專利名稱：一種模擬人盆腔炎動物模型的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種模擬人盆腔炎動物模型的制作方法。
背景技術：
盆腔炎是指女性內生殖器官及周圍的結締組織、盆腔腹膜發生炎癥。它包括子宮內膜炎、子宮肌炎、輸卵管炎、卵巢炎等。盆腔炎為 婦科常見病、難治病。嚴重者可引起敗血癥及膿毒血癥。如不及時控制，可出現感染性休克甚至死亡。亦可能導致月經失調，甚至不孕。其發病率不斷增高。臨床研究表明盆腔炎常見的致病因子為細菌(包括需氧菌和厭氧菌)，也有病毒、霉菌、支原體、衣原體等。目前盆腔炎動物模型與人疾病發生機制不吻合，發病機制不清，嚴重阻礙治療盆腔炎藥物的開發與研究。目前公開的盆腔炎動物模型有以下幾種
一、子宮內膜炎模型
I.苯酚膠漿劑致大鼠子宮內膜炎模型苯酚膠漿是化學腐蝕燒傷劑。將大鼠麻醉后，下腹常規消毒后正中切口，暴露子宮，于子宮分叉處進針入子宮腔內，朝卵巢方向緩慢推入25 %苯酹膠漿0.05 mL/只，然后分層縫合關腹，子宮病理學檢查發現與炎癥反應相似，可見子宮腔閉塞黏連，上皮細胞壞死脫落，大量炎癥細胞浸潤。2.鹽酸致大鼠子宮內膜炎模型將大鼠麻醉后，行腹正中線切口，暴露子宮，用鑷子夾住雙角子宮分叉處的一側，在同側子宮近卵巢端進針，向子宮腔內注射0. 2 M鹽酸，以管腔充盈為度，維持2. 5 min后松開鑷子，另一側相同。雙側子宮注射完畢后，逐層關腹。子宮病理學檢查發現在子宮內膜黏膜少量炎癥細胞浸潤。一周后炎癥細胞浸潤增多。3.異物致大鼠子宮內膜炎模型將大鼠麻醉后，開腹暴露子宮，沿左側子宮角上Icm處作一橫切口，將一塑料管放在子宮內，縫合固定以防脫落。病理觀察到少量炎癥細胞。然而以上兩種方法通過化學燒傷、腐蝕或異物致炎，方法過于強烈，同人盆腔炎發生的自然過程不符合。4.大鼠大腸桿菌感染性子宮內膜炎模型將大鼠麻醉后，無菌條件下取腹部正中切口，開腹暴露子宮，用ImL注射器抽取0. 2mL大腸桿菌液，于子宮內進針，在注射前先用注射器機械損傷子宮內膜組織，然后注入菌液0. 08 0. lmL，逐層關腹。病理學檢查發現造模感染第3 d，黏膜出現化膿灶，第5 d，子宮右側積液，充血水腫。第60 d，盆腔出現廣泛黏連不易分離。病理切片發現大量炎性細胞浸潤。該方法與手術過程中感染產生的盆腔炎較為接近，然而同現實中的手術操作條件不相吻合，動物死亡率高，不適用于藥物篩選與機理研究。5.兔細菌感染性子宮內膜炎模型將致病性大腸桿菌，金黃色葡萄球菌和無乳鏈球菌等比例混合。用導尿管通過子宮灌注并結合一定的損傷。隔天一次，共三次。發現造模后兔精神變差、采食量減少，陰門腫脹，流出膿性分泌物；每次灌注細菌后8 h內體溫升高
0.5 °C左右，血液中性粒細胞的比例升高；子宮分泌物中混有大量白細胞、膿球和少量脫落的子宮內膜上皮細胞；子宮顯著腫大，子宮內膜潰瘍和出血，上皮結構不完整，細胞變性、壞死，微絨毛和纖毛脫落，上皮下出血、瘀血、水腫和炎性細胞浸潤。該方法同臨床更為接近，但是導尿管損傷過于劇烈，且兔子體型較大，潔凈級兔成本較高，不適用于藥物研究。二、輸卵管炎模型
I.苯酚膠漿劑致大鼠輸卵管炎模型將大鼠麻醉后，開腹暴露兩側輸卵管，各注射25%苯酚膠漿0.1 mL，縫合。20 d后，大鼠全血黏度升高，輸卵管阻塞。該法于臨床疾病發生不吻合。2.兔溶血性鏈球菌感染性輸卵 管炎模型新西蘭白兔，麻醉后，打開腹膜暴露子宮、輸卵管，用動脈夾將輸卵管峽部端、傘端夾住，由峽部端向傘端注射3 -溶血性鏈球菌菌液(I. 5億菌落/mL)0. 4 mL/側。I min后松開動脈夾，關腹。血液觀察發現血沉壓積異常，輸卵管阻塞，盆腔黏連。3.大鼠細菌感染性輸卵管炎模型麻醉開腹，在子宮角近輸卵管處進針，朝輸卵管側注射0. 05 mL混合菌液(致病性大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌，菌液體積比為2:1:1。感染后3 12 d，感染組大鼠子宮顯著增重。感染后第9 d，感染大鼠子宮出現化膿；感染前期可見子宮內膜上皮細胞脫落，黏膜層水腫、充血、出血，炎癥細胞浸潤；感染后期可見肌層增厚等病變。以上兩種方法同臨床盆腔炎發生也不相同，且手術難度較大，阻礙模型的應用。
發明內容
本發明的目的是建立一種操作簡單可行，材料容易得到，對操作者無特殊技術要求，模型制作成功率高，模擬人盆腔炎發生的動物模型的制作方法。為實現以上目的，本發明采用如下技術方案一種建立模擬人盆腔炎動物模型的方法，選用無生殖道疾患的鼠科動物，在無菌的條件下，將腸桿菌屬、葡萄球菌屬或念珠菌屬接種于動物陰道中。接種1-8周，每周1-7次。本發明可在動物接種前，采用類固醇激素類藥物處理動物1-8周，每周1-7次。所述類固醇激素為雌性激素或腎上腺皮質激素。所述的雌性激素為雌二醇。所述的腎上腺皮質激素為氫化考的松、潑尼松或地塞米松等。所述的腸桿菌屬為大腸桿菌菌株6頂1.457、大腸桿菌菌株々了025922等，優選大腸桿菌菌株GMl. 457 ;所述葡萄球菌屬為金黃色葡萄球菌CPCC160012、金黃色葡萄球菌菌株ATCC25923等，優選金黃色葡萄球菌CPCC160012 ；、所述念珠菌屬為白色念珠菌ATCC90029、白色念珠菌菌株(國標10231)等，優選白色念珠菌ATCC90029。所述的鼠科動物為遠交系或近交系小鼠或大鼠。本發明具有以下優點模型制作成功率高，模型成功率達75%以上，采用大腸桿菌菌株GMl. 457、金黃色葡萄球菌CPCC160012或白色念珠菌ATCC90029接種，模型成功率達90%以上(動物接種前，采用類固醇激素類藥物處理后，模型成功率達100%)，不依賴免疫抑制劑，模型成功后，陰道口分泌物顯著增多；陰道涂片鏡檢可觀察到細菌；解剖發現子宮充血腫大，卵巢囊腫病變。組織器官切片鏡檢可觀察到子宮和輸卵管均見大量炎癥細胞浸潤，血液檢查表明中性粒細胞數異常增高。操作方法簡單易行，材料易得，方法易掌握，對使用者無特殊技術要求，并符合盆腔炎臨床自然發生過程，適用于盆腔炎發生，發展及其機制的研究和相關藥物的篩選。
圖I為實施例2大腸桿菌(GM1. 457)制備盆腔炎模型SD大鼠生殖器官照片。其中Con為正常組大鼠A.外陰；B.生殖器官；C.子宮切片HE染色。Coli為大腸桿菌組大鼠A.外陰；B.生殖器官；C.子宮切片HE染色。圖2為實施例2大腸桿菌制備盆腔炎模型SD大鼠血液中性粒細胞百分比圖。
圖3為實施例4金黃色葡萄球菌(CPCC160012)制備盆腔炎模型Wistar大鼠生殖器官照片。Con為正常組大鼠A.外陰；B.生殖器官；C.輸卵管切片HE染色。Aureus為大腸桿菌組大鼠A.外陰；B.生殖器官；C.輸卵管切片HE染色。圖4為實施例4金黃色葡萄球菌制備盆腔炎模型Wistar大鼠血液中性粒細胞百分比圖。圖5為實施例6白色念珠菌(ATCC90029)制備盆腔炎模型昆明小鼠生殖器官照片。Con為正常組小鼠A.生殖器官；B.輸卵管切片HE染色。Albus為白色念珠菌組小鼠A.生殖器官輸卵管切片HE染色。圖6為本發明實施例6白色念珠菌制備盆腔炎模型昆明小鼠血液中性粒細胞百分比圖。
具體實施例方式本發明可包括
菌種準備在菌種準備步驟中，選用所需細菌菌株接種于培養基中，15-38°C下培養1-7 天；
動物準備在動物準備步驟中，選用無生殖道疾患的鼠科動物；
接種前處理(也可不采用該步驟)在接種前處理步驟中，采用雌二醇處理動物1-8周，每周1-7次；
動物接種在動物接種步驟中，將動物在嚴格無菌的條件下用帶有所需細菌的接種物于動物陰道中接種1-8周，每周1-7次。所述的鼠科動物為遠交系或近交系小鼠或大鼠。所屬的培養基為牛肉膏培養基、牛肉膏瓊脂培養基、馬鈴薯葡萄糖培養基或沙堡氏培養基等。所述的細菌菌種有腸桿菌屬,葡萄球菌屬,念珠菌屬等。本發明中，除特殊說明外，所涉及的原材料、培養基及細菌或真菌接種方法等均為公知內容和所述領域常規技術和方法。實施例I :
菌種準備選用大腸桿菌菌株(GIM1. 457)，接種于牛肉膏瓊脂培養基中，37°C下培養2天。動物準備選用無生殖道疾病的Wistar大鼠,每種菌種選用10只動物。動物接種將大鼠在嚴格無菌的條件下采用注射器將大腸桿菌菌株(GIM1. 457)(100 u 1,1 X IO8 CFU/ml)于大鼠陰道中接種5周，每周2次。
接種后處理和觀察于第一次接種5周后，處死動物，并摘取生殖器官，如陰道，子宮，輸卵管，卵巢，于無菌生理鹽水中充分漂洗，固定48小時后用于病理學檢查。經觀察分析發現，本方法具有以下優點
I.模型成功率高達90%，接種后第三天發現外陰部紅腫，分泌物增多。陰道涂片結果表明大鼠周期出現異常。解剖學發現，陰道腫脹，子宮充血積液，卵巢出現囊泡，整體硬度顯著增大，且與周圍器官組織黏連難分離。病理觀察發現組織均出現不同程度炎癥和糜爛。該實施例出現明顯的盆腔炎癥狀。
2.不依賴免疫抑制劑，符合臨床盆腔炎自然發生的過程。目前采用的不利用免疫抑制劑的成功造模方法均需要采用外科創傷和腹腔接種，不利于推廣應用。3.同現有技術相比，本方法采用本方法制備模型，動物死亡率顯著降低，操作簡單，無需手術，對操作者無特殊的技術要求，便于其在疾病發生機制和藥物開發等方面研究的普及及運用。實施例2
選用無生殖道疾病的SD大鼠，在接種前采用雌二醇處理大鼠I周，每周3次。選用大腸桿菌菌株(GIM1. 457)，接種于牛肉膏瓊脂培養基中，37°C下培養3天；將大鼠在嚴格無菌的條件下采用注射器將大腸桿菌菌株(GM1. 457) (100 ul,l X IO6 CFU/ml)于大鼠陰道中接種4周，每周2次。于第一次接種4周后，處死大鼠，并摘取生殖器官，如陰道，子宮，輸卵管，卵巢，于無菌生理鹽水中充分漂洗，固定48小時后用于病理學檢查。結果顯示1.模型成功率達到100%，接種后第三天發現外陰部紅腫，分泌物增多(如圖I. Coli A所示)。造模結束后，經解剖學發現，整個盆腔呈現炎癥上行發展。陰道腫脹，子宮充血積液，卵巢出現囊腫，硬度顯著增大，且整體與周圍器官組織黏連難分離(參見圖I. Coli B所示)。子宮切片HE染色結果顯示大腸桿菌組大鼠生殖道出現大量炎性細胞由下向上蔓延浸潤。(如圖I. Coli C所示)。血液檢查結果顯示中性粒細胞數比正常組明顯增高(產< 0. 05)，顯示細菌感染狀況(如圖2所示)。該方法出現典型的盆腔炎癥狀，其造模效果優于無激素前處理的大鼠。方法簡便易于操作，模型穩定性高，動物生存狀態正常。實施例3:
選用無生殖道疾病的SD大鼠，在接種前采用雌二醇處理大鼠I周，每周3次。選用大腸桿菌菌株(ATCC25922)，接種于牛肉膏瓊脂培養基中，37°C下培養3天；將大鼠在嚴格無菌的條件下采用注射器將大腸桿菌菌株(ATCC25922) (100 ul,l X IO7 CFU/ml)于大鼠陰道中接種5周，每周3次。同時，繼續采用雌二醇處理5周，每周3次。于第一次接種6周后，處死大鼠，并摘取生殖器官，如陰道，子宮，輸卵管，卵巢，于無菌生理鹽水中充分漂洗，固定48小時后用于病理學檢查。結果顯示1.模型成功率達到80%，接種后第3天發現外陰部紅腫，分泌物增多。造模結束后，經解剖學發現，附件組織均有不同程度變硬。子宮充血積液，卵巢出現囊腫。附件器官HE染色結果顯示大腸桿菌組生殖道出現大量炎性細胞浸潤。血液檢查結果顯示中性粒細胞數比正常組明顯增高(P < 0.05)，顯示細菌感染。出現典型的盆腔炎癥狀。該方法簡便易于操作，動物生存狀態正常。實施例4
選用無生殖道疾病的Wistar大鼠，在接種前采用雌二醇處理大鼠3 d，每天I次。選用金黃色葡萄球菌菌株(CPCC160012 )，接種于牛肉膏瓊脂培養基中，37 °C下培養2天；將大鼠在嚴格無菌的條件下采用注射器將金黃色葡萄球菌菌株(CPCC160012) (100 ul,l X IO5CFU/ml)于動物陰道中接種3周，每周I次。于第一次接種3周后，處死大鼠，并摘取生殖器官，如陰道，子宮，輸卵管，卵巢，于無菌生理鹽水中充分漂洗，固定48小時后用于病理學檢查。結果顯示模型成功率達到100%，接種后第三天發現外陰部紅腫，分泌物增多(如圖3. Aureus A所示)。解剖學發現，陰道腫脹，子宮充血積液，卵巢出現囊腫，硬度顯著增大，且整體與周圍器官組織黏連難分離(參見圖3. Aureus B所示)。圖3. Aureus C為輸卵管切片染色結果。發現同正常組相比，金黃色葡萄球菌組大鼠輸卵管組織明顯破壞。輸卵管褶皺處模糊不清，結構受損，將會影響卵子的移動。血液檢查結果顯示中性粒細胞數比正常組明顯增高Gd < 0. 05)，顯示細菌感染狀況(如圖4所示)。該方法出現典型的盆腔炎癥狀。方法簡便易于操作，成模穩定性高，動物生存狀態正常。實施例5
選用無生殖道疾病的昆明小鼠，在接種前采用雌二醇處理小鼠I周，每周3次。選用金黃色葡萄球菌菌株(ATCC25923)，接種于牛肉膏瓊脂培養基中，37°C下培養2天；將小鼠在嚴格無菌的條件下采用注射器將金黃色葡萄球菌菌株(ATCC25923) (100 ul,l X IO5CFU/ml)于陰道中接種3周，每周2次。同時繼續采用雌二醇處理3周。于第一次接種3周后，處死小鼠，并摘取生殖器官，固定48小時后用于病理學檢查。結果顯示模型成功率達到75%，接種后第三天發現外陰部紅腫，分泌物增多。解剖學發現，陰道腫脹，子宮充血積液，卵巢出現囊腫，硬度顯著增大，且整體與周圍器官組織黏連難分離。輸卵管切片染色結果顯示同正常組相比，輸卵管組織炎性細胞浸潤，輸卵管與卵巢連接處結構明顯破壞。該方法出現典型的盆腔炎癥狀。方法簡便易于操作，成模穩定性高，動物生存狀態正常。實施例6
選用無生殖道疾病的昆明小鼠，在接種前采用雌二醇處理小鼠I周，每周2次。選用白色念珠菌菌株(ATCC90029)，接種于馬鈴薯葡萄糖培養基中，37°C下培養2天；將小鼠在嚴格無菌的條件下采用注射器將白色念珠菌菌株(ATCC90029) (100 ul,l X IO7 CFU/ml)于小鼠陰道中接種2周，每周2次。于第一次接種2周后，處死小鼠，并摘取生殖器官，如陰道，子宮，輸卵管，卵巢，于無菌生理鹽水中充分漂洗，固定48小時后用于病理學檢查。結果顯示模型成功率達到100%，接種后第三天發現外陰部紅腫，分泌物增多。解剖學發現，整個生殖器官均腫大，子宮積液嚴重，卵巢囊腫有硬塊。(參見圖5. Albus A所示)。圖5. Albus B為輸卵管切片HE染色結果。發現同正常組相比，白色念珠菌組輸卵管組織褶皺邊界組織模糊不清，出現異常空泡樣結構。該方法出現典型的盆腔炎癥狀。方法簡便易于操作，模型穩定性高，動物生存狀態正常。實施例I
選用無生殖道疾病的Wistar大鼠，在接種前采用雌二醇處理大鼠I周，每周3次。選 用白色念珠菌菌株(國標10231)，接種于馬鈴薯葡萄糖培養基中，37°C下培養2天；將大鼠在嚴格無菌的條件下采用注射器將白色念珠菌菌株(國標10231)(100 u 1,1 X IO6 CFU/ml)于陰道中接種4周，每周3次。同時繼續用雌二醇處理4周，每周3次。于第一次接種5周后，處死小鼠，并摘取生殖器官，于無菌生理鹽水中充分漂洗，固定48小時后用于病理學檢查。結果顯示模型成功率達到82%，解剖學發現，整個生殖器官均腫大，子宮積液嚴重，卵巢囊腫有硬塊。該方法出現典型的盆腔炎癥狀。方法簡便易于操作，模型穩定性高， 動物生存狀態正常。
權利要求
1.一種建立模擬人盆腔炎動物模型的方法，其特征在于選用無生殖道疾患的鼠科動物，在無菌的條件下，將腸桿菌屬、葡萄球菌屬或念珠菌屬接種于動物陰道中；接種1-8周，每周1-7次。
2.根據權利要求I所述的方法，在動物接種前，采用類固醇激素類藥物處理動物1-8周,每周1-7次。
3.根據權利要求I所述的方法，其特征在于所述類固醇激素為雌性激素或腎上腺皮質激素。
4.根據權利要求2所述的方法，其特征在于所述的雌性激素為雌二醇。
5.根據權利要求2所述的方法，其特征在于所述的腎上腺皮質激素為氫化考的松、潑尼松或地塞米松。
6.根據權利要求I或2所述的方法，其特征在于所述的鼠科動物為遠交系或近交系小鼠或大鼠。
全文摘要
本發明涉及一種模擬人盆腔炎動物模型的制作方法，選用無生殖道疾患的鼠科動物，在無菌的條件下，將腸桿菌屬、葡萄球菌屬或念珠菌屬接種于動物陰道中。接種1-8周，每周1-7次。本發明具有以下優點模型制作成功率高，模型成功率高，不依賴免疫抑制劑，模型成功后，陰道口分泌物顯著增多；陰道涂片鏡檢可觀察到細菌；解剖發現子宮充血膿腫，卵巢囊腫。組織器官切片鏡檢可觀察到子宮和輸卵管均見大量炎癥細胞浸潤，血液檢查表明中性粒細胞數異常增高。操作方法簡單易行，材料易得，方法易掌握，對使用者無特殊技術要求，并符合盆腔炎臨床自然發生過程，適用于盆腔炎發生，發展及其機制的研究和相關藥物的篩選。
文檔編號A61K49/00GK102698292SQ20121015898
公開日2012年10月3日 申請日期2012年5月22日 優先權日2011年5月24日
發明者劉敏, 唐和斌, 李玉桑, 楊祥良 申請人:唐和斌