質酸酶和抗菌防腐劑的液體制劑施加到所述經皮給藥倉貼的給藥倉中。
3.權利要求I的方法，其中所述待遞送藥物、透明質酸酶和抗菌防腐劑已經預先裝載到所述經皮給藥倉貼的給藥倉中。
4.以上權利要求之任一項的方法，其中所述待遞送藥物選雙體藥物TNFR2-Fc-IL-lra、IL-lra-Fc-IL-18bp、抗 IL-12 抗體、抗 IL-23 抗體、抗 OPGL 抗體、自由促生長激素釋放激素、GLP-I類似物、生長抑素、抗利尿激素、胸腺五肽、腦鈉素、心鈉素、胰島素、干擾素、basic FGF、紅細胞生成素、卡介苗、流感疫苗和乙肝疫苗構成的組。
5.以上權利要求之任一項的方法，其中所述透明質酸酶為天然提取的或重組的透明質酸酶，特別優選的是經生物工程改造的重組長效透明質酸酶。
6.以上權利要求之任一項的方法，其中所述抗菌防腐劑為苯扎氯銨。
7.以上權利要求之任一項的方法，其中所述微針陣列章的微針為0.10-0. 25mm。
8.以上權利要求之任一項的方法，其中所述時間段為0.5-10小時。
9.用于以上權利要求之任一項的方法的經皮給藥制劑，其組成包括如下組分 主要起效成分、透明質酸酶0. 01-10單位/ml、乙酸鈉10-20mM、苯扎氯銨0. 005% mg/ml、羧甲基纖維素 0. 5% mg/ml、吐溫 800. 005-0. 01mg/ml、精氨酸 0. 05-0. I % mg/ml、組胺5_15mM0
10.用于權利要求9的經皮給藥制劑中主要起效成分可按需選用以下藥物TNFR2-Fc-IL-lra 2. 5_20mg/ml (pH 為 4. 5-5. 0)、促生長激素釋放激素 0. 1-0. 3mg (每0.3-0. 5ml 制劑)、GLP-I 類似物 0. 1-0. 5mg (每 0. 3-0. 5ml 制劑)、胸腺五肽 l_6mg (每0.2-0. 6ml制劑)、生長抑素0. 2-0. 6mg(每0. 2-0. 6ml制劑)、抗利尿激素0. 2-0. 6mg(每0.2-0. 6ml 制劑)、腦鈉素 0. 2-0. 6mg(每 0. 2-0. 6ml 制劑)、心鈉素 0. 2-0. 6mg(每0.2-0. 6ml 制劑)、干擾素 0. 2-0. 6mg (每 0. 2-0. 6ml 制劑)、卡介苗 0. 25mg (每 0. 5ml 制劑)、流感疫苗30微克(每0. 5ml制劑)、乙肝疫苗20微克(每0. 5ml制劑)。
11.用于以上權利要求之任一項的方法的經皮給藥系統，包括經皮給藥倉貼，和微針陣列章，用于對受試者皮膚進行預處理，以產生穿透皮膚角化層的微孔。
12.權利要求11的經皮給藥系統，還包括用于容納所述待遞送藥物、透明質酸酶和/或抗菌防腐劑的液體制劑的一個或多個容器。
全文摘要
一種經皮給藥方法、制劑和系統。本發明提供了一種經皮給藥方法，包括對受試者皮膚進行消毒；用微針陣列章對受試者皮膚進行預處理，以產生穿透皮膚角化層的微孔；將裝載待遞送藥物、透明質酸酶的經皮給藥倉貼粘貼在受試者皮膚上，并保持一段時間；和將所述經皮給藥倉從受試者皮膚上取下；其中，所述經皮給藥倉貼中包含抗菌防腐劑。
文檔編號A61K47/42GK102805896SQ20121006396
公開日2012年12月5日 申請日期2012年3月6日 優先權日2011年5月30日
發明者惠覓宙 申請人:惠覓宙, 徐江運