一種針對腦膠質瘤的靶向納米遞藥系統的制作方法
【專利摘要】本發明屬藥物制劑領域，具體涉及一種針對腦膠質瘤的靶向納米遞藥系統及其制備方法和應用。本遞藥系統包括靶向功能分子，藥物和納米載體，所述的靶向功能分子為來源于白介素13的短肽，藥物為小分子抗腦膠質瘤藥物，納米載體為表面聚乙二醇修飾的脂質體、納米粒、聚合物泡囊、聚合物膠束、固體脂質納米粒，所述藥物以包裹或共價連接的方式包載在納米載體內所述短肽通過共價連接的方式與納米粒表面的聚乙二醇相連。該遞藥系統可通過腦膠質瘤細胞表面白介素13受體α2的介導作用，促進腦膠質瘤細胞的攝取，提高化療藥物的抗腦膠質瘤效果。
【專利說明】一種針對腦膠質瘤的靶向納米遞藥系統
【技術領域】
[0001]本發明屬藥物制劑領域，涉及腫瘤靶向遞藥研究，具體涉及一種針對腦膠質瘤的靶向納米遞藥系統及其制備方法和應用。
【背景技術】
[0002]惡性腦膠質瘤已經成為影響人類健康的腦部重大疾病之一，據統計報道，其具有很高的死亡率，成人惡性腦膠質瘤的5年生存率低于5%，但目前尚無有效治愈的辦法。對于惡性腦膠質瘤，傳統的治療方法為手術切除腫瘤后再采用抗腫瘤藥物進行化療。然而，手術切除風險很大，而大部分傳統的抗腫瘤藥物不具有選擇性，在殺死腫瘤細胞的同時也會對正常的細胞造成殺傷作用，引起嚴重的副作用而使其應用受到限制。
[0003]目前，納米靶向遞藥系統是抗腫瘤藥物研發的熱點之一。大量的研究和發明致力于納米遞藥系統的抗腫瘤研究，以提高藥物的抗腫瘤效果，降低藥物的毒副作用。如專利“聚乙二醇衍生化磷脂包載的蒽環類抗腫瘤抗生素的納米膠束制劑”(專利申請號200510059621.8)，“聚乙二醇衍生化磷脂包載的長春花生物堿類抗腫瘤藥物的納米膠束制劑”(專利申請 號200510098381.2)，“抑制腫瘤多藥耐藥性的聚合物復合納米的制備方法”(專利申請號200610096365.4)，“一種腫瘤特異性靶向給藥系統及其在制備治療腫瘤藥物中的應用”(專利申請號02105456.8)。而且，已有部分納米靶向遞藥系統的制劑上市，如阿霉素脂質體，紫杉醇白蛋白納米粒。納米靶向遞藥系統治療腫瘤主要優勢體現在以下兩點:第一，納米遞藥系統通過腫瘤部位的增強透過和滯留(EPR)效應提高了腫瘤部位的分布，降低了非靶部位的分布，提高了藥物的作用效果，降低藥物的毒副作用；第二，腫瘤細胞表面常特異性高表達某些正常細胞不表達或低表達的受體或蛋白，在納米遞藥系統表面連接一個靶向功能分子，通過靶向功能分子與腫瘤細胞表面的特異性受體的結合，可以顯著提高腫瘤細胞對于藥物的攝取，提高納米遞藥系統的抗腫瘤效果。
[0004]現有技術公開了白介素13受體I a 2 (L13Ra 2)是白介素13 (IL13)的受體之一，在多種腫瘤細胞表面具有特異性表達，與白介素13具有很高的親和力。研究發現，IL23Ra 2的表達具有顯著的膠質瘤組織特異性:僅表達在星形膠質細胞來源的膠質瘤，而正常的腦組織細胞不表達或痕量表達；而且IL13R a 2與星形細胞瘤的惡性度相關，并與星形細胞瘤的發生發展有密切相關。因此，IL13R a 2被認為是新的膠質瘤相關標記物，可用于膠質瘤的靶向診斷與治療。有研究已證實將IL13與毒性蛋白分子構建融合蛋白，通過IL13與腫瘤表面的IL13R a 2結合，將毒素分子靶向導入腫瘤細胞內，起到殺傷腫瘤細胞的作用。如將人IL13與假單胞菌外毒素(PE)構成融合蛋白IL13PE38QQR，IL13PE38QQR在極低的濃度就可以殺死膠質瘤細胞，且其毒性作用可被過量的IL13所阻斷，提示IL13Rci 2介導的細胞毒性作用是特異的。由于正常的腦組織細胞幾乎不表達IL13Ra 2，所以IL13PE38QQR對這些細胞未顯示明顯的毒性或沒有毒性。藥效學試驗也證實，IL13PE38QQR對荷惡性膠質瘤鼠具有較好的治療效果，未發現明顯的毒副作用。由于IL13PE38QQR已取得的較好的臨床前實驗結果，被用于復發的惡性膠質瘤患者的I / II臨床實驗研究。[0005]盡管構建融合蛋白實現膠質瘤的靶向治療是業內較認可的方法，但尚存在如下缺點:(I)融合蛋白可能會降低IL13與IL13Rci 2的親和性，同時還有可能降低毒素蛋白的活性；(2)融合蛋白的穩定表達與純化難度大，生產成本高；(3)IL13的受體較多，融合蛋白可能靶向非靶部位細胞，造成對正常組織細胞的毒副作用；(4)融合蛋白靜注體內半衰期短，藥物在腫瘤部位的分布較少。IL13肽(序列為VDKLLLHLKKLFREGQFNRNFESIIICRDR)是來源于IL13的短肽序列，與IL13Ra 2具有很高的親和性，而且與IL13的其它受體不結合。目前國內外未見IL13肽修飾納米遞藥系統治療腦膠質瘤的報道。
[0006]為獲得更好的膠質瘤靶向性，顯著提高腫瘤細胞對于藥物的攝取，提高藥物的抗腫瘤效果。本發明擬采用IL13肽修飾納米遞藥系統，通過特異性靶向膠質瘤細胞表面的IL13R a 2，促進腫瘤細胞的攝取，提高化療藥物的抗腫瘤效果。
【發明內容】
[0007]本發明的目的在于針對現有技術存在的不足，提供一種針對腦膠質瘤的納米遞藥系統，具體涉及IL13肽修飾的納米遞藥系統。該遞藥系統可通過腦膠質瘤細胞表面受體IL13R a 2的介導作用，促進腫瘤細胞的攝取，提高化療藥物的抗腫瘤效果。
[0008]具體而言，其特征在于，包括靶向功能分子，藥物和納米載體，所述的靶向功能分子為來源于白介素13的短肽(IL13)，所述的藥物為小分子抗腫瘤藥物，所述的納米載體為表面聚乙二醇修飾的脂質體、納米粒、聚合物泡囊、聚合物膠束或固體脂質納米粒；所述藥物以包裹或共價連接的方式包載在納米載體內，所述短肽通過共價連接的方式與納米粒表面的聚乙二醇相連。
[0009]本發明中，所述的來源于IL13的短肽氨基酸序列為VDKLLLHLKKLFREGQFNRNFESIIICRDR。
[0010]本發明中，納米載體表面聚乙二醇的分子量為1000-20000Da，優選2000_5000Da ；
上述聚乙二醇可以是單甲氧基聚乙`二醇，或是含其它活性基團的聚乙二醇；上述活性基團選自馬亞酰亞胺基、巰基、胺基、羧基、生物素或親和素中的一種。
[0011]本發明中，所述的祀向納米遞藥系統粒徑為10-300nm,優選50-150nm。
[0012]本發明中，小分子抗腫瘤藥物選自紫杉烷類、蒽醌類、喜樹堿類、長春堿類中的一種。
[0013]本發明的目的通過以下技術方案實現:
[0014]1、以聚乙二醇-聚已內酯(PEG-PCL)為材料，采用乳化溶酶蒸發法制備載多西紫杉醇納米粒(DTX-NP)，將IL13肽與納米粒表面的羧基-PEG共價相連得到DTX-1LNP，Zeta/激光粒度儀測定納米粒的平均粒徑和電位，透射電鏡觀察其形態；
[0015]2、體外膠質瘤細胞凋亡試驗，細胞水平評價IL13肽修飾的載藥納米粒對膠質瘤細胞的靶向治療效果；
[0016]3、通過體外膠質瘤球生長抑制實驗，評價IL13肽修飾的載藥納米粒對體外膠質瘤球的治療效果；
[0017]4、用紅外染料Dir標記納米粒后,通過活體成像評價IL13肽修飾的納米粒對腦膠質瘤的靶向性；
[0018]5、通過體內抗膠質瘤實驗，評價ILI3肽修飾的載藥納米粒對荷膠質瘤鼠的治療效果。
[0019]本發明的突出優點是，該遞藥系統通過腦膠質瘤細胞表面白介素13受體a 2的介導作用，促進腦膠質瘤細胞的攝取，有效地實現腦膠質瘤的靶向治療，提高化療藥物的抗腦膠質瘤效果。
[0020]為了便于理解，以下將通過具體的附圖和實施例對本發明的IL13Rci 2介導的腦膠質瘤靶向納米遞藥系統進行詳細地描述。需要特別指出的是，具體實例和附圖僅是為了說明，本領域的普通技術人員可以根據本文說明，在本發明的范圍內對本發明做出各種各樣的修正和改變，這些修正和改變也納入本發明的范圍內。
【專利附圖】
【附圖說明】 [0021]圖1，納米粒的構建及表征，其中，(A)透射電鏡圖；(B)粒徑分布圖。
[0022]圖2，載DTX的ILNP抑制體外U87腫瘤球生長圖，其中，(A)腫瘤球體積-時間曲線；(B)給藥治療后的腫瘤形態圖；DTX濃度2500ng/mL，Control為未給藥對照組，DTX為游離多西紫杉醇組，NP為載DTX納米粒組，ILNP為IL13肽修飾的載DTX納米粒組，aP〈0.05與對照組比較；bP<0.05與DTX組比較；CP<0.05與NP組比較。
[0023]圖3，靶向納米粒在荷膠質瘤裸鼠體內的活體分布圖，其中，(A)活體成像圖；(B)血液、器官熒光成像圖；(C)腦部熒光強度半定量分析結果圖；(D)器官熒光強度半定量分析結果圖；(E)腦腫瘤部位熒光強度半定量分析結果圖。
[0024]圖4，靶向納米遞藥系統治療荷膠質瘤動物模型效果，其中，(A)為荷瘤裸鼠的生存曲線；(B)TUNEI凋亡染色圖(綠色熒光顆粒表示細胞核凋亡，藍色標記為細胞核；實驗分四組:生理鹽水(Saline)組，DTX組，NP組和ILNP組。
【具體實施方式】
[0025]實施例1 IL13肽修飾納米粒(ILNP)的制備與表征
[0026]采用乳化溶酶蒸發法制備納米粒，準確稱量1.0mgDTX, 28.0mg甲氧基-PEG-PCL，
2.0mg羧基-PEG-PCL，溶于Iml 二氯甲烷后，加入5ml0.6 %的膽酸鈉，冰水浴下超聲5s，停5s,共20次,37°C旋蒸15min去除二氯甲燒,3500rpm4°C離心超濾濃縮至lmL。以2-嗎啉乙磺酸(MES)緩沖液(pH6.0)過Hitrap脫鹽柱脫鹽并置換外水相，加入4mgl-乙基_(3_ 二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽(EDC)和6mgN-羥基琥珀酰亞胺(NHS)活化20分鐘，過Hitrap脫鹽柱脫鹽并置換外水相為0.01 mol/L磷酸緩沖液(PBS，pH7.4)。加入20 u gIL13肽，反應6h，過S印harose CL-4B柱洗沖，除去未結合的IL13肽，即得IL13肽修飾的載DTX納米粒(ILNP)。采用粒徑分析儀測定納米粒的粒徑及Zete電位,經過1% (w/V,pH 7.0)磷鎢酸負染色后，透射電鏡觀察粒子形態。如圖1所示，ILNP形態圓整，平均粒徑124.5 nm,表面Zeta電位為-2.44 mV。
[0027]實施例2體外膠質瘤細胞凋亡試驗
[0028]將U87細胞接種至6 cm培養板培養24小時，當細胞匯合度達80%左右后加入含DTX濃度為500ng/mL的ILNP培養24小時。將細胞消化，采用凋亡檢測試劑盒(含annexinV-FITC和propidium iodide 50 u g/mL)對細胞進行染色,流式細胞法檢測細胞的早、晚期凋亡率。流式細胞法檢測凋亡結果如表1所示，對照組U87細胞早、晚期凋亡很少。與對照組相比，NP、ILNP, DTX處理后細胞早、晚期凋亡率均有顯著增加，細胞總凋亡率顯著增加，其中，NP、ILNP組處理后細胞的總凋亡率均顯著高于DTX組。表1是U87細胞凋亡率(n = 3)。
[0029]表1
[0030]
【權利要求】
1.一種針對腦膠質瘤的靶向納米遞藥系統，其特征在于，包括靶向功能分子，藥物和納米載體，所述的靶向功能分子為來源于白介素13的短肽，所述的藥物為小分子抗腫瘤藥物，所述的納米載體為表面聚乙二醇修飾的脂質體、納米粒、聚合物泡囊、聚合物膠束或固體脂質納米粒；所述藥物以包裹或共價連接的方式包載在納米載體內，所述短肽通過共價連接的方式與納米粒表面的聚乙二醇相連。
2.按權利要求1所述的針對腦膠質瘤的靶向納米遞藥系統，其特征在于，所述的來源于白介素13的短肽其氨基酸序列為:
VDKLLLHLKKLFREGQFNRNFESIIICRDR。
3.按權利要求1的所述的針對腦膠質瘤的靶向納米遞藥系統，其特征在于，所述的聚乙二醇的分子量為1000-20000Da。
4.按權利要求1的所述的針對腦膠質瘤的靶向納米遞藥系統，其特征在于，所述的聚乙二醇的分子量為2000-5000Da。
5.按權利要求1的針對腦膠質瘤的靶向納米遞藥系統，其特征在于，所述聚乙二醇是單甲氧基聚乙二醇或含其它活性基團的聚乙二醇。
6.按權利要求5的針對腦膠質瘤的靶向納米遞藥系統，其特征在于，所述的活性基團選自馬亞酰亞胺基、巰基、胺基、羧基、生物素或親和素中的一種。
7.按權利要求1的針對腦膠質瘤的靶向納米遞藥系統，其特征在于，所述的靶向納米遞藥系統粒徑為10-300nm。
8.按權利要求1所述的針對腦膠質瘤的靶向納米遞藥系統，其特征在于，所述的小分子抗腦膠質瘤藥物選自紫杉烷類、蒽醌類、喜樹堿類或長春堿類中的一種。
【文檔編號】A61K9/14GK103622915SQ201210306978
【公開日】2014年3月12日 申請日期:2012年8月24日 優先權日:2012年8月24日
【發明者】龐志清, 高會樂, 蔣新國, 沈順, 錢勇, 魏彥 申請人:復旦大學