一種利用正常小鼠建立HER2陽性腫瘤的動物模型的方法與流程

本發明涉及生物技術領域，具體是一種利用正常小鼠建立her2陽性腫瘤的動物模型的方法。

背景技術：

惡性腫瘤是威脅人類生命健康的主要疾病之一，傳統的癌癥治療手段如手術治療、放射治療、藥物治療均具有一定局限性。由于靶向性較差，放射治療和藥物治療易損傷正常人體細胞，產生不良反應。隨著對腫瘤發生、發展的分子機制的深入研究和生物技術的快速發展，生物治療已經成為腫瘤治療的第四種模式。多肽腫瘤疫苗是由來自腫瘤細胞特異性抗原、病毒相關抗原、癌基因或者抑癌基因突變蛋白的多肽組成的疫苗，在細胞因子、趨化因子等佐劑的輔助下，能激活或者加強機體自身抗腫瘤免疫，進而殺傷和清除腫瘤細胞。與傳統疫苗相比，多肽腫瘤疫苗具有易于合成純化、安全性高、特異性強等優點，因此多肽腫瘤疫苗是腫瘤疫苗研究方向的熱點。

人表皮生長因子受體2(humanepidermalgrowthfactorreceptor2，her2)，是由原癌基因her2/neu編碼的185kd的蛋白質，屬于表皮生長因子受體家族，是結合在細胞膜表面的受體酪氨酸激酶，參與導致細胞生長和分化的信號傳導途徑。her2基因是影響腫瘤預后的重要因素，很多類型的腫瘤細胞中均發現了her2/neu的過表達，her2過表達的患者，腫瘤預后差，復發率高。因此her2是腫瘤治療的理想靶標。目前已有多個以her2為靶點的治療藥物(包括小分子化藥和單抗藥物)上市，并取得良好的治療效果。

同時，合成her2/neu的腫瘤相關抗原上的表位多肽，作為腫瘤疫苗，接種機體產生針對her2的特異性細胞毒性t淋巴細胞，對腫瘤細胞進行殺傷，是腫瘤治療的另一個重要的研究方向。目前國外已有數個針對her2的多肽疫苗進入或完成二期臨床試驗階段，一個進入三期臨床試驗階段。相關臨床試驗結果表明，多肽疫苗能夠刺激誘導人體cd4+t和cd8+t淋巴細胞，顯著增加兩者在體內的含量水平，并對腫瘤細胞進行殺傷。

然而，對于腫瘤疫苗，其在動物體內的效力評價是比較困難的。其難點在于，缺少能夠用于效力評價的理想的動物模型。目前現有的幾種動物模型均有其局限性，難以真正用于腫瘤疫苗的效力評價：①傳統的用于評價抗腫瘤藥物效力的免疫缺陷動物(裸鼠或scid鼠)，由于免疫系統缺陷，完全不能用于腫瘤疫苗的效力評價，因為腫瘤疫苗正是通過激活機體免疫系統而達到抗腫瘤的作用；②正常小鼠因為免疫排斥的原因，很難成功接種人源腫瘤細胞，即使經過藥物免疫抑制，可以接種人源腫瘤細胞，但免疫抑制的小鼠也不適于評價腫瘤疫苗的效力；③免疫重建小鼠雖可在免疫缺陷動物中重建免疫系統，但操作繁瑣，穩定性不佳，且動物容易因免疫排斥而死亡；④轉基因小鼠，是目前最適合用于腫瘤疫苗藥效評價的動物模型，但費用昂貴，限制了其使用。因此需要一種操作方便、經濟實用的建立用于評價腫瘤疫苗效果的動物模型的方法。

技術實現要素：

本發明的目的在于提供一種利用正常小鼠建立her2陽性腫瘤的動物模型的方法，以解決上述背景技術中提出的問題。

為實現上述目的，本發明提供如下技術方案：

一種利用正常小鼠建立her2陽性腫瘤的動物模型的方法，包括以下步驟：

(1)細胞培養：將人胃癌細胞nci-n87在細胞培養基中培養，收集處于對數生長期的細胞；

(2)接種：將人胃癌細胞nci-n87接種正常小鼠；

(3)評價：接種2周后，腫瘤直徑≥0.6cm并且成瘤率≥80％，表明成功建立her2陽性腫瘤的動物模型；

其中所述方法不包括對正常小鼠進行免疫抑制的步驟。

作為本發明進一步的方案：所述her2陽性腫瘤是胃癌腫瘤。

作為本發明進一步的方案：所述步驟(2)中，人胃癌細胞nci-n87以1.25×10⁵-1×10⁶個/只的濃度范圍接種正常小鼠。

作為本發明進一步的方案：人胃癌細胞nci-n87以5×10⁵個/只的濃度接種正常小鼠。

作為本發明進一步的方案：所述正常小鼠是免疫功能正常的小鼠。

作為本發明進一步的方案：所述免疫功能正常的小鼠是balb/c小鼠。

本發明還提供一種用于非診斷目的的檢測her2陽性腫瘤疫苗的治療效力的方法，包括以下步驟：

(1)建立模型：將her2陽性的人胃癌細胞nci-n87以5×10⁵個/只接種正常小鼠，建立移植瘤動物模型；

(2)免疫：將her2陽性的腫瘤疫苗以不同濃度免疫接種步驟(1)中的移植瘤動物模型；

(3)記錄：免疫后每天記錄腫瘤生長情況，測量腫瘤的長徑和短徑，計算腫瘤體積，并同時記錄小鼠體重；

(4)評價：末次免疫28天后，計算不同濃度的腫瘤疫苗抑瘤率，評價腫瘤疫苗的治療效力。

本發明還提供一種用于非診斷目的的檢測her2陽性腫瘤疫苗的預防效力的方法，包括以下步驟：

(1)免疫：先以不同濃度的her2陽性的腫瘤疫苗免疫正常小鼠；

(2)建立模型：將her2陽性的人胃癌細胞nci-n87以5×10⁵個/只接種步驟(1)中進行腫瘤疫苗免疫的小鼠，建立移植瘤動物模型；

(3)記錄：免疫后每天記錄腫瘤生長情況，測量腫瘤的長徑和短徑，計算腫瘤體積，并同時記錄小鼠體重；

(4)評價：末次免疫28天后，計算不同濃度的腫瘤疫苗發生率和抑瘤率，評價腫瘤疫苗的預防效力。

本發明另一目的是提供人胃癌細胞nci-n87在利用正常小鼠建立her2陽性腫瘤的動物模型中的用途，其中所述用途不包括對正常小鼠進行免疫抑制。

作為本發明進一步的方案：所述her2陽性腫瘤是胃癌腫瘤。

作為本發明進一步的方案：所述正常小鼠是免疫功能正常的小鼠。

作為本發明進一步的方案：所述免疫功能正常的小鼠是balb/c小鼠。

與現有技術相比，本發明的有益效果是：

本發明提供了一種建立her2陽性腫瘤的動物模型的方法，篩選出人胃癌細胞nci-n87能夠直接接種正常小鼠產生腫瘤，其適合用作臨床前體內抗腫瘤活性評價的動物模型。這完全是出人意料的，因為現有技術只記載了利用人胃癌細胞nci-n87接種裸鼠或嚴重免疫缺陷小鼠來制備異種移植腫瘤動物模型(參見：zhangc,等.establishingaperitonealdisseminationxenograftmousemodelforsurvivaloutcomeassessmentofexperimentalgastriccancer.jsurgres.2013jun15；182(2):227-34；yslee,等.tumordosimetryfori-131trastuzumabtherapyinaher2+ncin87xenograftmousemodelusingthesiemenssymbiaegammacamerawithapinholecollimator.journalofinstrumentation,2015,10(7))，并沒有利用人胃癌細胞nci-n87接種正常小鼠致瘤的文獻報道。利用人胃癌細胞nci-n87直接接種正常小鼠制備動物模型操作簡單，穩定可靠，并且可以大大節省試驗成本，克服了當前其它腫瘤疫苗動物模型的諸多局限性。可以通過先接種腫瘤細胞后免疫疫苗，測定腫瘤體積的抑制率，評價腫瘤疫苗的治療效果；或者先免疫疫苗，后接種腫瘤，評價疫苗對腫瘤的預防作用。此外，本發明所述檢測her2陽性腫瘤疫苗的治療效力或預防效力的方法可用于實驗室中篩選腫瘤疫苗候選物，具有廣泛應用前景。

附圖說明

圖1為固相合成e75的hplc圖譜。

圖2為e75治療nci-n87動物模型的腫瘤體積生長曲線圖。

圖3為e75治療nci-n87動物模型的體重變化曲線圖。

圖4為e75對nci-n87動物模型的預防作用：腫瘤發生率變化圖。

圖5為e75對nci-n87動物模型的預防作用：腫瘤體積變化曲線圖。

圖6為e75對nci-n87動物模型的預防作用：體重變化曲線圖。

具體實施方式

下面將結合本發明實施例，對本發明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發明一部分實施例，而不是全部的實施例。基于本發明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有做出創造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發明保護的范圍。

本發明人進行了大量研究工作，希望建立方便實用的評價腫瘤疫苗效果的動物模型，在研究過程中出人意料的發現，無需對正常小鼠進行免疫抑制，人胃癌細胞nci-n87可以直接接種正常小鼠形成移植瘤動物模型，可用于篩選腫瘤疫苗或抗癌藥物。具體研究過程如下所述：

下列實施例中，選擇腫瘤疫苗肽e75，以評估建立的動物模型對her2陽性腫瘤疫苗效力的評價效果。e75為目前研究最多的多肽腫瘤疫苗，且已進入臨床ⅲ期研究，其對her2陽性腫瘤的臨床藥效已得到廣泛認可。

實施例1人源her2陽性腫瘤細胞的篩選

選取her2陽性的人源腫瘤細胞10株，包括乳腺癌細胞7株：sk-br-3、mda-mb-453、bt-474、hcc1008、hcc1569、hcc2218、hcc1419，卵巢癌細胞1株：skov-3，胃癌細胞2株：sgc-7901、nci-n87，所有細胞均購自atcc。

細胞培養：以上細胞株分別從凍存管復蘇，培養于rpmi1640培養基，傳代培養至細胞生長狀態良好備用。

接種：8周齡balb/c小鼠60只，隨機分為10組，每組6只，適應一周后，分別接種上述10種腫瘤細胞。接種細胞濃度為5×10⁶個/ml，每只接種0.1ml，接種部位為左前肢腋下。

腫瘤接種后，每日觀察并記錄腫瘤生長情況，接種2周后，處死所有動物，結束試驗，并評估試驗結果，以腫瘤直徑≥0.6cm并且成瘤率≥80％作為腫瘤移植成功的標準。

結果：10組動物中，僅人胃癌細胞nci-n87可以成功移植于正常小鼠balb/c，并且nci-n87組全部6只小鼠均成功成瘤(成瘤率為100％)。其它9種人源腫瘤細胞均不能在balb/c移植成功(成瘤率為0)。因此，人胃癌細胞nci-n87可在balb/c小鼠中成功致瘤，所述荷瘤動物可用作her2陽性腫瘤疫苗的藥效評價模型。

實施例2小鼠移植人胃癌細胞nci-n87的細胞接種量的優化

為建立最佳的nci-n87動物模型，對人胃癌細胞nci-n87的接種量進行優化。

8周齡balb/c小鼠24只，隨機分為4組，每組6只，適應一周后，分別接種濃度為1.25×10⁶個/ml、2.5×10⁶個/ml、5×10⁶個/ml、1×10⁷個/ml的人胃癌細胞nci-n87，每只接種0.1ml，接種部位為左前肢腋下。腫瘤接種后，每日觀察并記錄腫瘤生長情況，接種2周后，處死所有動物，結束試驗，并評估試驗結果。

結果：1.25×10⁶個/ml組有3只動物長出腫瘤，成瘤率為50％。2.5×10⁶個/ml、5×10⁶個/ml、1×10⁷個/ml組的全部動物具有腫瘤長出，成瘤率為100％，并且腫瘤直徑在6-10mm之間，適宜作為腫瘤藥物或疫苗藥效評估。其中，5×10⁶個/ml的組腫瘤直徑在8mm左右，為最優接種量。

實施例3固相合成腫瘤疫苗肽e75

e75委托上海翱博生物科技有限公司采用常規固相工藝合成，合成的肽純度＞98％，見圖1。

nci-n87的動物模型對腫瘤疫苗治療效力的評價

接種：8周齡雌性balb/c小鼠40只，用于本研究。收集對數生長期的人胃癌細胞nci-n87，制備成5×10⁶個/ml細胞懸液，以0.1ml種于小鼠左側腋下；每天觀察腫瘤生長情況，待腫瘤直徑長至8mm左右時，開始免疫治療。

免疫：40只小鼠隨機分為4組，每組10只，分別為陰性對照組(pbs)和e75低、中、高劑量組，e75分別以100、300、1000μg/ml與弗氏不完全佐劑(fia)1:1混合乳化30分鐘，pbs與弗氏不完全佐劑(fia)1:1混合乳化30分鐘作為陰性對照，乳化完成后，按照200μl/只分別對各組動物進行免疫，使各組動物的最終e75接種量分別為0、10、30、100μg/只。接種方式為皮下注射，接種部位為腋下右側，每周給藥一次，共免疫三次。

記錄：每天記錄各組動物的腫瘤發生情況，用游標卡尺隔日測量腫瘤長徑和短徑，以下列公式計算腫瘤體積，并記錄體重。

tv＝1/2×a×b²，其中a、b分別表示長寬。

評價：末次免疫四周后，處死所有小鼠，終止實驗并計算抑瘤率進行評價，

抑瘤率(％)＝(對照組腫瘤體積-實驗組腫瘤體積)/對照組腫瘤體積×100％，采用spss軟件進行統計學分析，采用單因素方差分析進行比較，p<0.05為差異有統計學意義。

結果：治療28天后，與陰性對照組相比，e75低、中、高劑量組的腫瘤體積均顯著減少(p＜0.05)，腫瘤的抑制率分別為29.6％、47.6、41.4％(圖2)，證明e75可以顯著降低腫瘤體積，也證明建立的動物模型可以用于e75治療效力的評價。同時，各組小鼠體重均略有增加，各組之間無顯著差異，表明e75安全性良好，該動物模型也可用于評價腫瘤疫苗的安全性(圖3)。

實施例4nci-n87的動物模型對腫瘤疫苗預防效力的評價

免疫：8周齡雌性balb/c小鼠隨機分為4組，每組15只，分別為陰性對照組(pbs)和e75低、中、高劑量組，e75疫苗分別以100、300、1000μg/ml與弗氏不完全佐劑(fia)1：1混合乳化30分鐘，pbs與弗氏不完全佐劑(fia)1：1混合乳化30分鐘作為陰性對照，乳化完成后，按照200μl/只分別對各組動物進行免疫，使各組動物的最終e75接種量分別為0、10、30、100μg/只。接種方式為皮下注射，接種部位為右側腋下，每周給藥一次，共免疫三次。

接種：第三次免疫后1周，收集對數生長期的人胃癌細胞nci-n87，制備成5×10⁶個/ml細胞懸液，以0.1ml種于小鼠左前肢腋下。

記錄：每天記錄各組動物的腫瘤發生情況，腫瘤長出后，用游標卡尺隔日測量腫瘤長徑和短徑，計算腫瘤體積；

tv＝1/2×a×b²，其中a、b分別表示長徑和短徑，并記錄各組動物體重。

評價：接種腫瘤四周后，處死所有小鼠，終止實驗，計算腫瘤發生率及抑瘤率并進行評價，

腫瘤發生率(％)＝各組有腫瘤長出的動物數/各組動物總數×100％

抑瘤率(％)＝(對照組腫瘤平均體積-實驗組腫瘤平均體積)/對照組腫瘤平均體積×100％。

數據處理：采用spss軟件進行統計學分析，采用單因素方差分析進行比較，p<0.05為差異有統計學意義。

結果：接種腫瘤25天后，陰性對照組、e75低、中、高劑量組的腫瘤發生率分別為93.3％、73.3％、46.7％、53.3％，其中中、高劑量組腫瘤發生率顯著低于陰性對照組(p＜0.05)(圖4)，顯示e75顯著降低了nci-n87腫瘤的發生率，與對照組相比，各治療組腫瘤體積抑制明顯(圖5)，證明建立的nci-n87動物模型可以用于e75預防效力的評價。同時，各組小鼠體重均略有增加，各組之間無顯著差異，表明e75安全性良好，該動物模型也可用于評價腫瘤疫苗的安全性(圖6)。

對于本領域技術人員而言，顯然本發明不限于上述示范性實施例的細節，而且在不背離本發明的精神或基本特征的情況下，能夠以其他的具體形式實現本發明。因此，無論從哪一點來看，均應將實施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本發明的范圍由所附權利要求而不是上述說明限定，因此旨在將落在權利要求的等同要件的含義和范圍內的所有變化囊括在本發明內。

此外，應當理解，雖然本說明書按照實施方式加以描述，但并非每個實施方式僅包含一個獨立的技術方案，說明書的這種敘述方式僅僅是為清楚起見，本領域技術人員應當將說明書作為一個整體，各實施例中的技術方案也可以經適當組合，形成本領域技術人員可以理解的其他實施方式。