具有葉酸靶向功能的ct/mr雙模態成像納米造影劑的制備的制作方法

專利名稱：具有葉酸靶向功能的ct/mr雙模態成像納米造影劑的制備的制作方法
技術領域：
本發明屬于CT/MR雙模態成像納米造影剤的制備領域，特別涉及ー種具有葉酸靶向功能的CT/MR雙模態成像納米造影剤的制備方法。
背景技術：
癌癥已經成為危害全世界人類健康的主要殺手之一，而癌癥被檢測出的越早，則治愈的可能性就越高。研究表明癌癥可以實現早期檢測，則將有30%的癌癥患者得以生存(Action Plan for the Global Strategy for tne Prevention and Control ofNoncommu-nicable Diseases. World Health Organization, 2008, 2008 - 2013http://www.who. int/nmh/pub I ica-t ions/9789241597418/en/index, html )。因此發展癌癥的早期檢測 技術是攻克癌癥治療的關鍵。CT成像和MR成像是目前臨床上用于診斷癌癥的常用手段，它們具有較高的空間分辨率，因此受到了廣泛的研究。但是這種單ー的CT成像或MR成像獲取的信息有限，而CT/MR雙模態成像可以提高診斷效率、獲取更多信息，并降低造影劑對病人的副作用和醫療費用。同時CT成像和MR成像獲得的數據可以相互補充、相互驗證，從而得到更加準確的診斷信息。CT/MR雙模態成像開發的關鍵是需要研發出合適的造影剤，使其可以同時應用于CT和MR成像。目前已報道的用于CT/MR雙模態成像的造影剤有通過巰基集團將釓離子修飾在金納米顆粒表面的納米顆粒(Deboutt i6re, P. J. et al. Adv. Funct.Mater. 2006，16，2330-2339)、具有核殼結構的金納米顆粒(Van Schooneveld, Μ. M. etal. Contrast Media Mol. Imaging. 2010, 5, 231-236)以及 FePt 合金(Chou, S. W. etal. J. Am. Chem. Soc. 2010, 132，13270-13278)。然而這些納米造影總是存在這樣或那樣的不足，例如在生物體內的循環周期比較短，很難靶向定位在腫瘤部位。Alric等人(Alric，C.et al. J. Am. Chem. Soc. 2008130, 5908-5915)合成的 AuODTDTPA-Gd 納米顆粒可以應用于活體CT/MRI雙模態成像，但是這種納米顆粒在釓離子濃度達到MR成像時(例如5mM)，金納米顆粒的濃度比較低(10mg/mL)，無法達到同時應用與CT成像的要求。而且AuODTDTPA-Gd的代謝速度相對還是較快，在注射45min后有大量造影剤集中在老鼠膀胱處。為了解決納米造影劑的這些問題，需要尋找合適的材料作為納米造影劑的載體，要求這種載體劑不僅可以提高造影剤的生物相容性，而且要求載體易于表面功能化，從而可以進行表面修飾以提高造影剤在血液中的循環周期，還可以通過修飾合適的靶向試劑，提高造影剤的選擇靶向性，使其滿足CT/MR雙模態成像的要求。目前受到廣泛關注的是聚酰胺-胺型(PAMAM)樹狀大分子。PAMAM是ー種新穎的高度支化的具有精確的成分和結構的大分子，其表面具有大量的官能團，可以連接藥物分子、靶向試劑、染料等，同時其內部具有大量的空腔，可以包裹納米顆粒，從而提高納米顆粒的穩定性。例如將PAMAM的表面氨基こ酰化之后可以明顯改善樹狀大分子的生物相容性，將聚こニ醇修飾在樹狀大分子表面可以較好的延長材料在血液中的循環時間。又如Shi等人(Shi, X. Y. et al. Small. 2007，3 (7)，1245-1252)將葉酸分子修飾在第五代聚酰酰胺樹狀大分子上，通過實驗證明了修飾葉酸后的聚酰酰胺樹狀大分子具有較好的靶向性。因此樹狀大分子是ー種優異的納米顆粒載體。Au納米顆粒由于具有良好的生物相容性、表面易于修飾、對X射線有較高的吸收等性質，已經被廣泛的研究以用于癌癥的早期檢測。例如，Shi等人(Shi, X. Y. et al. Smal
I.2007, 3(7), 1245-1252; Shi, X. Y. et al. Analyst 134(7)，1373-1379)利用樹狀大分子包裏、穩定金納米顆粒不僅可以提高金納米顆粒的水溶性，而且可以用于CT成像。同時已經有很多報道將Gd離子用于MR成像，而且有研究表明大量釓離子的存在不僅可以用于MR成像，還可利用釓離子對X射線的吸收用于CT成像。因此，可以通過將包裹有Au納米顆粒的樹狀大分子表面螯合釓離子，用于CT/MR雙模態成像。同時通過表面進ー步修飾聚こニ醇提高材料在血液中的循環周期，并且通過靶向試劑葉酸的修飾，使材料在生物活體內對腫瘤具有靶向作用。因此以PAMAM樹狀大分子作為CT/MR雙模態成像納米造影劑的載體，開發具有靶向的CT/MR雙模態成像造影剤，將為癌癥的早期診斷帶來了新的曙光。史向陽、溫詩輝等已經合成了聚こニ醇修飾的螯合有釓離子的樹狀大分子包裹的金納米顆粒(CN102294038A，2011年12月28日公開)，并且將其應用于CT/MR雙模態納米·造影剤，但是這種材料在腫瘤檢測方面只能通過實體瘤的高通透性和滯留效應(enhancedpermeability and retention effect,EPR)被動革巴向腫瘤,無法很好的實現對生物體的癌癥的早期檢測。為了達到更好的早期檢測癌癥的效果，我們將材料進ー步功能化，通過在樹狀大分子表面修飾葉酸分子，使材料對具有對葉酸高受體表達的癌細胞的特異性靶向效果，提高材料在腫瘤部位的富集，以達到用CT/MRI雙模態的模式對癌癥進行早期檢測的目的。檢索國內外有關CT/MRI雙模態造影剤方面的文獻和專利結果表明目前還未見使用葉酸修飾包裹有金納米顆粒的樹狀大分子用于靶向的CT/MRI雙模態成像納米造影剤的報道。

發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供ー種具有葉酸靶向功能的CT/MR雙模態成像納米造影剤的制備方法，該方法エ藝簡単，反應條件溫和，具有產業化實施，且制備的金納米顆粒不僅提高了金納米顆粒的負載量和穩定性，還具有潛在應用于CT/MRI雙模態成像來靶向診斷腫瘤的可能。本發明ー種具有葉酸靶向功能的CT/MR雙模態成像納米造影剤的制備方法，包括(I)在葉酸的ニ甲亞砜溶液中加入EDC活化2_5h，然后邊攪拌邊滴加NH2-PEG-C00H的ニ甲亞砜溶液，反應7(T80h后，將反應產物透析，最后冷凍干燥得到葉酸修飾的聚こニ醇固體產物FA-PEG-C00H ；(2)在樹狀大分子的ニ甲亞砜溶液中攪拌邊滴加DOTA-NHS(購于CheMatech公司，化學名'2,2’，2” -(10-(2-(2, 5- ニ氧代卩比咯燒-I-氧基)-2-氧こ基)-I, 4, 7, 10-四氮雜環十二烷-1，4，7-三)三こ酸)的ニ甲亞砜溶液，反應20-30h，得到樹狀大分子溶液；然后將步驟(I)得到的FA-PEG-C00H (購于上海炎怡生物科技有限公司)溶解于ニ甲亞砜中，并使用EDC活化后，逐滴加入到上述樹狀大分子溶液中，反應40-90h后，再加入用EDC活化后的PEG-COOH，反應40-90h后透析，最后冷凍干燥得固體；(3)將步驟(2)所得固體用ニ甲亞砜或水溶解后，加入氯金酸溶液，然后在室溫下攪拌20-50min，隨后加入NaBH4溶液，再在室溫下攪拌反應l_5h后，逐滴加入Gd(NO3)3溶液反應20-30h ;然后加入三こ胺，攪拌混合20-50min后，再向反應液中加入こ酸酐，在室溫下攪拌反應20-30h，將反應產物透析，最后冷凍干燥，得到葉酸和聚こニ醇修飾的螯合了釓離子的樹狀大分子 / 金納米粒子({(Au0) 200 - G5. NHAc-DOTA (Gd III) 10-PEGn-FA5} DENPs )。

步驟(I)中所述的葉酸的ニ甲亞砜溶液中二甲亞砜與葉酸的用量比為20mL 29 39mg ;所述的NH2-PEg-COOH的ニ甲亞砜溶液中NH2-PEG-C00H的干重與ニ甲亞砜的用量比為 65. 73 88. 40mg lmL ；EDC 的用量為 126 169mg。步驟(I)中所述的NH2-PEg-COOH為一端是羧基另一端是氨基的聚こニ醇，其分子量為2000。步驟(I)中所述的葉酸與NH2-PEg-COOH的摩爾比為3:1。步驟(2)中所述的樹狀大分子的ニ甲亞砜溶液中樹狀大分子與ニ甲亞砜的用量比為2(T30mg 15mL ;所述的DOTA-NHS的ニ甲亞砜溶液中DOTA-NHS的干重與ニ甲亞砜的用量比為5. 89 8. 83mg 5mL ;所述的步驟(I)得到的FA-PEG-C00H的用量為14. 99 22. 49mg，PEG-COOH 的干重為 23. 19 34. 80mg。步驟(2)中所述的樹狀大分子為第5代聚酰胺-胺型樹狀大分子(美國Dendritech 公司)。步驟(2)中所述的FA-PEG-C00H、DOTA-NHS, PEG-COOH與樹狀大分子的摩爾比為5:10:6:10步驟(3)所述的氯金酸溶液的濃度為24. 8mg/mL，其用量與樹狀大分子的用量比為 2. 12 3. 18mL :20 30mg。步驟(3)所述的NaBH4溶液中的溶劑為體積比2:1的H2O與CH3OH的混合液，NaBH4的用量與樹狀大分子的用量比為29. 25 43. 88mg :2(T30mg。步驟(3)中所述的三こ胺、こ酸酐和樹狀大分子的用量比為59.27 88.9yL:48. 27 72. 4μ L :20 30mg。步驟(3)中所述的NaBH4與氯金酸的摩爾量之比為5:1 ;氯金酸與樹狀大分子的摩爾比為200:1 ;Gd(NO3)3與樹狀大分子的摩爾比為35:1。步驟(3)中所述的三こ胺、こ酸酐和樹狀大分子的摩爾比為660:50:1。步驟(I)、(2)和(3)中所述的透析均為用透析膜先在PBS緩沖液中透析20_30h，然后再在蒸餾水透析40-60h。上述的透析膜為纖維素透析膜MWcO=IOOO。本發明的一種葉酸修飾的螯合有釓離子的樹狀大分子包裹的金納米顆粒用于CT/MR雙模態成像。本發明使用核磁共振氫譜(1H NMR)、紫外一可見分光光度計(UV-Vis)、透射電子顯微鏡(TEM)、元素分析(ICP-AES )、CT成像和MR成像等方法表征本發明制備的葉酸修飾的螯合有Gd的樹狀大分子包裹的Au納米顆粒，具體測試結果如下(I) 1H NMR 譜核磁共振氫譜結果證實了 {(Au0) 200-G5. NHAc-DOTA (Gd III) 10-PEGn-FA5} DENPs 的結構正確，見附圖I。(2) UV-Vis 測試結果合成的{(Au0) 200-G5. NHAc-DOTA (Gd III) 10-PEGn-FA5} DENPs 在 280nm 和 5IOnm 左右都有ー個特征吸收峰，它們分別是葉酸分子的特征吸收峰和金納米顆粒的表面等離子體共振峰，參見附圖2 ;葉酸修飾的螯合有釓離子的樹狀大分子包裹的金納米顆粒能穩定分散在水中，且在不同的pH值(pH=4. 0-8. O)和不同溫度(4°C _50°C )范圍內均具有非常好的穩定性，這說明合成的金納米顆粒具有較好的穩定性，參見附圖3 ；(4) TEM測試結果{(Au0) 200 - G5. NHAc-DOTA (Gd III) 10-PEGn-FA5} DENPs 的 TEM 圖片和粒度分布直方圖(參見附圖4)表明本方法合成的金納米顆粒的粒徑分布均勻，平均粒徑約為4±1. 2nm。{(Au0) 200 - G5. NHAc-DOTA (Gd III) 10-PEGn-FA5} DENPs 的高分辨 TEM 圖片(見附圖4c)和選區電子衍射圖表明所合成的金納米顆粒晶化程度比較高。(111)、(200)、(220)和(311)環說明所合成的金納米顆粒呈面心立方(fee)晶體結構。(5 )體外CT和MR成像性能將合成的材料((Au0)200 - G5. NHAc-DOTA (Gd III ) 10-PEGn-FA5} DENPs 配制成一系列的濃度，通過CT、MR成像，測量計算材料的X射線吸收性和巧弛豫率(見附圖
5);結果發現該材料具有比對比材料{(Au0) 200 - G5. NHAc-DOTA10-PEGn-FA5}DENPs稍高的X射線吸收性以及相對較好的CT成像效果；由于金納米顆粒的存在，{(Au0) 200 - G5.NHAc-DOTA (Gd III ) 10-PEGn-FA5} DENPs 的巧弛豫率(3· 139ι Μ )約為對比材料G5. NHAc-DOTA (Gd III) 10-PEGn-FA5 (6· 022ι Μ )的一半，但是合成的材料{(Au0) 200 - G5.NHAc-DOTA (Gd III) ^PEG1 rFA5} DENPs 仍然具有較好的 MR 成像效果。(6) MTT細胞活力檢測及細胞形貌觀察將不同濃度的材料與細胞共培養，通過MTT毒性檢測，可以看到在金納米顆粒的濃度高達200 μ M時也未見較為明顯的毒性，同時通過細胞形貌也可以看到材料處理的細胞與對照細胞相比形貌沒有明顯的變化(見附圖6，7 )。(7) ICP分析KB細胞對材料靶向吞噬作用
將高葉酸受體KB細胞(HFKB)和低葉酸受體KB細胞(LFKB)分別與{(Au°) 200-G5.NHAc-DOTA (Gd III ) K1-PEG11-FA5I DENPs (金的濃度分別為 0、10、40μΜ)共培養 3h 后，通過ICP檢測單個HFKB和LFKB細胞對金納米顆粒的吞噬量，結果發現高HFKB對材料的吞噬量要大于LFKB對材料的吞噬量，從而證明了合成的材料{(Au0) 200-G5.NHAc-DOTA (Gd III) 10-PEGn-FA5} DENPs對HFKB細胞具有特異性靶向作用(見圖8)。 (8)體外材料靶向KB細胞的CT/MR雙模態成像HFKB 和 LFKB 細胞分別與{(Au0) 200 - G5. NHAc-DOTA (Gd III) 10-PEGn-FA5} DENPs (金的濃度分別為10、20、40、8(^10共培養311后，然后將細胞消化離心并用150 μ L PBS緩沖液將其懸浮在離心管中，隨后進行CT掃描和MR成像(見圖9)，實驗結果發現在MR成像中，不同金濃度下與HFKB細胞共培養后處理的細胞懸浮液的MR信號比LFKB細胞懸浮液高；相似的在CT成像中，不同金濃度下與HFKB細胞共培養后處理的細胞懸浮液的CT信號比LFKB細胞懸浮液高。這個結果也證明了合成的材料{(Au0) 200 - G5. NHAc-DOTA (Gd III) 10-PEGn-FA5}DENPs對高受體的KB細胞具有特異性靶向作用。
有益效果(I)本發明的制備エ藝簡單，反應條件溫和，具有產業化實施的前景；(2)本發明設計合成的葉酸修飾的螯合有釓離子的樹狀大分子包裹的金納米顆粒具有較好的水溶性、穩定性、較低的細胞毒性、較高的X-射線衰減系數和合適的弛豫率；(3)本發明的葉酸修飾的螯合有釓離子的樹狀大分子包裹的金納米顆粒對葉酸受體過表達的腫瘤細胞具有較好的靶向性，同時可以用于CT/MR雙模態成像，具有靶向診斷腫瘤部位的潛力，因此有望應用于腫瘤的早期檢測。



圖I 為本發明制備的{(Au0) 200 - G5. NHAc-DOTA (Gd III) 10-PEGn-FA5} DENPs 的 1HNMR ；圖2 為本發明制備的{(Au0) 200 - G5. NHAc-DOTA (GdIII) 10-PEGn-FA5} DENPs 在 25°C、pH=7. O的紫外吸收光譜圖；圖3 為本發明制備的{(Au0) 200-G5. NHAc-DOTA (Gd III) ^pEG11-FA5I DENPs 在不同溫度(a)和不同pH值(b)下的UV-Vis譜圖；圖4 為本發明制備的{ (Auci)2qq-GS. NHAc-DOTA (Gd III) 10-PEGn-FA5} DENPs 的(a)TEM圖片；(b)粒徑分布圖；(c)高分辨TEM圖片；(d)選區電子衍射；圖5 為本發明制備的{(Au°)2QQ-G5· NHAc-DOTA (Gd III) W-PEG11-FA5I DENPs 材料在體外的CT (a)、MR (C)成像及X射線吸收性(b)和巧弛豫率(d);圖6 為本發明制備的{(Au0) 200-G5. NHAc-DOTA (Gd III) 10-PEGn-Fk5\ DENPs 材料在金的濃度0-200 μ M與KB細胞共培養24h后的細胞活力；圖7 為本發明制備的{(Au0) 200-G5. NHAc-DOTA (Gd III) 10-PEGn-Fk5\ DENPs 材料在金的濃度分別為 O (a)，5 (b)，10 (c)，25 (d)，35 (e)，50 (f)，100 (g)，200 (h) μ M 與 KB 細胞共培養24h后的細胞形貌；圖8 為本發明制備的{(Au0) 200 - G5. NHAc-DOTA (Gd III) 10-PEGn-FA5} DENPs 在金的濃度O、10、40 μ M下分別與HFKB和LFKB細胞共培養3h后，通過ICP分析得到的兩種細胞對金納米顆粒的吞噬量；圖9 為本發明制備的{(Au0) 200 - G5. NHAc-DOTA (Gd III) 10-PEGn-FA5} DENPs 材料在金的濃度10、20、40、80 μ M分別與HFKB細胞和LFKB細胞共培養3h后，MR成像(a)、MR信號值(b)、CT成像(c)和CT信號值(d)；圖10 為本發明制備{(Au0) 200 - G5. NHAc-DOTA (Gd III) W-PEG11-FA5I DENPs 的簡易流程圖。
具體實施例方式下面結合具體實施例，進ー步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。此外應理解，在閱讀了本發明講授的內容之后，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。實施例I
(I)用20mL的ニ甲亞砜溶液稀釋39mg的葉酸，使用169mg的EDC活化3h，然后邊攪拌邊逐滴滴加溶于ImL ニ甲亞砜的干重為88. 40mg的聚こニ醇(NH2-PEG_C00H)，反應7(T80h后，將反應產物用透析膜在緩沖液中透析24h，然后在用蒸餾水透析48h，最后將純化的產物冷凍干燥得到葉酸修飾的聚こニ醇固體產物(FA-PEG-C00H)；(2)用15mL的ニ甲亞砜溶液溶解干重為30mg的第5代聚酰胺-胺型(PAMAM)樹狀大分子，然后邊攪拌邊滴加溶于5mL ニ甲亞砜溶液的干重為8. 83mg的DOTA-NHS，反應24h，然后取(I)中所得的FA-PEG-C00H 22. 49mg,溶解在5mL ニ甲亞砜溶液并使用EDC活化過后逐滴加入樹狀大分子溶液，反應72h后再將干重為34. SOmg的使用EDC活化的一端是羧基的聚こニ醇(PEG-COOH)，反應72h后反應產物用透析膜在緩沖液中透析24h，然后在用蒸餾水透析48h，最后將純化的產物冷凍干燥得固體；(3)將步驟(2)得到的固體用ニ甲亞砜或水將其溶解后，再加入3. ISmL氯金酸溶液(24. 8mg/mL),然后在室溫下攪拌30min,隨后加入NaBH4溶液(43. 88mg),在室溫下攪拌反應2h后逐滴加入18. 22mg Gd (NO3)3溶液反應24h ;然后再加入88. 9 μ L三こ胺，攪拌混合30min后，向反應液中加入72. 4μ Lこ酸酐，在室溫下攪拌反應24h，隨后將反應產物用透析膜在緩沖溶液和蒸餾水中透析，最后將純化后的產物冷凍干燥得到葉酸、聚こニ醇修飾的螯合了釓離子的樹狀大分子/金納米粒子({(Au0) 200 - G5. NHAc-DOTA (Gd III) 10-PEGn-FA5}DENPs)ο合成過程中對表面修飾后的樹狀大分子使用核磁手段進行表征，并對各個峰進行積分計算可知樹狀大分子表面修飾了 8. 8個DOTA分子，5個FA-PEG-C00H分子和6個mPEG 分子。對得到的產品{(Au0) 200 - G5. NHAc-DOTA (Gd III) 10-PEGn-FA5} DENPs 進行紫外吸收表征如附圖2，納米金顆粒的表面等離子體共振(SPR)峰約在528nm，證明了金納米顆粒的形成；葉酸分子的紫外吸收特征峰約在280nm處，證明了金納米顆粒的形成。同時通過在不同溫度、PH值下，產物溶液的紫外吸收特征峰并沒有明顯的變化，這所所合成的材料具有較好的穩定性(附圖3)。通過TEM圖片(附圖4)表明金納米顆粒尺寸分布較窄，具有良好的水分散性，粒徑尺寸約4. Onm。進ー步以電感耦合等離子體發射光譜儀(ICP)測定產物中Au和Gd的含量，結果表明平均每個樹狀大分子的載金量為193個金原子，載釓量為28個Gd(III)離子，這些測試結果表明已成功制備了設計合成的功能化的樹狀大分子{(Au0) 200 - G5. NHAc-DOTA (Gd III) 10-PEGn_FA5} DENPs。實施例2(I)用20mL的ニ甲亞砜溶液稀釋29mg的葉酸，使用125. 67mg的EDC活化3h，然 后邊攪拌邊逐滴滴加溶于ImL ニ甲亞砜的干重為65. 73mg的聚こニ醇(NH2-PEG-C00H)，反應7(T80h后，將反應產物用透析膜在緩沖液中透析24h，然后在用蒸餾水透析48h，最后將純化的產物冷凍干燥得到葉酸修飾的聚こニ醇固體產物(FA-PEG-C00H)；(2)用15mL的ニ甲亞砜溶液溶解干重為20mg的第5代聚酰胺-胺型(PAMAM)樹狀大分子，然后邊攪拌邊滴加溶于5mL ニ甲亞砜溶液的干重為5. 89mg的DOTA-NHS，反應24h，然后取(I)中所得的FA-PEG-C00H 14. 99mg,溶解在5mL ニ甲亞砜溶液并使用EDC活化過后逐滴加入樹狀大分子溶液，反應72h后再將干重為23. 20mg的使用EDC活化的一端是羧基的聚こニ醇(PEG-COOH)，反應72h后反應產物用透析膜在緩沖液中透析24h，然后在用蒸餾水透析48h，最后將純化的產物冷凍干燥；
(3)將步驟(2)得到的固體用水將其溶解后，再加入2. 12mL氯金酸溶液(24. 8mg/mL)，然后在室溫下攪拌30min，隨后加入NaBH4溶液(29. 25mg)，在室溫下攪拌反應2h后逐滴加入12. 15mg Gd(NO3)3溶液反應24h;然后再加入59. 27 μ L三こ胺，攪拌混合30min后，再向反應液中加入48. 27 μ Lこ酸酐，在室溫下攪拌反應24h，隨后將反應產物用透析膜在緩沖溶液和蒸餾水中透析，最后將純化后的產物冷凍干燥得到葉酸、聚こニ醇修飾的螯合了釓離子的樹狀大分子/金納米粒子({(Au0) 200 - G5. NHAc-DOTA (Gd III) 10-PEGn-FA5}DENPs)ο合成過程中對表面修飾后的樹狀大分子使用核磁手段進行表征，并對各個峰進行積分計算可知樹狀大分子表面修飾了 8. 8個DOTA分子，5個FA-PEG-C00H分子和6個mPEG 分子。對得到的產品{(Au0) 200 - G5. NHAc-DOTA (Gd III) ^-PEG11-FA5I DENPs 進行紫外吸收表征如附圖2，納米金顆粒的表面等離子體共振(SPR)峰約在528nm，證明了金納米顆粒的形成；葉酸分子紫外特征吸收峰約在280nm處，證明了葉酸的成功修飾。同時通過在不同溫度、PH值下，產物溶液的紫外吸收特征峰并沒有明顯的變化，這所所合成的材料具有較好的穩定性(附圖3)。通過TEM圖片(附圖4)表明金納米顆粒尺寸分布較窄，具有良好的水分散性，粒徑尺寸約4. Onm。進ー步以電感耦合等離子體發射光譜儀(ICP)測定產物中Au和Gd的含量，結果表明平均每個樹狀大分子的載金量為193個金原子，載釓量為28個Gd(III)離子，這些測試結果表明已成功制備了設計合成的功能化的樹狀大分子{(Au°)2(ici-G5.NHAc-DOTA (Gd III) 1(l-PEGn-FA5} DENPs。實施例3為了研究材料的實例I與對比材料I所合成的材料{(Au0) 200 - G5.NHAc-DOTA (Gd III U-PEG11-FAJ DENPs 與材料((Auci)2cici-Gs-Nhac-DotAici-PEG11-FAsIDENPs的X射線吸收性和CT成像效果，我們使用體外CT成像并通過測量計算HU值進行證明。取實例 I 中{(Au0) 200 - G5. NHAc-DOTA (Gd III ) 10-PEGn-FA5} DENPs 20. 29mg 溶解在IOOOyL PBS溶液中，配制成金納米的濃度為O. 08M，在通過一系列的稀釋形成金濃度分別為O. 05、0. 04、0. 02、0. OlM 的PBS 溶液各200 μ L ;同樣的取對比例I中{(Au0) 200-G5. NHAc-DOTA10-PEGn-FA5} DENPs 20. 6 Img 溶解在 1000 μ LPBS 溶液中，配制成金納米的濃度為O. 08Μ，在通過一系列的稀釋形成金濃度分別為O. 05,0. 04,0. 02、
O.OlM的PBS溶液各200 μし通過CT掃描測試(附圖5)，可以觀察到在一系列濃度下，樣品{(Au0) 200-G5. NHAc-DOTA (Gd III) 10-PEGn-FA5} DENPs 的 CT 成像比樣品{(Au0) 200-G5.NHAc-DOTA (Gd III ) w- EGn-Fk5} DENPs相對要亮(附圖5a)，同時通過測量HU值，可以看到樣品{(Au0) 200-G5. Nhac-DOTaio-PEG1 rFA5} DENPs 的 HU 值要比樣品{(Au0) 200-G5.Nhac-DOTaio-PEG1 rFA5} DENPs的要略高(附圖5b)，這些結果證明了實例I中的樣品{(Au0) 200-G5. NHAc-DOTA (Gd III) ^-PEG11-FA5I DENPs 對 X 射線的吸收性較好，具有相對比較好的CT成像效果，同時也說明了釓離子的存在増加了金納米顆粒的CT成像效果。實施例4為了研究材料的實例I與對比材料2所合成的材料{(Au0) 200 - G5.NHAc-DOTA (Gd III ) 10-PEGn-FA5} DENPs 與材料 G5. NHAc-DOTA (Gd III ) ^PEG1「FA5 的 r!值和MR成像效果，我們使用體外MR成像并通過測量計算^值進行證明。取實例I中{(Au0) 200 - G5. NHAc-DOTA (Gd III) 1(l-PEGn-FA5} DENPs O. 5 Img 溶解在 800 μ L PBS 溶液中，配制成金納米的濃度為O. 4mM，在通過一系列的稀釋形成釓離子濃度分別為O. 2、0. I、
0.05mM 的 PBS 溶液各 200 μ L ;同樣的取對比例 2 中 G5. NHAc-DOTA (Gd IID10-PEG11-FA5O. 3Img溶解在800 μ L PBS溶液中，配制成釓離子的濃度為O. 4mM，在通過一系列的稀釋形成釓離子濃度分別為O. 2、0. 1、0.05禮的？85溶液各20(^し通過MR掃描測試(附圖5)，可以觀察到在一系列濃度下，樣品G5. NHAc-DOTA (Gd III) 1(l-PEGn-FA5的MR成像比樣品((Au0) 200 - G5. NHAc-DOTA (Gd III) 1Q-PEGn-FA5} DENPs 相對要亮(附圖 5a)，同時通過計算巧值，可以看到樣品{ (Auq)2qq - G5. Nhac-DOTaio-PEG1 rFA5} DENPs 的巧值為 3. 139^-1 s'樣品G5. NHAc-DOTA(Gdm)1CrPEG11-FA5的巧值為6· 022ι Μ 。同時通過MR成像圖片可以看到雖然合成材料{ (Auq)2qq - G5. NHAc-DOTA (Gd III) 10-PEGn-FA5} DENPs 的 MR 成像效果低于對比材料，但是合成材料仍然具有較好的MR成像效果(附圖5b)。 實施例5我們研究了 KB細胞對材料的特異性靶向作用。將HFKB和LFKB兩種細胞分別種在24孔板細胞培養板中，培養24h之后分別加不同金濃度下的實例I材料{(Au0) 200 - G5.NHAc-DOTA (Gd III) ^-PEG11-FA5I DENPs (金的濃度分別為10、40 μ M)，同時對照組加入相同體積的PBS溶液(每組三個平行樣)。然后再培養3h之后，胰酶消化離心后收集細胞，并通過相差顯微鏡數出每組細胞的個數，最后將細胞用王水處理后，加入適量的PBS溶液至
1.8mL。通過電感耦合等離子體發射光譜儀(ICP)測出每個樣品中金元素的濃度，最后計算出每個HFKB和LFKB細胞對金的攝取量(見附圖8)。通過附圖8可以清楚的看到在金的濃度為10、40μΜ吋，HFKB細胞對金的攝取量要高于LFKB細胞對金的攝取量，表明實例I材料{(Au0) 200-G5. NHAc-DOTA (Gd III) ^PEG1 rFA5} DENPs 對葉酸受體過表達的 KB 細胞具有特異性靶向作用。實施例6我們研究了 KB細胞特異性靶向吞噬材料后的MR成像性。將高葉酸受體表達KB細胞(HFKB)和低葉酸受體表達KB細胞(LFKB)兩種細胞分別種在25cm2塑料細胞培養瓶中，每瓶種的細胞數為400X 104個，培養24h之后分別加不同金濃度下的實例I材料{(Au0) 200 - G5. NHAc-DOTA(GdIII) 1Q-PEGn-FA5} DENPs (金的濃度分別為 10、20、40、80 μ M)。然后再培養3h之后，胰酶消化離心后收集細胞，并將細胞均勻的分散在I. 5mL PBS緩沖液中。進行MR掃描測試(附圖9a，b)，可以觀察到在一系列濃度下，與材料共培養后的HFKB的MR成像比LFKB細胞的MR成像要亮，通過測量MR信號值也可以發現，與材料共培養后的HFKB細胞的MR信號值要高于LFKB細胞的MR信號值。這些結果不僅說明了材料{(Au°) 2(|(| - G5.NHAc-DOTA (Gd III) 10-PEGn-FA5} DENPs對HFKB具有特異性的靶向作用，而且可以用于KB細胞的MR成像。實施例7我們研究了 KB細胞特異性靶向作用材料后CT成像性。將HFKB和LFKB兩種細胞分別種在25cm2塑料細胞培養瓶中，每瓶種的細胞數為400X IO4個，培養24h之后分別加不同金濃度下的實例 I 材料{(Au0) 200 - G5. NHAc-DOTA (Gd III) 10-PEGn-FA5} DENPs (金的濃度分別為10、20、40、8(^10。然后在培養311之后，胰酶消化離心后收集細胞，并將細胞均勻的分散在I. 5mL PBS緩沖液中。進行CT掃描測試(附圖9c，d)，可以觀察到在一系列濃度下，與材料共培養后的HFKB CT成像和LFKB細胞的CT成像亮度雖然比較接近，但是通過測量CT信號值可以發現，與材料共培養后的HFKB細胞的CT值要高于LFKB細胞的CT值。這些結果不僅說明了材料{(Au0) 200-G5. NHAc-DOTA (Gd III) ^-PEG11-FAJ DENPs 對 HFKB 具有特異性的靶向作用，而且可以用于KB細胞的CT成像。對比例I(I)用20mL的ニ甲亞砜溶液稀釋29mg的葉酸，使用125. 67mg的EDC活化3h，然后邊攪拌邊逐滴滴加溶于ImL ニ甲亞砜的干重為65. 73mg的聚こニ醇(NH2-PEG-C00H)，反應7(T80h后，將反應產物用透析膜在緩沖液中透析24h，然后在用蒸餾水透析48h，最后將純化的產物冷凍干燥得到葉酸修飾的聚こニ醇固體產物(FA-PEG-C00H)；(2)用15mL的ニ甲亞砜溶液溶解干重為20mg的樹狀大分子，然后邊攪拌邊滴加溶于5mL ニ甲亞砜溶液的干重為5. 89mg的D0TA-NHS，反應24h，然后取(I)中所得的FA-PEG-C00H 14. 99mg,溶解在5mL ニ甲亞砜溶液并使用EDC活化過后逐滴加入樹狀大分子溶液，反應72h后再將干重為23. 20mg的使用EDC活化的一端是羧基的聚こニ醇(PEG-COOH),反應72h后反應產物用透析膜在緩沖液中透析24h，然后在用蒸餾水透析48h，最后將純化的產物冷凍干燥；(3)取步驟(2)所得固體，用水將其溶解后，再加入2. 12mL氯金酸溶液(24.8mg/mL)，然后在室溫下攪拌30min，隨后加入NaBH4溶液(29. 25mg)，在室溫下攪拌反應2h后逐滴加入59. 27 μ L三こ胺，攪拌混合30min后，再向反應液中加入48. 27 μ Lこ酸酐，在室溫下攪拌反應24h，隨后將反應產物用透析膜在緩沖溶液和蒸餾水中透析，最后將純化后的產物冷凍干燥得到對比產物({(Au0) 200 - G5. NHAc-DOTA1(l-PEGn-FA5} DENPs )。電感耦合等離子體發射光譜儀(ICP)測定產物中Au和Gd的含量，結果表明平均每個樹狀大分子的載金量為193個金原子，載釓量為O個Gd(III)離子，這些測試結果表明已成功制備了設計合成的不含釓的成像造影剤對比產物{(Au°)2(ici-G5.Nhac-DOTaio-PEG1 rFA5} DENPs。對比例2(I)用20mL的ニ甲亞砜溶液稀釋39mg的葉酸，使用169mg的EDC活化3h，然后邊攪拌邊逐滴滴加溶于ImL ニ甲亞砜的干重為88. 40mg的聚こニ醇(NH2-PEG_C00H)，反應7(T80h后，將反應產物用透析膜在緩沖液中透析24h，然后在用蒸餾水透析48h，最后將純化的產物冷凍干燥得到葉酸修飾的聚こニ醇固體產物(FA-PEG-C00H)；(2)用15mL的ニ甲亞砜溶液溶解干重為30mg的樹狀大分子，然后邊攪拌邊滴加溶于5mL ニ甲亞砜溶液的干重為8. 83mg的DOTA-NHS，反應24h，然后取(I)中所得的FA-PEG-C00H 22. 49mg,溶解在5mL ニ甲亞砜溶液并使用EDC活化過后逐滴加入樹狀大分子溶液，反應72h后再將干重為34. 80mg的使用EDC活化的一端是羧基的聚こニ醇(PEG-COOH),反應72h后反應產物用透析膜在緩沖液中透析24h，然后在用蒸餾水透析48h，最后將純化的產物冷凍干燥得固體；(3)取步驟(2)所得固體，用ニ甲亞砜或水將其溶解后滴加入18. 22mg Gd(NO3)3溶液反應24h ;然后再加入88. 9μ L三こ胺，攪拌混合30min后，向反應液中加入72. 4 μ Lこ酸酐，在室溫下攪拌反應24h，隨后將反應產物用透析膜在緩沖溶液和蒸餾水中透析，最后 將純化后的產物冷凍干燥得到對比產物G5. NHAc-DOTA (Gd III) 10-PEGn-FA5O電感耦合等離子體發射光譜儀(ICP)測定產物中Au和Gd的含量，結果表明平均每個樹狀大分子的載釓量為13個Gd(III)離子，O個金原子，這些測試結果表明已成功制備了設計合成的不含金的成像造影剤對照產物G5. NHAc-DOTA (Gd III) 1 0-PEGn-FA5O
權利要求
1.一種具有葉酸靶向功能的CT/MR雙模態成像納米造影劑的制備方法，包括 (1)在葉酸的二甲亞砜溶液中加入EDC活化2-5h，然后邊攪拌邊滴加NH2-PEg-COOH的二甲亞砜溶液，反應7(T80h后，將反應產物透析，最后冷凍干燥得到葉酸修飾的聚乙二醇固體產物fa-peg-cooh ； (2)在樹狀大分子的二甲亞砜溶液中攪拌邊滴加DOTA-NHS的二甲亞砜溶液，反應20-30h,得到樹狀大分子溶液；然后將步驟(I)得到的FA-PEG-C00H溶解于二甲亞砜中，并使用EDC活化后，逐滴加入到上述樹狀大分子溶液中，反應40-90h后，再加入用EDC活化后的PEG-C00H，反應40-90h后透析，最后冷凍干燥得固體； (3)將步驟(2)所得固體用二甲亞砜或水溶解后，加入氯金酸溶液，然后在室溫下攪拌20-50min,隨后加入NaBH4溶液，再在室溫下攪拌反應l_5h后，逐滴加入Gd (NO3) 3溶液反應20-30h;然后加入三乙胺，攪拌混合20-50min后，再向反應液中加入乙酸酐，在室溫下攪拌反應20-30h，將反應產物透析，最后冷凍干燥即可。
2.根據權利要求I所述的一種具有葉酸靶向功能的CT/MR雙模態成像納米造影劑的制備方法，其特征在于步驟(I)中所述的葉酸的二甲亞砜溶液中二甲亞砜與葉酸的用量比為20mL :29 39mg ;所述的NH2-PEG-C00H的二甲亞砜溶液中NH2-PEG-C00H的干重與二甲亞砜的用量比為65. 73 88. 40mg lmL ；EDC的用量為126 169mg。
3.根據權利要求I所述的一種具有葉酸靶向功能的CT/MR雙模態成像納米造影劑的制備方法，其特征在于步驟(I)中所述的NH2-PEg-COOH為一端是羧基另一端是氨基的聚乙二醇，其分子量為2000。
4.根據權利要求I或2所述的一種具有葉酸靶向功能的CT/MR雙模態成像納米造影劑的制備方法，其特征在于步驟(I)中所述的葉酸與NH2-PEg-COOH的摩爾比為3:1。
5.根據權利要求I所述的一種具有葉酸靶向功能的CT/MR雙模態成像納米造影劑的制備方法，其特征在于步驟(2)中所述的樹狀大分子的二甲亞砜溶液中樹狀大分子與二甲亞砜的用量比為2(T30mg 15mL ;所述的DOTA-NHS的二甲亞砜溶液中DOTA-NHS的干重與二甲亞砜的用量比為5. 89 8. 83mg 5mL ;所述的步驟(I)得到的FA-PEG-C00H的用量為14.99 22. 49mg, PEG-COOH 的干重為 23. 19 34. 80mg。
6.根據權利要求I或5所述的一種具有葉酸靶向功能的CT/MR雙模態成像納米造影劑的制備方法，其特征在于步驟(2)中所述的FA-PEG-COOH、DOTA-NHS、PEG-COOH與樹狀大分子的摩爾比為5:10:6:1。
7.根據權利要求I所述的一種具有葉酸靶向功能的CT/MR雙模態成像納米造影劑的制備方法，其特征在于步驟(2)中所述的樹狀大分子為第5代聚酰胺-胺型樹狀大分子。
8.根據權利要求I所述的一種具有葉酸靶向功能的CT/MR雙模態成像納米造影劑的制備方法，其特征在于步驟(3)所述的氯金酸溶液的濃度為24. 8mg/mL，其用量與樹狀大分子的用量比為2. 12^3. 18mL 20^30mg ;所述的NaBH4溶液中的溶劑為體積比2:1的H2O與CH3OH的混合液，NaBH4的用量與樹狀大分子的用量比為29. 25 43. 88mg 20^30mg ;所述的三乙胺、乙酸酐和樹狀大分子的用量比為59. 27 88. 9u L :48. 27 72. 4u L :2(T30mg。
9.根據權利要求I所述的一種具有葉酸靶向功能的CT/MR雙模態成像納米造影劑的制備方法，其特征在于步驟(3)中所述的NaBH4與氯金酸的摩爾量之比為5:1 ;氯金酸與樹狀大分子的摩爾比為200:1 ;Gd (NO3) 3與樹狀大分子的摩爾比為35:1 ;所述的三乙胺、乙酸酐和樹狀大分子的摩爾比為660:50:1。
10.根據權利要求I所述的一種具有葉酸靶向功能的CT/MR雙模態成像納米造影劑的制備方法，其特征在于步驟(I)、(2)和(3)中所述的透析均為用透析膜先在PBS緩沖液中透析20-30h，然后再在蒸餾水透析40-60h ;其中所述的透析膜為纖維素透析膜MWC0=1000。
全文摘要
本發明涉及一種具有葉酸靶向功能的CT/MR雙模態成像納米造影劑的制備方法，包括(1)制備FA-PEG-COOH；(2)用DOTA-NHS、COOH-PEG-FA、mPEG-COOH修飾樹狀大分子，得到DOTA和葉酸修飾的聚乙二醇化樹狀大分子；(3)在步驟(2)得到的樹狀大分子溶液中加入氯金酸溶液、NaBH4溶液、Gd(NO3)3·6H2O；再加入三乙胺、乙酸酐，反應結束后透析、冷凍干燥即可。本發明的制備方法簡單，反應條件溫和，易于操作，具有產業化實施的前景；本發明的CT/MR雙模態成像納米造影劑具有較好的水溶性、穩定性、對葉酸受體高表達癌細胞具有特異性的靶向作用，有望應用于腫瘤的早期檢測。
文檔編號A61K49/12GK102671217SQ20121018321
公開日2012年9月19日 申請日期2012年6月5日 優先權日2012年6月5日
發明者史向陽, 張貴祥, 李康安, 溫詩輝, 陳潛 申請人:上海市第一人民醫院, 東華大學