專利名稱：具有基因藥物程序性釋放性能的金納米球殼載體及制備方法
技術領域：
本發明涉及具有基因藥物程序性釋放性能的金納米球殼載體及制備方法；以金納米球殼結構為基礎的具有基因藥物程序釋放性能的金納米球殼載體的制備方法，球殼里面負載抗癌藥物、球殼外面負載基因，用此方法構建的載體所負載的基因進入細胞后可以自動釋放到細胞質，藥物可以通過激光照射來激發釋放，因此該載體具有藥物基因的時序性釋放功能。
背景技術：
金納米材料具有比較獨特的物理化學特性，金納米球殼結構因為表面等離子體共振效應，在近紅外區有吸收峰，是比較理想的光熱轉換藥物和基因載體，在生物醫學上有重要意義。研究者已有利用脂質體為模板，在表面沉積金，形成納米空心球結構，并利用脂質 體載鹽酸阿霉素等抗癌藥物，用近紅外區脈沖激光照射金納米球殼，使球殼爆破，達到控制藥物釋放的目的。金納米球殼也被廣泛用于基因的載體，利用巰基與金的反應，將帶有巰基的陽離子性聚合物修飾在金納米空心球的表面，利用靜電吸附效應，將呆負電基因吸附在金納米空心球表面，研究表明，陽離子聚合物攜帶基因進入細胞后會將基因釋放到細胞質中，因此金納米球殼結構可以做為良好的基因投遞載體。研究表明，在腫瘤的治療過程中，基因和藥物聯合治療有助于增強腫瘤的治療效果，進一步的研究表明，因為藥物和基因的作用機理不同，因此藥物和基因的釋放的順序不同對聯合治療的效果有不同的影響。而現在對藥物和基因的時序性釋放并沒有一個很好的載體，現有的載體更多的是實現藥物和基因的同載，在進入細胞后不能夠根據需要來控制基因和藥物的釋放順序；另外也有研究者利用多種載體，分別載有基因和藥物，在不同時間段分批將分別載有藥物和基因的載體投遞到細胞中來研究時序性治療的問題，這種方法工作量很大，過程復雜，效率不高，而且并不能保證藥物和基因在同一個細胞當中起作用，沒有足夠的信服力。因此現在載體的限制使得基因和藥物的時序性治療的研究受到很大的限制，藥物和基因的時序性治療研究要取得突破必須構建一個良好的可實現基因藥物可控時序釋放的載體。因此本發明要利用金納米球殼結構構建一個具有時序性釋放基因和藥物功能的載體，該載體有本身的金的獨特的物理化學性質，毒性低，并且可以通過近紅外區的激光控制藥物的釋放，為基因和藥物的時序性治療的研究提供了重要的載體。
發明內容
本發明的目的在于利用金納米球殼結構，構建一個具有基因和藥物時序性釋放功能的載體。本發明制備具有基因藥物時序性釋放性能的金納米球殼結構載體，其金納米球殼內部空腔結構載藥，藥物可通過脈沖激光激發釋放，球殼外面接陽離子聚合物來負載帶負電的基因，可以在細胞中自行釋放。所述用來負載基因的陽離子聚合物是聚組氨酸，分子量大于5000.所述載體中，用來負載的基因為20-100個堿基的RNA。本發明的構建具有基因藥物時序性釋放性能的金納米球殼結構的方法，步驟如下a.將總物質的量為O. 5-1. 5umol的二肉豆蘧酰磷脂酸和二肉豆蘧酰磷脂酰膽堿按照1:1的比例溶解在ImL氯仿和甲醇的混合溶液中，在脂質體形成過程中加入親水性的藥物鹽酸阿霉素，使得鹽酸阿霉素的濃度為30nM，加入1-1. 5mg的陽離子聚合物聚組氨酸或者聚賴氨酸，加入10-15uL質量分數為1%的氯金酸溶液和20-30uL濃度為20mM的鹽酸輕胺，形成載藥的金納米球殼結構； b.用Immol的Traut’ s試劑與l_2mg聚組氨酸反應,修飾出巰基,利用巰基與金的反應，將反應后的聚組氨酸加入O. 5-1. 5mL的金納米球殼溶液中，聚組氨酸的側基咪唑基帶正電，而基因帶負電，因此分別將2倍，8倍，16倍，32倍，64倍載藥的金納米球殼溶液與等量as-micro-RNA-21或者Danio rerio microRNA 146b_l溶液混合時，可以得到復合物·所述的步驟a還可以采用如下方法在600mL濃度為O. 2mM硝酸銀溶液中加入O. 6_lmL濃度為I. OM硼氫化鈉和O. 5mM檸檬酸鈉水溶液，將溶液攪拌均勻，再往溶液里加入O. 6-lmL的2. OM鹽酸羥胺和I. 5mL的
O.IM的硝酸銀溶液，攪拌過夜，形成比較大的銀顆粒。快速將3. 8-5mL濃度為25mM的氯金酸溶液和銀納米粒子混合，得到金納米球孔洞結構，將溶液避光保存一星期。將上述得到的溶液用20000分子量的透析卡在1500mL的500uM的檸檬酸鈉緩沖溶液(pH=5. 5)中透析提純，得到金納米球孔洞結構的溶液。然后加入鹽酸阿霉素，使得溶液中鹽酸阿霉素濃度為40-60nM，加入三乙胺，使得溶液中三乙胺的濃度為40-60nM，形成載藥的金納米孔洞結構。本發明的原理是利用金納米球殼或者帶孔洞的金納米球結構載藥，在金納米球殼表面利用巰基修飾上陽離子性的聚合物(聚組氨酸)，將帶負電的基因吸附在陽離子聚合物上，帶巰基的PEG同時修飾在金的表面，用以保護基因。吸附在陽離子聚合物上的基因進入細胞后會釋放到細胞質中，而金納米球殼載的藥物可以通過脈沖激光控制釋放，從而控制基因和藥物的時序性釋放。本發明所用金納米球殼結構或帶孔洞的金納米球殼結構可以用以前研究者所用方法，可以以陰離子脂質體為模板制備金納米球殼結構時，將O. 5-1. 5umol的DMPA和DMPC按照1:1的比例溶解在ImL氯仿和甲醇的混合溶液中，在脂質體形成過程中加入親水性的藥物鹽酸阿霉素，使鹽酸阿霉素濃度為30mM，加入1-1. 5mg的陽離子聚合物(聚組氨酸或者聚賴氨酸)，加入10-15uL質量分數為1%的氯金酸和2倍體積濃度為20mM的鹽酸羥胺，形成載藥的金納米球殼結構；利用模板法制備金納米孔洞結構時，用置換法形成金納米孔洞結構，在600mL濃度為O. 2mM硝酸銀溶液中加入O. 6-lmL濃度為I. OM NaBH4和O. 5mM檸檬酸鈉水溶液，將溶液攪拌幾個小時，再往溶液里加入O. 6-lmL的2. OM鹽酸羥胺和I. 5mL的O. IM的硝酸銀溶液，攪拌過夜，形成比較大的銀顆粒。快速將3. 8-5mL濃度為25mM的HAuCl4溶液和銀納米粒子混合，得到金納米球孔洞結構，將溶液避光保存一星期。將上述得到的溶液用20000分子量的透析卡在1500mL的500uM的檸檬酸鈉緩沖溶液(pH=5. 5)中透析提純，得到金納米球孔洞結構的溶液。然后加入鹽酸阿霉素，使得鹽酸阿霉素濃度為40-50nM，加入三乙胺，使得三乙胺的濃度為40-50nM，形成載藥的金納米孔洞結構。本發明利用陽離子性聚合物聚組氨酸在金納米球殼結構的表面負載基因，用Immol的Traot’ s試劑與l_2mg聚組氨酸反應,修飾出巰基,利用巰基與金的反應,將反應后的聚組氨酸加入O. 5-1. 5mL的金納米球殼溶液中，聚組氨酸的側基咪唑基帶正電，而基因帶負電，因此分別將2倍，8倍，16倍，3 2倍，6 4倍載藥的金納米球殼溶液與等量as-micro-RNA-21或者Danio rerio microRNA 146b_l溶液混合時，可以得到復合物·聚組氨酸修飾巰基的反應為
權利要求
1.制備具有基因藥物時序性釋放性能的金納米球殼結構載體，其特征是金納米球殼內部空腔結構載藥，藥物通過脈沖激光激發釋放，球殼外面接陽離子聚合物來負載帶負電的基因，在細胞中自行釋放。
2.如權利要求I所述載體，其特征是用來負載基因的陽離子聚合物是聚組氨酸，分子量大于5000。
3.如權利要求I所述載體，其特征是用來負載的基因為20-100個堿基的RNA。
4.構建權利要求I的具有基因藥物時序性釋放性能的金納米球殼結構的方法，其特征是步驟如下 a.將總物質的量為0.5-1. 5umol的二肉豆蘧酰磷脂酸和二肉豆蘧酰磷脂酰膽堿按照1:1的比例溶解在ImL氯仿和甲醇的混合溶液中，在脂質體形成過程中加入親水性的藥物鹽酸阿霉素，使得鹽酸阿霉素的濃度為30nM，加入1-1. 5mg的陽離子聚合物聚組氨酸或者聚賴氨酸，加入10-15uL質量分數為1%的氯金酸溶液和20-30uL濃度為20mM的鹽酸羥胺，形成載藥的金納米球殼結構； b.用Immol的Traut’s試劑與l_2mg聚組氨酸反應,修飾出巰基,利用巰基與金的反應，將反應后的聚組氨酸加入0. 5-1. 5mL的金納米球殼溶液中，聚組氨酸的側基咪唑基帶正電，而基因帶負電，因此分別將2倍，8倍，16倍，32倍，64倍載藥的金納米球殼溶液與等量as-micro-RNA-21或者Danio rerio microRNA 146b_l溶液混合時，可以得到復合物。
5.如權利要求4所述的方法，其特征是所述的步驟a為 在600mL濃度為0. 2mM硝酸銀溶液中加入0. 6_lmL濃度為I. OM硼氫化鈉和0. 5mM檸檬酸鈉水溶液，將溶液攪拌均勻，再往溶液里加入0. 6-lmL的2. OM鹽酸羥胺和I. 5mL的0. IM的硝酸銀溶液，攪拌過夜，形成比較大的銀顆粒。快速將3. 8-5mL濃度為25mM的氯金酸溶液和銀納米粒子混合，得到金納米球孔洞結構，將溶液避光保存一星期。將上述得到的溶液用20000分子量的透析卡在1500mL的500uM的檸檬酸鈉緩沖溶液(pH=5. 5)中透析提純，得到金納米球孔洞結構的溶液。然后加入鹽酸阿霉素，使得溶液中鹽酸阿霉素濃度為40-60nM，加入三乙胺，使得溶液中三乙胺的濃度為40-60nM，形成載藥的金納米孔洞結構。
全文摘要
本發明涉及具有基因藥物程序性釋放性能的金納米球殼載體及制備方法，球殼里面載藥物，球殼外面修飾陽離子聚合物，用來負載基因。陽離子聚合物負載的基因進入細胞可以釋放，球殼里載的藥物可以通過激光激發釋放，實現基因藥物的時序性釋放。金納米球殼結構可以以脂質體為模板制備，將脂質體載鹽酸阿霉素的親水抗癌藥，然后在脂質體的表面沉積一層金，形成載藥的金納米球殼結構。或用銀置換法，得到金納米球孔洞結構，再進行載藥。利用Traut’s試劑和聚組氨酸的氨基反應，讓聚組氨酸的一段帶巰基，然后接在金納米球殼的表面，利用靜電作用負載基因。構建的以金納米球殼為載體的時序性藥物基因釋放系統為藥物和基因的時序性治療提供了一個較好的平臺。
文檔編號A61K47/34GK102805870SQ20121016812
公開日2012年12月5日 申請日期2012年5月25日 優先權日2012年5月25日
發明者高立章, 劉貴高, 原續波, 何芳 申請人:天津大學