一種靶向金銀合金納米籠的藥物遞送系統的制備方法及應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及醫藥領域，特別是一種靶向金銀合金納米籠的藥物遞送系統(制劑)的制備方法及應用。
【背景技術】
[0002]基因治療(gene therapy)是將目的基因導入患者的特定組織和細胞進行適當的表達，以糾正或補償因基因缺陷或異常而引起的疾病，從而達到治療疾病的目的。基因治療與傳統治療方法相比，具有無可爭議的優越性。它從根源上修正了引起疾病的異常基因，可以選擇性地治療多種嚴重威脅人類健康的疾病并且取得了一定的治療效果。目前，基因治療已經成為醫學領域里一個新的研究熱點。然而，裸露的基因治療藥物存在易被核酶降解、細胞內吞效果差和細胞靶向能力差等缺點，因此，需要尋求合適的載體，將基因治療藥物有效地輸遞到革G細胞，實現尚效的基因治療。開發安全、尚效的基因遞送載體成為基因治療的關鍵所在。
[0003]目前的基因載體可主要分為病毒載體和非病毒載體兩大類。病毒載體因具有轉導效率及表達效率高的特點，但易導致嚴重的副作用，例如毒性，免疫效應、致癌性以及炎癥反應等。非病毒載體是新興的基因轉導系統，具有低毒、低免疫反應、外源基因整合幾率低、無基因插入片斷大小限制，以及使用簡單、制備方便、便于保存和檢驗等優勢，因此已經成為當今基因治療領域里一個新的研究熱點。常見的非病毒性載體主要有:陽離子脂質體、陽離子聚合物、無機材料納米粒等。
[0004]金納米粒子具有良好的生物活性、光熱效應以及作為藥物載體越來越受到生物醫學研究者的青睞。金銀合金納米籠狀結構(Nanocages)代表一類新型的在紅外區域可調局域表面等離子體共振峰(LSPR)的納米金結構，它除了獨特的空心內部以及多孔壁特征外，還具有良好的機械柔韌性和穩定性，LSPR峰可調控性，粒徑小，比表面積大，利于載藥，容易功能修飾以提高生物相容性和靶向性等優勢使其在診斷治療學應用方面獨樹一幟。金納米籠對700?IlOOnm范圍的近紅外光具有高吸收特性，同時生物系統對此范圍的近紅外光具有高度透過性，因此可利用金銀合金納米籠的光熱轉換特性對腫瘤進行激光熱療。金銀合金納米籠是藥物轉運載體，同時也是發揮熱療效應的主體，可作為基因治療藥物增敏劑和靶向熱敏劑。
[0005]由于常見的治療會引起嚴重的全身性毒副作用，這些毒副作用病人往往難以耐受，因此其在臨床應用受到了很大的限制。這主要是因為藥物遞送系統缺乏對腫瘤細胞的辨識能力。傳統注射給藥使藥物均勻分布于全身，腫瘤部位藥物濃度較低，藥物在殺傷腫瘤細胞的同時也傷害了人體內的正常細胞。因此，在腫瘤治療中如何實現減毒增效的目標已成為了世界矚目的焦點。通過藥劑學手段開發抗腫瘤靶向藥物遞送系統是實現減輕腫瘤化療藥物毒副作用、提高腫瘤藥物靶向性、增加其抗腫瘤療效的重要手段，也是目前藥劑學的研究熱點。目前研究最多的靶頭有葉酸(FA)、精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)、精氨酸-甘氨酸_天冬酰胺(NGR)等。葉酸受體在許多癌細胞，比如肝癌，卵巢癌，肺癌，腦癌，腎癌，乳腺癌的表達顯著高于正常組織細胞，在某些情況下，甚至上調了兩個數量級。葉酸與葉酸受體具有較高的親和力，即便在葉酸與葉酸共聚物濃度較低的情況下，其也可與葉酸受體高效地結合。同時，由于價格便宜，無毒，無免疫原性，易與載體結合，穩定性高，葉酸作為配體被廣泛應用。
[0006]目前，通過靶向金銀合金納米籠基因載體負載基因藥物形成藥物遞送系統，特別是在腫瘤治療藥物中的應用尚未見有報道。因此，本發明的研制成功具有統計學上的意義和實際的臨床意義。
【發明內容】
[0007]針對上述情況，克服現有技術之缺陷，本發明之目的就是提供一種靶向金銀合金納米籠的藥物遞送系統的制備方法及應用，可有效解決現有腫瘤治療藥物副作用大、治療效果不佳的問題。
本發明解決的技術方案是，該系統是由靶向金銀合金納米籠基因載體負載基因藥物形成的藥物轉運系統，其中，靶向金銀合金納米籠基因載體和基因藥物的質量比為(1-12) X 16:1，所述的金銀合金納米籠基因載體是將靶向腫瘤分子葉酸和陽離子聚合物聚乙烯亞胺(PEI)以化學鍵和靜電作用的方式連接在金銀合金納米籠的表面構成；
所述的聚乙烯亞胺(PEI)為Mw 25000的bPE1、Mw 25000的LPEI或Mw1800的bPEI中的一種；所述的基因藥物為質粒DNA、siRNA、microRNA或IncRNA中的一種；所述的革El向金銀合金納米籠的粒徑為50-150nm，其制備方法由以下步驟實現:
1)將8-10mg葉酸、7-8mg1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)、4_5mgN-羥基琥珀酰亞胺(NHS)置于20ml pH值為4_7的PBS緩沖液中，室溫磁力攪拌2_12h，得活化的葉酸溶液；
2)稱取帶有活性基團的PEG40-60mg加入到活化的葉酸溶液中，用0.1M NaOH溶液調pH值為7-9，室溫磁力攪拌12-24h，用分子量為3500Da的透析袋透析48_72h，除去未反應的葉酸，得帶有活性基團PEG的SH-PEG-NH2K應溶液；
3)取金銀合金納米籠200-300ml加入到步驟2)制備的反應溶液中，攪拌混合均勻，用
0.1M NaOH溶液調溶液pH值為7-9，室溫磁力攪拌4_48h，12000r/min離心15_30min，得沉淀物；將沉淀物再加入到步驟2)制備的反應溶液中，攪拌混合均勻，用0.1M NaOH溶液調溶液PH值為7-9，室溫磁力攪拌4-48h，12000r/min離心15_30min，棄去上清，得沉積物，如此重復3-5次，將沉積物用超純水分散，得PEG化的靶向金銀合金納米籠溶液；
4)稱取含有巰基的小分子化合物l_5mg溶于乙醇2-10ml中，加入到步驟3)制備的PEG化的靶向金銀合金納米籠溶液中，室溫磁力攪拌4-24h混合均勻，8000-12000r/min離心15-30min，棄去上清液，得沉積物，將沉積物用超純水重新分散；然后加入1-(3-二甲氨基丙基)-3_乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC) 2-5mg、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS) l_4mg，室溫攪拌4-24h，再加入含有20-60mg的聚乙烯亞胺水溶液2_8ml，用1.2M稀鹽酸調溶液pH值為6_7，室溫攪拌0.5-24h，12000r/min離心15_30min，棄去上清，得沉淀，沉淀再重新分散于超純水中，在12000r/min離心15-30min，如此重復離心3-5次，即得靶向金銀合金納米籠基因載體； 所述的巰基小分子化合物是11-巰基烷酸、硫辛酸、巰基乙酸、巰基丙酸中的一種；
5)將上述所制得的靶向金銀合金納米籠基因載體與基因藥物以質量比為(1-12) X 16: 1，將靶向金銀合金納米籠基因載體的水溶液在渦旋的狀態下，逐滴加入到基因藥物水溶液中，渦旋30-120S，室溫孵育30-60min，即成靶向金銀合金納米籠的藥物遞送系統。
[0008]所述的靶向金銀合金納米籠的藥物遞送系統在制備抗腫瘤基因聯合熱療藥物中的應用，可以用于靜脈注射、肌肉注射、瘤內注射和皮下注射、透皮給藥、體內植入。
[0009]本發明的金銀合金納米籠基因載體能夠負載基因藥物，并能夠革El向腫瘤部位，還具有光熱轉換性能，腫瘤局部激光照射，使局部溫度升高從而實現腫瘤的光熱治療；本發明物理化學穩定性良好，制備條件簡單可行，原料來源豐富，成本低，副作用小，能有效負載基因藥物靶向腫瘤部位協同熱療抑制腫瘤細胞增殖，是腫瘤基因治療與光熱治療中載體上的創新。
【具體實施方式】
[0010]以下結合實施例對本發明的【具體實施方式】作進一步詳細說明。
[0011]本發明在具體實施中可由以下實施例給出。
[0012]實施例1
本發明在具體實施中，可由以下步驟實現:
1)將1mg葉酸、8mg1_(3_ 二甲氨基丙基)_3_乙基碳二亞胺鹽酸鹽、5mg N-輕基琥珀酰亞胺置于20ml pH值為5的PBS緩沖液中，室溫磁力攪拌12h，得活化的葉酸溶液；
2)稱取帶有活性基團的PEG60mg加入到活化的葉酸溶液中，用0.1M NaOH溶液調pH值為8，室溫磁力攪拌18h，用分子量為3500Da的透析袋透析72h，除去未反應的葉酸，得帶有活性基團PEG的SH-PEG-NH2K應溶液；
3)取金銀合金納米籠300ml加入到步驟2)制備的反應溶液中，攪拌混合均勻，用0.1MNaOH溶液調溶液pH值為9，室溫磁力攪拌48h，12000r/min離心15_30min，得沉淀物；將沉淀物再加入到步驟2)制備的反應溶液中，攪拌混合均勻，用0.1M NaOH溶液調溶液pH值為8，室溫磁力攪拌48h，12000r/min離心15_30min，棄去上清，得沉積物，如此重復3_5次，將沉積物用超純水分散，得PEG化的靶向金銀合金納米籠溶液；
4)稱取硫辛酸1.5mg溶于乙醇5ml中，加入到步驟3)制備的PEG化的革El向金銀合金納米籠溶液中，室溫磁力攪拌24h混合均勾，8000-12000r/min離心30min，棄去上清液，得沉積物，將沉積物用超純水重新分散；然后加入1-(3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽2.7mg、N-輕基琥泊酰亞胺1.6mg，室溫攪拌24h，再加入含有50mg的聚乙稀亞胺水溶液5ml，用1.2M稀鹽酸調溶液pH值為6.5，室溫攪拌24h，12000r/min離心15_30min，棄去上清，得沉淀，沉淀再重新分散于超純水中，在12000r/min離心15_30min，如此重復離心3次，即得靶向金銀合金納米籠基因載體；
5)將上述所制得的靶向金銀合金納米籠基因載體與基因藥物以質量比為9X16:
I，將靶向金銀合金納米籠基因載體的水溶液在渦旋的狀態下，逐滴加入到基因藥物水溶液中，渦旋60s，室溫孵育30min，即成靶向金銀合金納米籠的藥物遞送系統。
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