專利名稱：一種海豚鏈球菌減毒疫苗的制備和應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及疫苗學領域，具體的說是一種海豚鏈球菌減毒疫苗及其應用。
背景技術：
海豚鏈球菌(Streptococcus iniae)是一種革蘭氏陽性細菌,能感染多種魚類,包括牙鲆、大菱鲆、鯰魚、虹鱒等，給產業造成嚴重的經濟損失。另外，海豚鏈球菌也是一種人類病原，在人類種可誘發腦膜炎等疾病。目前對海豚鏈球菌病的防治在我國主要以抗生素和化學藥物為主，沒有有效的疫苗。
減毒疫苗是一種近年來發展起來的疫苗形式，其構建原理是將病原菌株通過諸如基因敲除等方法進行改造，使得改造后的突變株的侵染能力大大下降。當這種減毒的細菌作為疫苗使用時，它即可通過自身殘留的毒力侵染至宿主體內，引起宿主免疫應答，從而使宿主獲得免疫保護性。因此減毒疫苗通常可通過浸泡和口服的方式導入魚體，從而避免了昂貴的注射途徑。目前，海豚鏈球菌減毒疫苗尚未見報道。
發明內容
本發明目的在于提供一種海豚鏈球菌減毒疫苗及其應用。為實現上述目的，本發明采用的技術方案為一種海豚鏈球菌減毒疫苗，減毒疫苗菌株為海豚鏈球菌G26在含逐漸升高濃度的利福平的培養基中培養，直至培養到培養基中利福平濃度為200ug/ml，所得轉化菌株為減毒疫苗菌株G26RM。將海豚鏈球菌G26在含有lug/ml利福平的LB培養基中培養4 一 5天，挑取一個轉化子，將轉化子在含有2ug/ml利福平的LB培養基中培養4 一 5天選取轉化子；如此重復，直至LB培養基中利福平濃度達200ug/ml，由此獲得的轉化子即為減毒疫苗菌株G26RM。所述減毒疫苗菌株G26RM與海藻酸鈉微球混合，作為海豚鏈球菌免疫藥物。所述減毒疫苗菌株G26RM與海藻酸鈉微球混合靜置(兩種按體積比混合I: I. 67)，將受免魚喂食含有G26RM疫苗的海藻酸鈉微球飼料，持續3天，隨后在含有G26RM疫苗的浸泡液中浸泡6小時。本發明具有如下優點I. 口服和浸泡方式導入。本發明的疫苗可經由口服和浸泡方式導入魚體，因此在應用上操作簡單，成本低廉，不受魚類個體大小限制，可以大面積引用，故具有良好的產業應用前景。
具體實施例方式下面結合實施例對本發明作進一步說明。實施例旨在對本發明進行舉例描述，而非以任何形式對本發明進行限制。在本發明實施例中所涉及到的常規性實驗方法均采用如下方法
實施例I海豚鏈球菌減毒疫苗的構建方法將海豚鏈球菌G26在含有lug/ml利福平的LB培養基中培養4 一 5天，挑取一個轉化子，將轉化子在含有2ug/ml利福平的LB培養基中培養4 一 5天，挑取一個轉化子，將其在含有4ug/ml利福平的LB培養基中培養4 一 5天，挑取一個轉化子。如此逐漸升高利福平濃度，直至利福平濃度達200ug/ml (在含逐漸升高濃度的利福平的培養基中培養梯度為，lug/ml、2ug/ml、4ug/ml、IOug/ml、50ug/ml、IOOug/ml 和 200ug/ml),在此培養基中挑取一個轉化子，命名為G26RM。所述LB組成成分按重量百分比計1.0%蛋白胨，O. 5%酵母粉，1.0%氯化鈉，97. 5%蒸餾水。
所述海豚鏈球菌G26保存于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心CGMCC，地址北京市海淀區中關村北一條13號，保藏日期2007年3月22日，保藏編號為CGMCC No. 1984,分類命名為海豚鏈球菌(Streptococcus iniae)。實施例2G26RM毒力檢測用半致死量(LD5tl)測定方法(具體方法參見文獻Wang H，HuY，Zhang Wj Sun L.Construction of an attenuated Pseudomonas fluorescensstrain and evaluation of its potential as a cross-protective vaccine. Vaccine2009; 27:4047 一 55 )檢測 G26RM 與野生株 G26 的毒力，發現 G26 的 LD5tl 為 106_ 9CFU,而 G26RM的LD5tl大于109CFU。因此，較之于G26，G26RM的毒力大幅下降，是一株減毒株。實施例3海豚鏈球菌減毒疫苗的應用步驟I)疫苗海藻酸鈉微球飼料和對照海藻酸鈉微球飼料的制備。在LB培養基中于28°C培養G26RM至OD6tltl為0. 8 — 1，然后離心(5000g，4°C )10min。收集菌體，將其懸浮于普通海水中至終濃度為lxl09cfu/ml，即為G26RM懸浮液。將50ml海藻酸鈉(質量百分比3% )與30ml G26RM懸浮液或PBS (對照)混合，隨后加入2000ml石蠟、10ml S-80乳化劑(皆購于美國Sigma公司)以及50ml氯化鈣(0. 15M)(購于上海Sangon公司);將含有15947和PBS對照的混合液分別離心(IOOOg, IOmin),收集沉淀；將含有G26RM懸浮液和PBS的沉淀分別與IOOOg魚飼料(購于山東升索漁用飼料研究中心)混合，用F(II)-26雙螺桿擠條制粒機(華南理工大學，廣州)加工制成顆粒飼料(I. 5mmX 2. 0mm)，即為疫苗海藻酸鈉微球飼料和對照海藻酸鈉微球飼料。所述PBS組成成分按重量百分比計0. 8 % NaCl, 0. 02 % KCl, 0. 358 %Na2HPO4. 12H20, 0. 024% NaH2PO4。步驟2)疫苗浸泡液的制備。在LB培養基中于28°C培養G26RM至OD6tltl為0. 8 —
I,然后離心(5000g，4°C)10min。收集菌體，將其懸浮于海水中至終濃度為lxl08cfu/ml，即為疫苗浸泡液。步驟3)疫苗的免疫傳遞。將48條牙鲆(每條重約12. 6g)隨機分為2 (每組24條)，分別命名為A和B。將A (樣品組)和B (對照組)組魚分別喂食上述步驟I)的疫苗海藻酸鈉微球飼料和對照海藻酸鈉微球飼料，持續3天。隨后，將A和B組魚分別在上述步驟
2)的疫苗浸泡液和普通海水中浸泡6小時。
步驟4)疫苗的免疫保護效應檢測。在LB培養基中培養海豚鏈球菌G26至0D_為
0.8，然后離心(5000g，4°C，10min)。收集菌體，將G26懸浮于PBS中至終濃度為5xl08cfu/ml,即為海豚鏈球菌懸液。在上述步驟3)浸泡免疫后的第30天，將A和B組魚腹腔注射IOOu I海豚鏈球菌懸液，隨后將4組魚置入正常海水中養殖。在以后的20天中，每天觀察并記錄各組魚的死亡情況。20天后，統計各組魚的總死亡數目A組，5條；B組，17條。利用下列公式計算相對免疫保護效率(RPS)RPS=IOOxd 一免疫組魚的總死亡百分比/對照組魚的總死亡百分比)據此算出減毒疫苗G26RM針對海豚鏈球菌的免疫保護效率為71%。 故本發明的海豚鏈球菌減毒疫苗能夠通過口服和浸泡而有效地保護牙鲆抵御海豚鏈球菌感染。
權利要求
1.一種海豚鏈球菌減毒疫苗，其特征在于減毒疫苗菌株為海豚鏈球菌G26在含逐漸升高濃度的利福平的培養基中培養，直至培養到培養基中利福平濃度為200ug/ml，所得轉化菌株為減毒疫苗菌株G26RM。
2.按權利要求I所述的海豚鏈球菌減毒疫苗的制備方法，其特征在于將海豚鏈球菌G26在含有lug/ml利福平的LB培養基中培養4 一 5天，挑取一個轉化子，將轉化子在含有2ug/ml利福平的LB培養基中培養4 一 5天選取轉化子；如此重復，直至LB培養基中利福平濃度達200ug/ml，由此獲得的轉化子即為減毒疫苗菌株G26RM。
3.按權利要求I所述的海豚鏈球菌減毒疫苗，其特征在于所述減毒疫苗菌株G26RM與海藻酸鈉微球混合，作為海豚鏈球菌免疫藥物。
4.按權利要求3所述的海豚鏈球菌減毒疫苗，其特征在于所述減毒疫苗菌株G26RM與海藻酸鈉微球混合靜置，將受免魚喂食含有G26RM疫苗的海藻酸鈉微球飼料，持續3天，隨后在含有G26RM疫苗的浸泡液中浸泡6小時。
全文摘要
本發明涉及疫苗學領域，具體的說是一種海豚鏈球菌減毒疫苗及其應用。減毒疫苗菌株為海豚鏈球菌G26在含逐漸升高濃度的利福平的培養基中培養，直至培養到培養基中利福平濃度為200ug/ml，所得轉化菌株為減毒疫苗菌株G26RM。本發明的疫苗可經由口服和浸泡方式導入魚體，因此在應用上操作簡單，成本低廉，不受魚類個體大小限制，可以大面積引用，故具有良好的產業應用前景。
文檔編號A61K39/09GK102824631SQ20121025599
公開日2012年12月19日 申請日期2012年7月23日 優先權日2012年7月23日
發明者孫黎, 于蘭萍, 胡永華 申請人:中國科學院海洋研究所