一種靶向CD47的免疫檢查點抑制劑藥物組合物及其制備方法與流程

本發明屬生物技術領域，涉及一種新型靶向cd47的免疫檢查點抑制劑藥物組合物及其制備方法和用途，尤其是一種靶向cd47的免疫檢查點抑制劑與一種或多種細胞自噬抑制劑組合形成的新型復方藥物或藥物組合物及其制備方法和用途。

背景技術：

現有技術公開了cd47(又稱為整合素相關蛋白，integrinassociatedproteiniap)，是一種在腫瘤細胞表面高表達的細胞跨膜蛋白，其包括五個跨膜結構域和一個ig樣結構域；在機體免疫細胞中，cd47的配體主要為信號調節蛋白α(sirpα，又稱myd-1)；cd47通過與其配體的結合調節細胞的遷移，吞噬活性及免疫穩態；在機體免疫系統中，cd47扮演一類“別吃我”信號，能通過ig樣結構域與sirpα的nh2末端結構域結合可產生抑制巨噬細胞吞噬的信號，進而對機體固有免疫系統產生抑制作用。目前對靶向cd47的藥物研究較多的是阻斷cd47與其配體的結合，從而去除掉cd47與其配體的結合對固有免疫系統產生的抑制作用。已有的藥物有抗cd47單克隆抗體、sirpα蛋白、sirpα/myd-1/cd172-fc融合蛋白等。

cd47作為一個“別吃我”信號，使得腫瘤細胞能夠逃避機體免疫系統對其的吞噬。靶向cd47的sirpα-fc融合蛋白能夠長時間阻斷cd47與其配體的結合，有關對不同人白血病細胞裸鼠移植瘤模型的研究發現，靶向cd47的單抗通過阻斷cd47-sirpα的結合，激活機體對移植的白血病細胞的清除(chaomp,alizadehaa,tangc,myklebustjh,vargheseb,etal.cell2010142:699-713)。weissman組用血液來源的和非血液來源的癌細胞的研究顯示，在腫瘤干細胞中cd47的表達更高一些，并進一步指出cd47的高表達是腫瘤患者一個不良預后因素。由于cd47在腫瘤細胞表面的過表達，抑制了巨噬細胞對腫瘤細胞的清除，從而提高了腫瘤細胞在體內的存活率。van組在同源的sirpα突 變型鼠移植瘤模型研究發現sirpα信號本身并不影響腫瘤的轉移和生長，但cd47-sirpα結合后卻嚴重削弱了單抗的治療藥效(zhaoxw,vanbeekem,schornagelk,vandermaadenh,vanhoudtm,etal.proc.natl.acad.sci.usa2011108:18342–47)；這些結果為靶向cd47-sirpα治療惡性腫瘤或者增強單抗的藥效提供了理論基礎。

有研究發現cd47能夠提高向腫瘤微環境中遞藥的效率，特別是，rodriguez組把重組cd47蛋白結合到納米粒上，在體內提高了納米粒在循環中的半衰期和細胞毒性藥物向腫瘤中的遞藥效率；結合納米粒的cd47通過fcγr抑制機體對納米粒的清除，這與前文中提到的cd47-sirpα結合削弱了抗體介導的腫瘤治療作用一致(rodriguezpl,haradat,christianda,pantanoda,tsairk,discherde.science2013339:971–75)；另有研究用紅血細胞膜包裹納米粒后，發現這種可以抑制機體對納米粒的吞噬作用，并且這一抑制作用是cd47依賴的(huc-mj,fangrh,lukbt,chenkn,carpenterc,etal.nanoscale20135:2664–68)；這些結果表明靶向cd47可能成為提高遞藥效率的有效手段。

細胞自噬(autophagy)又稱ⅱ型程序性死亡(typeⅱprogrammedcelldeath)，是真核生物體內進化保守的負責細胞內物質周轉的重要過程，能分解細胞內受損或多余的細胞器和衰老的蛋白產生核苷酸，氨基酸等小分子物質供細胞合成新的蛋白質，并能維持細胞內微環境的穩定。研究發現細胞自噬與多種疾病，尤其是腫瘤的發生和發展關系密切。根據細胞內底物運送到溶酶體腔內方式的不同，哺乳動物細胞自噬可分為三種方式：大自噬(macroautophagy)、小自噬(microautophagy)和分子伴侶介導的自噬(chaperone-mediatedautophagy,cma)。其中，大自噬主要具有以下特征：(1)發展過程迅速；(2)自噬的可誘導性；(3)批量降解；(4)無選擇性吞噬；(5)自噬的保守性；其他兩種自噬與大自噬的主要區別在于：小自噬是溶酶體膜自身變形，然后包裹吞噬細胞漿中的底物；而分子伴侶介導的自噬則能有選擇性地降解蛋白。

研究公開了自噬能對細胞對外部環境改變及各種刺激產生應激反應，細胞在生長條件下能發生較低水平的自噬，也稱基礎自噬，然而，一旦受到外界的刺激，如饑餓、缺氧、高溫、高細胞密度或是生長因子剝奪等，細胞自噬的水平將會迅速上調，如在營養物質缺乏的情況下，細胞自噬能分解體內壞死細胞器產生氨基 酸等供細胞合成新的蛋白質，維持細胞的存活[①piacentinim,d'elettom,falascal,etal.2011；78:197-246；②cookkl,shajahanan,clarker.2011；11(8):1283-94.；③wirawane,vandenberghet,lippenss,etal.2012；22(1):43-61.]。然而，作為程序性細胞死亡的一種，細胞自噬能通過多種途徑直接或是間接導致細胞死亡，這種殺傷可能是通過誘導細胞凋亡、壞死、衰老等機制發生，也可能是使細胞直接發生自噬性死亡[dentond,nicolsons,kumars.celldeathdiffer.2012；19(1):87-95.]。

目前的靶向cd47的融合蛋白制劑均為傳統型制劑工藝所制備，存在脫靶情況，且治療效果有待提高。迄今，尚未見有細胞自噬抑制劑與靶向cd47的融合蛋白組成新型制劑的報道。

技術實現要素：

本發明的目的是克服現有技術的缺陷，提供一種靶向cd47的免疫檢查點抑制劑藥物組合物及其制備方法和用途。本發明解決的關鍵技術問題是制備一種靶向cd47，且能顯著殺傷腫瘤細胞的免疫檢查點抑制劑藥物組合物，同時保證原靶向cd47免疫檢查點抑制劑的穩定性和靶向性。

本發明解決本技術問題的方案是，將由靶向cd47的免疫檢查點抑制劑與細胞自噬抑制劑組成組合藥物或者藥物復方制劑。

本發明中，細胞自噬抑制劑包括但不限于氯喹(cq)，3-ma，沃曼青霉素，巴伐洛霉素a-1，氯化銨和ly294002；本發明的實施例中優選氯喹；

本發明中，靶向cd47的免疫檢查點抑制劑藥物包括但不限于：抗cd47單克隆抗體、sirpα蛋白、sirpα/myd-1/cd172-fc融合蛋白等；本發明的實施例中優選sirpα-fc(myd-1-fc)融合蛋白，尤其是重組人sirpα/cd172-fc(myd-1/cd172-fc)融合蛋白；

本發明中，所述的細胞自噬抑制劑能增強靶向cd47的藥物對于腫瘤細胞的殺傷效果，從而增強該類藥物的抗腫瘤療效；所述的細胞自噬抑制劑與靶向cd47的藥物組合為復方制劑，能增強藥物的靶向效果、以及對于cd47位點的封閉效果及抗腫瘤效果。

本發明中，細胞自噬抑制劑可與靶向cd47的藥物制成藥物組合物，采用序貫使用的方式增強靶向cd47藥物的抗腫瘤療效。

本發明的由靶向cd47的免疫檢查點抑制劑與細胞自噬抑制劑組成的組合物或者復方制劑可用于治療的腫瘤包括但不限于：非小細胞肺癌、小細胞肺癌、淋巴瘤、慢性髓系粒細胞白血病、急性髓系粒細胞白血病、急性淋巴系粒細胞白血病、乳腺癌、黑色素瘤；本發明進一步進行靶向cd47的融合蛋白對非小細胞肺癌細胞自噬水平的影響試驗，靶向cd47的融合蛋白制劑與靶向cd47的融合蛋白的體外促吞噬作用比較試驗以及靶向cd47的融合蛋白制劑與靶向cd47的融合蛋白的體內治療效果比較實驗和靶向cd47的融合蛋白制劑與普通靶向cd47的蛋白的體內治療效果比較實驗；結果證實，所述融合蛋白能夠明顯引起肺癌細胞產生細胞自噬(如圖1a，b所示)和自噬流(如圖1c所示)；所述融合蛋白制劑有較強的促巨噬細胞吞噬作用，與單獨使用融合蛋白(myd-1-fc)比較，促吞噬效果顯著提高，證明了新型靶向cd47的融合蛋白在體內的抗腫瘤作用，且與細胞自噬抑制劑制成新型制劑能夠顯著提高抗腫瘤效果；所述融合蛋白制劑有較強的抗腫瘤作用，與普通靶向cd47的融合蛋白比較，促抗腫瘤效果顯著提高(如圖4a，b所示)。

本發明的由靶向cd47的免疫檢查點抑制劑與細胞自噬抑制劑組成的組合物或者復方制劑可用上述各類腫瘤的診斷和檢測。

本發明提供了制備由靶向cd47的免疫檢查點抑制劑與細胞自噬抑制劑組成的組合物或者復方制劑的方法，其中包括1)自噬抑制劑藥物的配置；2)靶向cd47藥物母液的制備；3)靶向cd47的免疫檢查點抑制劑藥物組合物的制備。該制劑的制備工藝簡單、適應性廣，可用于大規模生產。

附圖說明

圖1顯示了靶向cd47的融合蛋白引起非小細胞肺癌細胞產生細胞自噬，

其中，a：激光共聚焦熒光顯微鏡觀察自噬體的產生，b：電子顯微鏡觀察自噬體的產生和分布，c：激光共聚焦熒光顯微鏡檢測自噬流的整個過程。

圖2是靶向cd47的融合蛋白制劑促進巨噬細胞對非小細胞肺癌細胞的吞噬。

圖3是靶向cd47的融合蛋白及其制劑對裸鼠移植瘤的生長的抑制，

其中，a：靶向cd47的融合蛋白及其制劑對腫瘤體積生長的影響，b：靶向cd47的融合蛋白及其制劑對腫瘤重量的影響。

圖4靶向cd47的融合蛋白制劑和普通靶向cd47的蛋白對裸鼠移植瘤的生長的抑制，

其中，a：靶向cd47的融合蛋白制劑和普通靶向cd47的蛋白對腫瘤體積生長的影響，b：靶向cd47的融合蛋白制劑和普通靶向cd47的蛋白對腫瘤重量的影響。

具體實施方式

實施例1

1)自噬抑制劑藥物的配置

(1)氯喹溶液的配制：取適量氯喹溶于0.01mpbs(ph＝7.4)配成10mmol/l的儲存液，用0.1μm的濾器過濾除菌后保存于4℃，體外實驗室稀釋500-1000倍用于抑制細胞自噬；

(2)氯化銨溶液的配制：取適量氯化銨溶于0.01mpbs(ph＝7.4)配成0.4mol/l的儲存液，用0.1μm的濾器過濾除菌后保存于4℃，體外實驗時稀釋50-80倍用于抑制細胞自噬；

(3)3-ma溶液的配制：取適量3-ma溶于0.01mpbs(ph＝7.4)配制成200mm的儲存液，用0.1μm的濾器過濾除菌后保存于-20℃，體外實驗時稀釋至2mm用于抑制細胞自噬；(4)ly294002溶液的配制：取適量ly294002溶于0.01mpbs(ph＝7.4)配制成20mm的儲存液，用0.1μm的濾器過濾除菌后保存于-20℃，體外實驗時稀釋至20μm用于抑制細胞自噬；

2)靶向cd47藥物母液的制備

靶向cd47的藥物可由r&d公司獲得，稱取10mg靶向cd47蛋白或融合蛋白的凍干粉，溶于1ml0.02mph＝7.4的pbs溶液中，充分攪拌并用0.1μm無菌濾器過濾，濃度為10mg/ml，4℃保存，體外試驗時稀釋至10μg/ml；

3)新型靶向cd47的免疫檢查點抑制劑藥物組合物的制備

將靶向cd47的免疫檢查點抑制劑與細胞自噬抑制劑制備成將靶向cd47的新型藥物組合物：將靶向cd47的藥物母液與氯喹溶液按1:1混合，使得靶向cd47 融合蛋白濃度1mg/ml，氯喹的濃度為1mmol/l。體外實驗時稀釋100倍：

4)靶向cd47的融合蛋白對非小細胞肺癌細胞自噬水平的影響

將上述靶向cd47的融合蛋白(myd-1-fc)按體積1:100加入到培養基中，采用激光共聚焦熒光顯微鏡、電子顯微鏡和蛋白質印記等分別觀察和檢測融合蛋白對非小細胞肺癌細胞自噬水平的影響，實驗結果表明，該融合蛋白能夠明顯引起肺癌細胞產生細胞自噬(圖1a，b)和自噬流(圖1c)。

5)靶向cd47的融合蛋白制劑與靶向cd47的融合蛋白的體外促吞噬作用比較利用cfse標記非小細胞肺癌細胞，并將巨噬細胞和非小細胞肺癌細胞共培養，把上述靶向cd47的融合蛋白制劑(myd-1-fc+cq)按體積1:100加入到培養基中，觀察融合蛋白制劑對巨噬細胞吞噬非小細胞肺癌細胞的影響。激光共聚焦熒光顯微鏡觀察結果如圖2所示，實驗結果表明，該融合蛋白制劑有較強的促巨噬細胞吞噬作用，與單獨使用該融合蛋白(myd-1-fc)比較，促吞噬效果顯著提高。

6)靶向cd47的融合蛋白制劑與靶向cd47的融合蛋白的體內治療效果比較將上述靶向cd47的融合蛋白制劑(myd-1-fc+cq)和靶向cd47的融合蛋白(myd-1-fc)以100μl每只小鼠的劑量由腹腔注射入小鼠體內，每周2次，連續治療4周后，腫瘤生長體積折線圖如圖2所示，實驗結果表明，該融合蛋白制劑有較強的抗腫瘤作用(圖3a，b)，與單獨使用該融合蛋白比較，促抗腫瘤效果顯著提高(圖3a，b)。證明了新型靶向cd47的融合蛋白在體內的抗腫瘤作用，且與細胞自噬抑制劑制成新型制劑能夠顯著提高抗腫瘤效果。

7)靶向cd47的融合蛋白制劑與普通靶向cd47的蛋白的體內治療效果比較將上述靶向cd47的融合蛋白制劑(myd-1-fc+cq)與普通靶向cd47的蛋白(b6h12)以100μl每只小鼠的劑量由腹腔注射入小鼠體內，每周2次，連續治療4周后，腫瘤生長體積折線圖如圖2所示，實驗結果表明，該融合蛋白制劑有較強的抗腫瘤作用(圖4a)，與普通靶向cd47的融合蛋白比較，促抗腫瘤效果顯著提高(圖4a，b)。