一種抗流感病毒的單鏈抗體及其制備方法和應用的制作方法

專利名稱：一種抗流感病毒的單鏈抗體及其制備方法和應用的制作方法
一種抗流感病毒的單鏈抗體及其制備方法和應用技術領域
本發明屬于生物工程領域。本發明涉及一種抗Hmi流感病毒的單鏈抗體^Fv及其制備方法和應用，以及編碼該單鏈抗體的基因，含有該基因的載體和宿主細胞等。
背景技術：
A型流感病毒能感染除人類以外的各種禽類、哺乳類動物如豬、馬及海生哺乳動物等，引起急性呼吸道傳染病，其流行極大地危害人類健康并對世界經濟造成巨大損失， 是難以根治的群發性疾病之一。根據血凝素蛋白(HemagglutinimHA)和神經氨酸酶 (Neuraminidase, ΝΑ)蛋白抗原性的差異，至今為止分別已鑒定出16種亞型和9種亞型。 目前全世界各地相繼從豬只上分離到至少有Η1Ν1、Η1Ν2、Η1Ν7、Η2Ν3、Η3Ν2、Η4Ν6、Η5Ν1、 Η9Ν2等數十種不同血清亞型的流感病毒，其中與表現臨床癥狀聯系最為緊密的又是Hmi 禾口 Η3Ν2。
2009年3月，首發于墨西哥的甲型Hmi流感在短期內迅速蔓延至全球，截止2010 年8月，包括我國在內全球有214個國家和地區報告發現“甲型Hmi流感”，確診病例至少有18449人死亡，大有引發全球流感大流行之勢，對世界經濟及社會穩定造成了巨大的影響，抗體及相關試劑的研究對流感的診斷和預防有非常重要公共衛生學意義。雖然流感病毒亞型眾多，但其NP相對保守，研究表明，不同宿主分離的病毒株發現，NP基因相當保守， 氨基酸差別最多不超過11 %，具有型和種屬的特異性，是流感病毒型的分類和診斷的基礎， 也是研究病毒免疫學反應及研制疫苗的重要對象。M基因編碼蛋白中的Μ2蛋白是A型流感病毒所特有的一種結構保守的非糖基化跨膜蛋白，而Μ2蛋白的膜外區氨基酸序列(第1 25位)高度保守，且Μ2蛋白的抗血清有抑制流感病毒復制的功能，此外病毒血凝素與病毒侵入宿主細胞相關，它的抗體能中和病毒的感染性，可見將流感病毒抗體基因作為抗病基因理論上是可行的。尋找病毒的這些蛋白對應的抗體基因，用來預防、控制和治愈流感病毒的感染，而這些需要快速而高效地篩選到表達特異性抗體及其基因的平臺-噬菌體抗體庫技術。
此外，克隆抗體的可變區基因并將其導入動物受精卵進行種系轉化，培育含該種基因的轉基因動物，將為抗病毒感染育種提供又一條新途徑。國外已有轉抗體的可變區基因的抗病轉基因鼠的報道。國內還未見類似研究報道，但利用噬菌體抗體庫技術快速獲得抗病毒單鏈抗體的基因早已變為現實，動物轉基因技術也處在發展和完善中。只要將兩種技術有機結合起來，有望獲得抗體的可變區基因的抗病毒育種動物。
另外在免疫治療方法中，因抗體的種間異源性及分子量過大，可造成宿主的防御性反應，而單鏈抗體^Fv則可以避免上述治療難題JcFv是具有完全抗體結合位點的最小抗體片段，大小為完整抗體的1/6，具有以下優點(1)保持了抗體的特異性，大大減少了免疫原性；(2)組織穿透力強，分子量小，易進入靶標實體的微循環，且體內清除也較快；(3) 無FC段，可作為導向載體，以酶或細胞因子及藥物連接構建雙功能抗體，利于治療與診斷； (4)易于基因操作和基因工程的大量生產；(5)可在多種不同的原核、真核表達系統中表達，如大腸桿菌、酵母、植物、昆蟲、哺乳動物細胞等表達系統。因此，抗豬流感噬菌體單鏈抗體技術具有重大的理論意義和應用價值。
目前關于流感病毒單鏈抗體kFv的研究國內未見報道，相關專利的申請國內外亦未見報道。發明內容
因此，本發明要解決的技術問題就是提供抗流感病毒的單鏈抗體及其制備方法和應用。
本發明解決上述技術問題的技術方案如下
本發明的技術方案之一是一種抗流感病毒的單鏈抗體，其是下列蛋白質之一
1)由抗體重鏈可變區和輕鏈可變區通過接頭肽連接而成的單鏈抗體，其中輕鏈可變區的氨基酸序列和重鏈可變區氨基酸序列分別如序列表中SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2 所示；
2)如1)所述的單鏈抗體經過改造得到的衍生抗體，所述的改造包括氨基酸的缺失、取代或插入，并且該衍生抗體具有抗流感病毒的抗體活性。
其中，所述的接頭肽可以是常規的。優選的，所述的接頭肽是15-20個氨基酸縮合而成的短肽。更優選的，其氨基酸序列是GGGGSGGGGSGGGGS。該15個氨基酸的柔性鏈接將抗體重鏈可變區和輕鏈可變區連接構成單鏈抗體。
本發明的技術方案之二是編碼所述的抗體的基因。
優選的，所述的基因是下述基因之一
1)該基因編碼抗體輕鏈可變區和重鏈可變區的核苷酸序列分別如序列表中SEQ ID NO. 3 和 SEQ ID NO. 4 所示；
2)在嚴謹條件下該基因編碼抗體輕鏈可變區和重鏈可變區的核苷酸序列分別可與SEQ ID NO. 3和SEQ ID N0. 4限定的DNA序列雜交，且該基因編碼的蛋白質具有抗流感病毒的抗體活性。
本發明的技術方案之三是含有所述基因的表達載體。
其中，所述的表達載體可以為本領域常規的各種載體，只要能在宿主內復制和穩定表達，任何質粒和載體都可以用。表達載體的一個重要特征是通常含有復制點、啟動子、 標記基因和翻譯調控元件。如市售的質粒(大腸桿菌中合適載體有PLG338、pACYC184、 pBR322、pUC18、pUC19、pKC30、pR印4、pHSl、pHS2、pMBL 等)、粘粒(pHZ132)、噬菌體或病毒載體(反轉錄病毒載體，腺病毒載體)等所述質粒代表一小部分的可能質粒，其他質粒為技術人員公知。優選pET28a質粒。可以采用本領域熟知的方法構建含有所述抗流感病毒的單鏈抗體的重組表達載體，如體外重組DNA技術，DNA合成技術和體內重組技術等。所述抗流感病毒的單鏈抗體的基因可以有效連接到表達載體的適當啟動子上，以指導mRNA的合成。所述的啟動子可以是常規已知的各種啟動子，只要能在宿主細胞中發揮啟動子的功能即可。如大腸桿菌的Iac或trp啟動子、噬菌體啟動子、反轉錄病毒和其它一些已知的可控制基因在原核或真核細胞或其病毒重磅表達的啟動子。所述表達載體還包括翻譯起始用的核糖體結合位點和轉錄終止子。此外，所述的表達咋提還可以包含一個或多個選擇性標記基因，以提供用于選擇轉化的宿主細胞的表型性狀，如真核細胞培養用的二氫葉酸還原酶基因、新霉素抗性基因以及綠色熒光蛋白(GFP)基因或用于大腸桿菌的四環素或氨芐青霉素抗性基因等。
本發明的技術方案之四是含有所述表達載體的宿主。
所述的宿主細胞可以是原核細胞，如細菌細胞；低等真核細胞，如酵母細胞；高等真核細胞，如哺乳動物細胞。代表性例子有大腸桿菌，鏈霉菌；鼠傷寒沙門氏菌的細菌細胞；真核細胞如酵母、植物細胞；果蠅S2或Sf9等昆蟲細胞；CHO、COS,293細胞或Bowes和色素瘤細胞等動物細胞。所述的宿主細胞優選大腸桿菌。
本發明的技術方案之五是一種制備所述的抗Hmi流感病毒的單鏈抗體的方法， 包括將所述的表達載體轉化、轉導或轉染宿主細胞，培養宿主細胞，從培養物中分離蛋白， 得到抗Hmi流感病毒單鏈抗體。
可用本領域技術人員熟知的常規技術，將重組DNA轉化宿主細胞，培養轉化子，誘導表達目的蛋白，并對重組蛋白進行分離純化。
培養基和培養條件均可為培養出發宿主的培養基和培養條件。
重組蛋白的分離純化方法也可以采用本領域常規的重組蛋白的分離方法，表達的蛋白為包涵體時，還包括對包涵體復性的步驟。
本發明的技術方案之六是所述的抗體在制備抗流感藥物中的應用。
擴增本發明單鏈抗體基因的任意片段的引物對也在本發明的保護范圍之內。
本發明所用的原料或試劑除特別說明之外，均市售可得。
相比于現有技術，本發明的有益效果如下
本發明的單鏈抗體是鼠源性的，能夠抗Hmi流感病毒、具有中和活性。分子量約為27kD。融合表達時，加上融合表達的標簽蛋白(6kD)分子量一共約33KD。本發明的單鏈抗體能夠特異識別Hmi流感病毒，而且能夠阻斷病毒與天然血清的結合。
本發明單鏈抗體基因可制備獲得雙價或多價單鏈抗體、細胞內抗體及其他小分子抗體，或者作為靶向運載工具。
本發明單鏈抗體能用來診斷、預防、控制和治愈Hmi流感病毒的感染，或者用于抗病毒的轉基因動物育種，用于制備相關的藥物或試劑。


以下結合

本發明的特征和有益效果。
圖1顯示SIVHLl單鏈抗體的核苷酸序列和氨基酸序列，在重鏈可變區和輕鏈可變區序列之間是所述的柔性接頭。
圖2顯示SIVHLl的重鏈可變區VH的核苷酸序列和氨基酸序列，在該核苷酸序列下是預期的氨基酸序列，在氨基酸序列下劃線的是所述VH-⑶Rl、VH-⑶R2和VH-⑶R3。
圖3顯示SIVHLl的輕鏈可變區VL的核昔酸序列，在該核昔酸序列下是預期的氨基酸序列。在氨基酸序列下劃線的是所述VL-⑶Rl、VL-⑶R2和VL-⑶R3。
圖4為PCR擴增的抗體重、輕鏈可變區基因的瓊脂糖電泳圖。M :2000bpDNAmarker ； 1，2 輕鏈可變區VL基因擴增產物；3，4 重鏈可變區VH基因擴增產物。
圖5為單鏈抗體ScFv基因的PCR產物電泳圖。M :2000bp DNA marker ；1,2, 3,4 SOE PCR組裝的scFv片段。
圖6為載體pCANTAB5E-kFv結構示意圖及多克隆位點。
圖7顯示單鏈抗體多樣性的分析。
圖8 SIVHLl-pET28a(+)重組質粒酶切鑒定凝膠電泳圖。Ml :15000bp DNA分子質量標準；M2 :2000bp DNA分子質量標準；1，2為重組質粒pET28a (+)-SIVHLl的雙酶切鑒定。
圖9其中a是SIVHLl重鏈VH的三維結構圖，b是輕鏈VL的三維結構圖，c是SIVHLl 全長的三維結構圖。
圖10左圖是可溶性的SIVHLl-Histag重組表達蛋白的SDS-PAGE電泳圖，描述表達的SIVHLl經過重折疊純化的結果，右圖是利用WesternBlot方法鑒定分離純化得到的 SIVHLl。M1, M2為蛋白分子量Marker ；1和2，純化的SIVHLl-Histag重組蛋白，3和4，空白對照；5,6為抗Histag抗體檢測SIVHLl-Histag蛋白。
圖11是一曲線圖，描述不同濃度單鏈抗體SIVHLl與A/PR/8/Hmi流感病毒特異性結合的間接ELISA實驗結果。
圖12是一曲線圖，描述不同濃度單鏈抗體SIVHLl與兩株國內分離的A型Hmi流感病毒特異性結合的ELISA實驗結果。
具體實施方式
本發明人經過深入而廣泛的研究，獲得了一株抗A型Hmi流感病毒的單鏈抗體。 單鏈抗體免疫原性小，組織穿透力強，易進入靶標，非常有利于生產操作。本發明提供的單鏈抗體具有流感病毒的中和活性，能夠阻斷流感病毒與血清的結合，對Hmi流感病毒具有特異性親和力。本發明也提供了該單鏈抗體的制備方法和應用。
本發明人通過構建噬菌體展示單鏈抗體庫，通過“富集一洗脫一富集”的循環操作，從中篩選得到該單鏈抗體。進而本發明人分析獲得了該單鏈抗體的基因，并將該基因用于重組載體中，構建了表達該單鏈抗體的基因工程菌，從而可以大量簡單的采用生物工程的方法制備該單鏈抗體，從而完成了本發明。
噬菌體展示單鏈抗體庫的構建、篩選
(1)設計和合成的小鼠抗體輕、重鏈混合引物，利用引物從Hmi流感病毒感染的小鼠脾細胞基因中經PCR擴增獲得其輕、重鏈可變區基因片段，通過寡核苷酸鏈(Linker) 將所述兩片段連接，構建出單鏈抗體基因片段；
(2)經重疊延伸PCR(SOE-PCR)，通過柔性多肽Linker接頭(GlyJer)按 VH-Linker-VL方式將VH基因和VL基因隨機拼接成kFv基因片段。將kFv基因和pCANTAB 5E載體分別雙酶切(sfil和NotI)后連接，轉化宿主菌TG1，涂布SOB-AG平板，30°C培養過夜。挑取多個單菌落培養并提取重組質粒，利用表達載體PCANTAB5E上的通用引物進行PCR 鑒定并測序，以此確定抗體的多樣性。
其中擴增單鏈抗體重鏈VH的引物為
VHa 5-GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCC ATGGCCSAGGTSMARCTGCAGSAGTC-3 ；
VHb :5-GCCAGAGCCACCTCCGCCTGAACCGCCTCCACC TGAGGAGACGGTGACCGTGGT-3。
擴增單鏈抗體輕鏈VL的引物為
VLc 5-TCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCGGACATYGAGCTCACYCAGTCTCC-3
VLd :5-GAGTCATTCTGCGGCCGCCCGTTTBAKYTCCARCTTKGTSCC-3。
其中抗體重鏈可變區具有如圖2所示的核苷酸序列和氨基酸序列。
其中抗體輕鏈可變區具有如圖3所示的核苷酸序列和氨基酸序列。
(3)重組噬菌粒轉化琥珀抑制型大腸桿菌TG1，經過輔助噬菌體M1I07拯救，構建噬菌體單鏈抗體庫。以Hmi流感病毒為抗原包被免疫管，經過3輪的親和富集篩選，通過 Phage-ELISA鑒定陽性重組抗體，對陽性克隆噬菌體進行測序，獲得對應的基因。并用病毒阻斷ELISA和夾心ELISA所篩選獲得的陽性克隆噬菌體kFv活性進行測定。
(4)將篩選獲得的陽性抗體基因與與蛋白表達載體pETj8a-c(+)分別酶切并連接，轉化至非琥珀抑制型大腸桿菌BL21(DE3)中進行IPTG誘導表達，對以包涵體形式表達的單鏈抗體進行重折疊復性，從而獲得抗豬流感的可溶性單鏈抗體，該可溶性單鏈抗體是目的單鏈抗體基因片段與表達載體上的His-tag標簽融合表達的產物，以該單鏈抗體為一抗，以抗His-tag抗體為二抗，采用間接ELISA技術檢測目的單鏈抗體，證實該單鏈抗體可特異性識別Hmi流感病毒。
抗流感病毒的單鏈抗體
本發明提供的抗Hmi流感病毒的單鏈抗體，1)是由抗體重鏈可變區和輕鏈可變區通過接頭肽連接而成的單鏈抗體，其中輕鏈可變區的氨基酸序列和重鏈可變區氨基酸序列分別如序列表中SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2所示。而其中的接頭肽是常規的，即常規的單鏈抗體中連接抗體重鏈可變區和輕鏈可變區的接頭肽都可以在本發明中使用，優選的是15-20個氨基酸縮合而成的短肽，最佳的氨基酸序列為GGGGSGGGGSGGGGS，其是15個氨基酸的柔性鏈接。
本發明的一最佳實施例為抗Hmi流感病毒的單鏈抗體(SIVHLl)，全長732個核苷酸，有244個氨基酸(圖1)。具有122個氨基酸的重鏈可變區(圖幻和107個氨基酸的輕鏈可變區(圖幻，通過15個氨基酸的柔性鏈接(GGGGSGGGGSGGGGS)。
本發明提供的單鏈抗體具有Hmi流感病毒的中和活性，能夠阻斷流感病毒與血清的結合，對Hmi流感病毒具有特異性親和力。
本發明提供的抗流感病毒的單鏈抗體也可以是2、如1)所述的單鏈抗體經過改造得到的衍生抗體，所述的改造包括氨基酸的缺失、取代或插入，并且該衍生抗體具有抗流感病毒的抗體活性。其中，缺失、取代或插入的氨基酸的數量是一到幾個。所述的“幾個”是指二個至小于100個，更佳的小于30個。比如添加一個外分泌信號肽或者表達序列標簽的融合蛋白，只要該融合蛋白還是具有抗流感病毒的抗體活性，都在本發明的保護范圍之內。 本發明的一較佳實例是所述的單鏈抗體和His-tag的融合蛋白，其中，His-tag由多個如6 個His氨基酸組成。也就是說本發明發現只要由1)衍生的蛋白質抗流感病毒的抗體活性， 且衍生方式如上所述，則都可以達到本發明的發明目的。所述的單鏈抗體可以從重組表達該單鏈抗體的表達子中分離獲得，也可以人工合成獲得。
根據本發明，在如SEQ ID No. 1或2所示氨基酸序列中進行1_3個氨基酸殘基的突變，也可獲得上述衍生抗體，但仍然保持抗流感病毒的抗體活性。
本發明中，術語“單鏈抗體”，又稱kFv，是在DNA水平將抗體重鏈可變區基因和輕鏈可變區基因用一段適當的寡聚核昔酸(接頭)連起來，使之表達成為一條單一的膚鏈。 ^Fv分子量小，結構簡單，是具有完整抗原結合位點的最小抗體片段。
天然抗體包括重鏈(H鏈)和輕鏈(L鏈)。鏈間由二硫鍵和非共價鍵聯結。重鏈和輕鏈都分為恒定區和可變區。可變區位于"Y"的兩臂末端。其中包括 Fab (antigen-binding fragment，抗原結合片段)，決定了該抗體結合抗原的特異性。“Y“ 的柄部稱FC(crystalline fragment,結晶片段)，糖結合在FC上。而單鏈抗體僅僅包括重鏈可變區基因和輕鏈可變區，不包括恒定區，也不包括FC，分子量大大減小。單鏈抗體更易于進行表達和在基因水平進行改造。易于在多種表達系統中如原核細胞、酵母、植物昆蟲及哺乳類細胞中表達，從而可以大量生產且成本低。異源性低、穿透性強、廓清快。不含有Fc 段、不與Fc受體結合，可減少因廣泛分布的Fc受體而帶來的不利影響，因而具有廣泛的應用前景。可用作導向載體對臨床某些疾病進行顯像定位診斷和導向治療，中和病毒和毒素， 細胞內免疫及免疫檢測等方面。
本發明的單鏈抗體的重鏈可變區和輕鏈可變區包括的互補決定區⑶R1、⑶R2和 ⑶R3的序列見圖2禾口 3。
單鏈抗體的編碼基因
本發明的單鏈抗體或衍生抗體的編碼基因是常規的各種編碼所述氨基酸序列的基因，只要該基因翻譯出來的氨基酸序列是本發明的單鏈抗體或衍生抗體。如本領域技術人員所知，抗體重鏈可變區和輕鏈可變區可以是編碼序列表中SEQ ID No. 1(或NoJ)所示氨基酸序列的其他任何堿基序列。例如，由于密碼子的簡并性，編碼SEQ ID No. 1(或2)的氨基酸序列的堿基序列不僅僅局限于SEQ ID No.3(或4)。而其中，一較佳實例是編碼抗體輕鏈可變區的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO. 3所示；編碼抗體重鏈可變區的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO. 4所示。
本發明也可以通過適當引入替換、缺失、改變、插入或增加來提供一個多聚核苷酸的同系物。本發明中多聚核苷酸的同系物可以通過對堿基序列SEQ ID NO. 3,SEQ ID NO. 4 的一個或多個堿基在保持酶活性范圍內進行替換、缺失或增加來制得。多聚核苷酸的同系物也指啟動子突變體。在所述的堿基序列之前的啟動子或信號序列可通過一個或多個核苷酸的替換、插入或缺失而改變，但這些改變對啟動子的功能沒有負面影響。而且通過改變啟動子的序列或甚至用來自不同種生物體的更有效的啟動子完全替換，可提高目標蛋白的表達水平，例如對本發明有利的調節序列可來自于革蘭氏陰性菌的啟動子中，如cos、tac、 trp、tet、trp-tet、Ipp、lac、T7、T5、T3、gal、trc、ara、SP6 等；或存在于革蘭氏陽性啟動子amy和SP02中；或來自于真菌或酵母啟動子ADC1、AC、P_60、CYC1、GAPDH、TEF、rp^、ADH 等；或者來自Hansenula的丙酮酸脫羧酶啟動子或人工啟動子等。
本發明的單鏈抗體或衍生抗體的編碼基因也可以是在嚴謹條件下其抗體輕鏈可變區和重鏈可變區的核苷酸序列分別可與SEQ ID N0. 3和SEQ ID N0. 4限定的DNA序列雜交，且該基因編碼的蛋白質具有抗Hmi流感病毒的抗體活性。其中，在嚴謹條件下進行雜交可根據“分子克隆”中描述的方式進行Cold Spring Harbor Laboratory I^ress，分子生物學中的通用方案(Current Protocols in Molecular Biology)。具體來說，雜交可以按照如下步驟進行，將一個載有被轉錄的待測DNA或RNA分子的膜與一個標記探針在雜交緩沖液中進行雜交。雜交緩沖液的組成為0. Iwt% SDS、5wt%硫酸右旋糖苷、一盒1/20的稀釋抑制劑以及2 8XSSC。20XSSC為3M氯化鈉和0. 3M的檸檬酸組成的溶液。雜交溫度為50 70°C。在培養幾個小時或過夜后，用清洗緩沖液清洗膜。清洗溫度為室溫，更優選為雜交溫度。清洗緩沖液的組成為6XSSC+0. Iwt % SDS溶液，更優選為5XSSC+0. Iwt %SDS0當用這種清洗緩沖液清洗完膜后，就可以通過在DNA或RNA分子內被雜交的探針上的標記來識別DNA或RNA分子。
含有單鏈抗體基因的表達載體
本發明所述的重組表達載體可通過本領域常規方法將本發明的單鏈抗體基因連接于各種表達載體上構建而成。所述的載體可為本領域常規的各種載體，如市售的質粒 (大腸桿菌中合適載體有 pLG338、pACYC184、pBR322、pUC18、pUC19、pKC30、pR印4、pHSl、 pHS2、pMBL等)、粘粒(pHZ13》、噬菌體或病毒載體(反轉錄病毒載體，腺病毒載體)等所述質粒代表一小部分的可能質粒，其他質粒為技術人員公知。本發明所述重組載體較佳地采用pET28a質粒。
含有單鏈抗體表達載體的宿主
本發明所述所述的宿主微生物可為本領域常規的各種宿主微生物，只要能滿足重組表達載體可穩定的自行復制，且所攜帶的本發明的還原酶基因可被有效表達即可。本發明優選大腸桿菌，更優選大腸埃希氏菌(E. coli)BL21(DE3)或大腸埃希氏菌(E. coli) DH5ci。將本發明前述重組表達質粒通過常規轉化方法，轉化至E. coli BL2KDE3)中，即可得本發明優選的基因工程菌株。
單鏈抗體的制備方法
技術領域：
本發明制備所述的抗流感病毒的單鏈抗體的方法可以是人工合成，可參見各種文獻，如多肽的液相合成或者固相合成等。也可以是利用生物工程的方法，制備表達本發明的單鏈抗體的表達子，從表達子中生產制備得到。包括將所述的表達載體轉化、轉導或轉染宿主細胞，培養宿主細胞，從培養物中分離蛋白，得到抗流感病毒單鏈抗體。其中，所述的重組表達轉化體同前述介紹，本發明可通過將本發明的重組表達子轉化至宿主微生物得到。其中，所述的培養重組表達轉化體中所用的培養基可為本領域任何可使轉化體生長并產生本發明的腈水解酶的培養基，優選LB培養基蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl IOg/ L，pH 7.0。培養方法和培養條件沒有特殊的限制，培養方法和培養條件可以根據宿主類型和培養方法等因素的不同按本領域普通知識進行適當的選擇，只要使轉化體能夠生長并產生本發明所述的單鏈抗體即可。其他培養轉化體具體操作均可按本領域常規操作進行，優選下述方法將本發明涉及的的重組大腸桿菌(優選E. coli BL2KDE3)重組表達轉化體接種至含卡那霉素的LB培養基中培養，當培養液的光密度OD6tltl達到0. 5-0. 7時，在終濃度為 0. 1-l.Ommol/L(優選0. 5mmol/L)的異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)的誘導下，高效表達本發明的單鏈抗體。目的蛋白主要以包涵體形式表達，對包涵體蛋白進行復性并純化。
單鏈抗體的應用
本發明的單鏈抗體是鼠源性的，能夠抗流感病毒、具有中和活性。分子量約為 27kD。融合表達時，加上融合表達的標簽蛋白(6kD)分子量一共約33KD。本發明的單鏈抗體能夠特異識別Hmi流感病毒，而且能夠阻斷病毒與天然血清的結合。可用于制備防治豬流感病的產品，能用來預防、控制和治愈Hmi流感病毒的感染，或者用于抗病毒的轉基因動物育種，用于制備相關的藥物或試劑，及用于豬流感相關的診斷性研究、治療性研究。
將兩個或兩個以上的scFv連接成具有多個抗原結合位點的多價scFv，在結構、功能上更接近親本抗體，與抗原結合比單價scFv更敏感，親和力更高，幾乎與親本抗體的抗原結合功能一致。本發明單鏈抗體基因可制備獲得雙價或多價單鏈抗體、細胞內抗體及其他小分子抗體，或者作為靶向運載工具。
在抗流感藥物中，活性成分之一為本發明所述的抗Hmi流感病毒的單鏈抗體或衍生抗體。需要的時候，在上述藥物中還可以加入一種或多種藥學上可接受的載體。所述的載體包括藥學領域常規的稀釋劑、賦形劑、填充劑、吸收促進劑或吸附載體等。該藥物可以制成注射劑、片劑、粉劑、膠囊、口服液等多種形式。按照藥物領域的常規方法制備。
下面用實施例來進一步說明本發明，但本發明并不受其限制。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，或按照制造廠商所建議的條件。實施例中所述的“室溫”是指進行試驗的操作間的溫度，一般為25°C。
實施例1免疫小鼠脾細胞的總RNA的提取并逆轉錄合成互補DNA
1. 1 A/PR/8/H1N1流感病毒感染小鼠的脾細胞的總RNA的提取
取抗原流感病毒(流感病毒PR8 (A/Puerto-ico/8/34 (HlNl)，為實驗室常用病毒， 其生物學特性能代表Hmi流感病毒特點。(呂翠霞等，清營解表合劑對感染流感病毒A/ PR/8/H1N1模型小鼠巨噬細胞吞噬功能的影響，山東中醫藥大學學報，第34卷第5期，2010 年9月，第457-458頁。)培養上清，將該病毒液接種于MDCK細胞(購自中國科學院上海生命科學研究院生物化學與細胞生物學研究所)，48h后吸取細胞上清，此即為含有病毒的細胞培養上清液，經測定病毒效價為1 X 105TCID50/mL,放_70°C低溫冰箱保存備用。
A/PR/8/H1N1流感病毒細胞培養液上清稀釋100倍，采用滴鼻免疫感染Balb/C小鼠(購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司)，二周之后加強免疫一次。一周后小鼠尾部靜脈取血，ELISA鑒定具有高滴度保護性抗體，選擇效價最高的小鼠，將其處死后取出脾臟加入液氮研磨，按50-100mg脾臟加入ImLTrizol試劑，室溫靜置5min，按每ImLTrizol加入 0. 2mL氯仿加入氯仿，反復劇烈振蕩15s，室溫靜置2-3分鐘。4°C，12000g/min離心15min， 吸取水相部分于另一干凈1. 5mL的離心管中，按每ImlTrizol加入0. 5mL異丙醇加入異丙醇，顛倒混勻，于_20°C沉淀30-60min，12000g/min離心lOmin。保留沉淀，70%的乙醇洗滌一遍，空氣中晾干，DEPC水溶解沉淀RNA。
1. 2逆轉錄合成cDNA
逆轉錄是以RNA為模板，在RNA指導的DNA聚合酶(逆轉錄酶)作用下，利用4種 dNTP為原料，在引物的3’端以5’-3’方向合成與RNA互補的DNA鏈的過程。以提取的免疫脾細胞的總RNA為模板合成cDNA的步驟具體為取oligo (dt) 18 primer (0. 5 μ g/ μ L) 1 μ L， 計算出的RNA體積；DEPC水補足為12 μ L，混合后置65°C，5min,迅速置于冰上，根據反轉錄試劑盒((Promega公司)的說明書依次加入各試劑，輕微離心后于42°C，60min, 70V，5min 滅活反轉錄酶，將反轉錄產物cDNA于-70°C保存。
實施例2重疊延伸法合成單鏈抗體基因片段
2. 1全套抗體可變區基因的擴增
以cDNA為模板進行PCR反應分別擴增抗體基因重鏈和輕鏈可變區。具體步驟為， 在一只0. aiilPCR管內加入下列試劑進行重鏈可變區擴增免疫脾細胞cDNA 4μ L ;10XPCR buffer 5 μ L ；dNTP (IOmM) 5 μ L ；上下游引物 1 μ L ;Taq (5U/ μ L) 0. 5 μ L，加滅菌超純水置 50 μ L0另一只PCR反應管內加入以下試劑進行輕鏈可變區擴增免疫脾細胞cDNA4yL; IOXPCR buffer 5μ L ； dNTP (IOmM) 5 μ L ；上下游引物各 1 μ L ；Taq (5 μ / μ L) 0. 5 μ L，加滅菌超純水置50 μ L。緩慢用微槍頭混合上述液體并短暫地離心。擴增條件94°C預變性4分鐘，然后94°C變性30秒，55 °C退火30秒，72 °C延伸1分鐘，共30個循環。
其中擴增VH的引物為
VHa 5-GTCCTCGCAACTGC jGGCCCAGCCGGC^ ATGGCCSAGGTSMARCTGCAGSAGTC-3
VHb 5- GCCAGAGCCACCTCCGCCTGAACCGCCTCCACC TGAGGAGACGGTGACCGTGGT-3。
擴增VL的引物為
VLc 5- TCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCGGkCkVlGkGCTCkOlCkGTCTCCS
VLd 5-GAGTCATTCT |GCGGCCGC| CCGTTTBAKYTCCARCTTKGTSCC-3。
注B= T，C，G ;K = T，G ;M = A, C ;R = A, G ;S = G，C = A, T ;Y = C, Τ。
方框分別為內切酶SfiI和NotI。斜體部分為擴增Linker序列的部分，黑體加斜體部分為Linker的互補部分。PCR結果分別在約360bp和320bp間出現條帶，與預期的大小相符，見圖4。
2. 2單鏈抗體(SCFv)片斷的隨機拼接及純化
scFv中的VH和VL是由Linker (接頭)連在一起的，Linker的設計對保持親本抗體的親和力有重要影響，它應該不干擾VH和VL的立體折疊，不防礙抗原結合部位，不引起分子動力學改變，盡可能減少蛋白酶攻擊及防止^Fv聚集。現在最常用的Linker序列是由3個編碼親水性五氨基酸單位(GlyJer)構成。其中甘氨酸是分子質量最小，側鏈最短的氨基酸，可增加側鏈的柔韌性，絲氨酸是親水性最強的氨基酸。其取向有兩種方式 VH-Linker-VL或VL-Linker-VH。兩種構建方式對kFv的特異性和親和力無明顯影響。但可致大腸桿菌分泌表達的不同。本發明單鏈抗的組裝，采用重疊延伸法(SOE)用接頭(G4S)3WDNA片段將克隆的抗體輕、重鏈可變區基因連接，構成5’ VH-Linker-VL 3’形式。具體步驟為將上述擴增到的VH和VL基因片斷分別用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳進行分離、回收，然后將VH和VL等量混合作為模板進行重疊延伸PCR以裝配kFv片斷，條件為 940C Imin變性，55 °C Imin退火，72 °C Imin延伸，共30個循環。PCR產物即為單鏈抗體基因片斷，VH 和 VL 基因之間是 45bp 的 linker 序列GGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGT GGCGGATCG，共編碼15個氨基酸，即為(GGGGS)3，用1. 5%的瓊脂糖凝膠回收，結果見圖5。
實施例3單鏈抗體與噬粒載體的連接、初級抗體庫的構建及抗體多樣性的分析
3. 1單鏈抗體基因與噬粒載體的連接、單鏈抗體庫的構建
使用T4DNA連接酶(!Iomega)，將經sfil和NotI酶切處理的scFv片段與 PCANTAB5E載體(購自Wiarmacia公司)連接。將連接產物轉化到100 μ L TGl感受態細胞，然后加入900yL 37°C預熱的2XYT培養基，37°C振蕩培養lh，取上步轉化后培養的菌液100 μ L，用2XYT培養液做梯度倍比稀釋，涂布SOB-AG平板，30°C培養過夜。計數平板上的單菌落數，推算抗體庫庫容量為3xl06。剩余的轉化后培養的菌液，加入IOmL 2XYTGA(Glucose :2%,Amp :100 μ g/mL)，37°C培養至 A600 = 0. 5，使細菌達到對數生長期。 加入 2X101。噬菌體 M13K07(購自 Pharmacia 公司)，37°C培養 lh，4000r/min 離心 IOmin, 重懸沉淀于200mL 2XYT2A K (Amp 100 μ g/mL，卡那霉素:50 μ g/mL)，37°C振蕩培養過夜。 4000r/min 離心 IOmin 后，加入 1/5 體積量的 PEG/NaCl (20 % PEG8000，2. 5mol/LNaCl)于 4°C沉淀噬菌體30min，9000r/min離心20min，將沉淀噬菌體重懸于2mL含10g/L BSA的PBS中，12000r/min離心5min，上清經0. 45 μ m濾膜過濾，即獲得噬菌體單鏈抗體庫。
3. 2單鏈抗體多樣性的分析
隨機挑取10個克隆，用sfil和NotI雙酶切，初步鑒定陽性克隆。質粒提取及酶切反應操作和以上步驟相同。pCANTAB5E-scFV示意圖見圖6。
以 S1，S6 (S 1 5-CAACGTGAAAAAATTATTATT-3 ； S6 5-GTAAATGAATTTTCTGTATGAGG-3) 為引物進行測序，除2個克隆測序無結果，其他8個克隆(PHL1-PHL8)的測序結果表明序列排列方式為VH-Linker-VL，與小鼠免疫球蛋白可變區序列數據庫Kabat比對后發現所有序列均符合小鼠輕重鏈可變區基因結構。VH部分為357-367bp左右，VL為320_330bp左右， 重鏈和輕鏈之間的linker堿基序列全部正確。利用軟件DNAstar進行序列比對，同源性達 82%以上，其它有較為明顯差異，同源性低于76%。結果見圖7。
實施例4抗流感病毒的單鏈抗體庫的富集和特異性抗體的篩選
將免疫管用碳酸鹽包被緩沖液將A/PR/8/Hmi流感病毒細胞培養液上清(滴度為1X 105PFU/mL)按1 5 (體積比)稀釋(包被量2mL/管)，4°C過夜。包被完畢，用PBS洗管3次，拍干；用封閉液脫脂乳PBS，MPBS)封閉免疫管，37°C封閉2小時；傾去封閉液， 用PBS洗管3次，拍干；在洗滌過程中，將上述已獲得的初級噬菌體單鏈抗體庫上清，按照 MPBS 上清=2 3的體積比將MPBS和噬菌體上清進行混勻，加入封閉好的免疫管，2mL/ 管，輕搖溫育30min后，再靜置溫育1. 5小時；棄免疫管內噬菌體上清，用PBST洗滌3次，再用PBS洗滌3次，拍干；加入甘氨酸-鹽酸(pH2. 2)洗脫液，2mL/管，37°C作用6min后，迅速加入Tris Qmol/L pH 7. 4)，200 μ L/管中和洗脫下來的噬菌體溶液，再加入2mL新鮮的 TGl菌液(購自Wmrmacia公司)(0D值約為0. 5)，37°C作用Ih后，此時，完成了第一輪淘篩，獲得了一級抗體庫。取部分菌液做10倍梯度稀釋后，涂布SOBAG板計算輸出的噬菌體淘篩量，剩余菌液加入終濃度為lOOyg/mLamp和2%葡萄糖，同時加入約4X101(IM13 K07噬菌體，靜置溫育30min后，再250rpm振蕩培養30min ； 1000 Xg離心lOmin，去上清，用IOOmL2X YT-AK輕懸細胞，37°C，250轉，培養過夜，開始下一輪淘篩，最終經過3輪淘篩，取獲得的菌液，用2XYT培養基做梯度倍比稀釋，取稀釋液IOOyL涂布SOBAG平板，30°C培養過夜； 選出有約100-200個左右菌落的平板，計算菌落數目，乘以稀釋倍數，即得相應庫容。經過 3輪特異性富集淘篩，獲得了滴度約為5. OX IO4CfuAiL的噬菌體重組抗體庫。剩余菌液按照800 μ L以上洗脫菌液+200 μ L(含80%滅菌甘油的2XYT)，混勻后，-70°c凍存，標記為三級抗體庫。
實施例5重組噬菌體ELISA初步檢測抗原陽性重組抗體
取72個1. 5mL的離心管置培養架上作為培養板，每孔加入2XYT-AG培養基 400 μ L ；挑取上述中的SOBAG平板上長出的單個菌落，接種至上面各孔中，此板標記為 Master Plate ；將Master Plate置于搖床，30°C，250rpm，振蕩培養過夜；次日，另取72孔培養板，取40(^1^含有2.5\101(^偽/11^ M13K07的2XYT-AG至每孔，此板標為Pl Plate ； 從過夜培養的Master Plate上每孔取40 μ L培養液至Pl Plate^fPl Plate置于搖床， 37°C,150rpm/min,振蕩培養2小時，1500Xg離心20min,小心去上清；向Pl Plate每孔加入400 μ L 2 X YT-AK培養液，37"C，250rpm,振蕩培養過夜；1500 X g離心20min,小心取上清待用。取實施例1所制的A/PR/8/Hmi流感病毒細胞培養液上清4°C包被酶標板過夜，2%M PBS(含2%脫脂乳的PBQ封閉，洗滌后，以上面獲得噬菌體液為一抗，37°C孵育2h，HRP標記的抗M13單抗為二抗，37°C反應lh，洗滌后加入TMB顯色液，37°C反應30min， 加入2M硫酸終止顯色，酶標儀450nm波長下測OD值，設Mi;3K07包被對照孔(陽性對照)和空白包被對照孔，找出陽性克隆(0D值彡0. 3且OD值/OD空白孔彡3可以確定為陽性克隆)。ELISA測定各孔上清與A/PR/8/Hmi流感病毒的結合情況，結果發現4株克隆與抗原有陽性反應，初步確定這4株重組克隆為陽性。其中一株噬菌體抗體為強陽性， 命名為 WJY001，提取此克隆的重組質粒，以 Si，S6(S1 5-CAACGTGAAAAAATTATTATT-3 ；S6 5-GTAAATGAATTTTCTGTATGAGG-3)為引物做PCR鑒定，結果見圖5，將目的片段用膠回收試劑盒回收后送上海英駿公司測序，測序結果表明目的^Fv序列共74!3bp，序列排列方式為 VH-Linker-VL,與小鼠免疫球蛋白可變區序列數據庫Kabat比對發現序列符合小鼠輕重鏈可變區基因結構。命名為SIVHL1，測序結果見圖1。
實施例6抗流感病毒的噬菌體單鏈抗體活性的鑒定
6. 1阻斷ELISA鑒定陽性克隆噬菌體重組抗體WJY001
按照最佳包被條件，將抗原實施例1所制的流感病毒細胞培養上清包被96孔板， 4°C包被過夜。2% MPBS (含2%脫脂乳的PBQ封閉，將A/PR/8/Hmi流感病毒液濃縮后置于DMEM培養基透析平衡，最終濃縮成4倍，然后用DMEM培養基倍比稀釋2個梯度(分別相當于4倍、2倍、1倍的A/PR/8/Hmi流感病毒的細胞培養上清液)，每一梯度，設立阻斷孔和非阻斷孔，各為三重復，病毒液與陽性克隆噬菌體液各50 μ L在孔外室溫反應30min，移置阻斷孔，DMEM細胞培養液與陽性克隆噬菌體液同樣反應后移置非阻斷孔，37°C反應lh， 洗滌后加入HRP標記的抗M13單抗100yL，37°C反應lh，洗滌；顯色加入200 μ L/孔TMB 顯色液，370C孵育顯色15min左右；終止用200 μ L/孔終止液，終止顯色。結果顯示用來阻斷的病毒濃度越高，剩下能夠與已包被在ELISA板上得病毒反應的噬菌體單鏈抗體量越少，ELISA的0D450值越小，結果見表1，說明WJY001噬菌體單鏈抗體與A/PR/8/Hmi流感病毒的結合反應的特異性較好。
表1.不同濃縮濃度的Hmi流感病毒液與WJY001噬菌體單鏈抗體結合的阻斷 ELISA結果
權利要求
1.一種抗流感病毒的單鏈抗體，其是下列蛋白質之一1)由抗體重鏈可變區和輕鏈可變區通過接頭肽連接而成的單鏈抗體，其中輕鏈可變區的氨基酸序列和重鏈可變區氨基酸序列分別如序列表中SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2所示；2)如1)所述的單鏈抗體經過改造得到的衍生抗體，所述的改造包括氨基酸的缺失、取代或插入，并且該衍生抗體具有抗流感病毒的抗體活性。
2.如權利要求1所述的單鏈抗體，所述的接頭肽是15-20個氨基酸縮合而成的短肽。
3.編碼如權利要求1或2所述的抗體的基因。
4.如權利要求3所述的基因，其特征在于，是下述基因之一1)該基因編碼抗體輕鏈可變區和重鏈可變區的核苷酸序列分別如序列表中SEQID NO. 3 和 SEQ ID NO. 4 所示；2)在嚴謹條件下該基因編碼抗體輕鏈可變區和重鏈可變區的核苷酸序列分別可與SEQ ID NO. 3和SEQ ID NO. 4限定的DNA序列雜交，且該基因編碼的蛋白質具有抗Hmi流感病毒的抗體活性。
5.含有權利要求3或4所述基因的表達載體。
6.如權利要求5所述的表達載體，其特征在于，所述的載體是質粒pET28a。
7.含有權利要求5所述表達載體的宿主。
8.如權利要求7所述的宿主，其特征在于，所述的宿主是大腸桿菌。
9.一種制備權利要求1所述的抗Hmi流感病毒的單鏈抗體的方法，其特征在于，包括將權利要求5所述的表達載體轉化、轉導或轉染宿主細胞，培養宿主細胞，從培養物中分離蛋白，得到抗Hmi流感病毒單鏈抗體。
10.權利要求1或2所述的抗體在制備抗流感藥物中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種抗流感病毒的單鏈抗體ScFv及其制備方法和應用，以及編碼該單鏈抗體的基因，含有該基因的載體和宿主細胞等。該抗流感病毒的單鏈抗體，其是下列蛋白質之一1)由抗體重鏈可變區和輕鏈可變區通過接頭肽連接而成的單鏈抗體，其中輕鏈可變區的氨基酸序列和重鏈可變區氨基酸序列分別如序列表中SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；2)如1)所述的單鏈抗體經過改造得到的衍生抗體，所述的改造包括氨基酸的缺失、取代或插入，并且該衍生抗體具有抗H1N1流感病毒的抗體活性。本發明的單鏈抗體分子量約為27kD，能夠特異識別H1N1流感病毒，阻斷病毒與天然血清的結合。能用來診斷、預防、控制和治療H1N1流感病毒的感染，或者用于抗病毒的轉基因動物育種。
文檔編號A61P31/16GK102558348SQ201210063870
公開日2012年7月11日 申請日期2012年3月9日 優先權日2012年3月9日
發明者劉迎春, 史子學, 宋寧寧, 李欣彤, 楊康, 王權, 石金磊, 蔣蔚, 陳永軍, 顧惠明, 馬志永 申請人:中國農業科學院上海獸醫研究所