專利名稱：用于制備抗鰻利斯頓氏菌的卵黃抗體的滅活疫苗制法的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種滅活疫苗的制備方法，特別是涉及一種用于制備抗鰻利斯頓氏菌的卵黃抗體的滅活 疫苗制法。
背景技術：
鰻利斯頓氏菌作為水產養殖動物的病原菌早已被確認，該菌最早由意大利的
Canestrini于1893年首次從發生“紅疫”的鰻鱺中分離到。現已知其能引起硬頭鱒、大麻
哈魚、大菱鲆、香魚、鰻魚、太平洋鮭、螄魚、竹莢魚、真鯛、鱸魚、鰈魚、鱈魚、鮐魚、各種熱帶
淡水魚以及蝦、蟹、牡蠣、文蛤、鮑等多種水產養殖動物發生致死性的弧菌病。由鰻利斯頓氏
菌引起的疾病給水產動物養殖生產造成了很大的損失，因此，對鰻利斯頓氏菌引起的疾病
的有效預防，以最大限度地降低其危害程度，將能顯著地提高水產動物養殖生產的經濟效.、
Mo目前養殖戶大多使用化學合成藥物或抗生素類藥物控制水產養殖動物弧菌病的發生與流行，市場上缺乏一種適用于水產養殖動物苗期幼體的使用方便的抗鰻利斯頓氏菌的免疫制劑。因此，開發研制抗鰻利斯頓氏菌的疫苗，對于有效控制水產養殖動物鰻利斯頓氏菌病的發生與流行具有重要的應用前景。
發明內容
本發明所要解決的技術問題是針對現有技術的不足，提供一種提高水產養殖動物免疫力、降低海水魚養殖生產中由病原鰻利斯頓氏菌所造成的危害、以滿足水產動物養殖生產上的抗病需求的用于制備抗鰻利斯頓氏菌的卵黃抗體的滅活疫苗制法。本發明所要解決的技術問題是通過以下的技術方案來實現的。本發明是一種用于制備抗鰻利斯頓氏菌的卵黃抗體的滅活疫苗制法，其特點是該方法以病原鰻利斯頓氏菌BHl Uistonella anguillarum BHl)經甲醛溶液滅活后作為免疫原，以白油、司班80和硬脂酸鋁作油乳劑，以黃芪浸出液作為免疫增強劑，乳化制備成油乳劑滅活疫苗；其具體步驟如下
(1)將病原鰻利斯頓氏菌BHl菌株接種在普通營養瓊脂肉湯培養基上，28-30°C搖床培養24h，加入體積終濃度O. 3%的甲醛28°C滅活48h，離心得滅活菌體；
(2)取黃芪用蒸餾水浸泡30-60min后煎煮，過濾，濃縮至終濃度為原藥lg/mL，得黃芪浸出液；
(3 )將白油加熱至50-55 V，加入硬脂酸鋁，硬脂酸鋁與白油的重量體積比為1-3 :100g / ml，繼續加熱至65-70°C，加入司班80，司班80與白油的體積比為5-7 :100，直至終溫度115-120°C，維持15-20 min，制得油相，冷卻備用；
(4)將滅活菌體與黃芪浸出液混合，制得疫苗水相；水相中病原鰻利斯頓氏菌BHl免疫原為10ncells/mL，黃芪浸出液為lg/mL，水相中還加入了終體積濃度為4%的吐溫80 ；
(5)將油相和水相按體積比2:1混合乳化研磨5min，制得黃芪和白油為聯合佐劑的鰻利斯頓氏菌油乳劑滅活疫苗。本發明所述的病原鰻利斯頓氏菌(Zi1SiofldJa anguillarum BHl)已經在公開文獻《半滑舌鰨病原鰻利斯頓氏菌表型及分子特征研究》中所公開(菌株BHl )，上述公開文獻發表于《海洋學報》，2009，31 (5):112-121。菌株BHl的DNA序列長度及Genebank登錄號見下表
該菌株BHl為公知公用材料，現保存在淮海工學院海洋學院實驗室，在本專利申請日起二十年內，公眾如果需要，淮海工學院海洋學院實驗室可對外發放。本發明方法制得的鰻利斯頓氏菌油乳劑滅活疫苗的使用方法是采用頸部皮下注射免疫的方法免疫成年產蛋雞，第I次免疫劑量為O. 5 mL，一周后按前述方法加強免疫，免疫劑量為O. 5 mL，一周后按前述方法繼續加強免疫，免疫劑量為I mL，一周后按前述方法再加強免疫，免疫劑量為O. 5 mL，共免疫4次，收集被免疫雞所產雞蛋，分離出卵黃，并測定其抗體效價。免疫結束后第I周至第2周卵黃抗體效價維持在213左右，第3周以后卵黃抗體效價為214左右。然后將所獲得的高免雞蛋作為原料，經冷凍干燥(蛋黃液厚度6_，凍干時間IOh)制備成含有抗鰻利斯頓氏菌的高免卵黃抗體的蛋黃粉，按5%左右比例添加在配合飼料中投喂使用。本發明方法制得的鰻利斯頓氏菌油乳劑滅活疫苗可以得到抗鰻利斯頓氏菌的高免卵黃抗體，高免卵黃抗體的使用能增強半滑舌鰨等海水魚類對病原鰻利斯頓氏菌的免疫力，提高半滑舌鰨等海水魚類養殖的成活率，增加半滑舌鰨等海水魚類養殖的產量，提高半滑舌鰨等海水魚類養殖生產的經濟效益。從根本上解決了目前半滑舌鰨等海水魚類養殖生產過程中易發生鰻利斯頓氏菌所致疾病的問題。
具體實施例方式以下進一步描述本發明的具體技術方案，以便于本領域的技術人員進一步地理解本發明，而不構成對其權利的限制。實施例1，一種用于制備抗鰻利斯頓氏菌的卵黃抗體的滅活疫苗制法，該方法以病原鰻利斯頓氏菌BHl UAstonella anguillarum BHl)經甲醒溶液滅活后作為免疫原，以白油、司班80和硬脂酸鋁作油乳劑，以黃芪浸出液作為免疫增強劑，乳化制備成油乳劑滅活疫苗；其具體步驟如下
(1)將病原鰻利斯頓氏菌BHl菌株接種在普通營養瓊脂肉湯培養基上，30°C搖床培養24h，加入體積終濃度O. 3%的甲醛28°C滅活48h，離心得滅活菌體；
(2)取黃芪用蒸餾水浸泡60min后煎煮，過濾，濃縮至終濃度為原藥lg/mL，得黃芪浸出
液；
(3)將白油加熱至50°C，加入硬脂酸鋁，硬脂酸鋁與白油的重量體積比為I:100 g /ml，繼續加熱至65°C，加入司班80，司班80與白油的體積比為5 :100，直至終溫度115°C，維持15min，制得油相，冷卻備用；(4)將滅活菌體與黃芪浸出液混合，制得疫苗水相；水相中病原鰻利斯頓氏菌BHl免疫原為10ncells/mL，黃芪浸出液為lg/mL，水相中還加入了終體積濃度為4%的吐溫80 ；
(5)將油相和水相按體積比2:1混合乳化研磨5min，制得黃芪和白油為聯合佐劑的鰻利斯頓氏菌油乳劑滅活疫苗。實施例2，一種用于制備抗鰻利斯頓氏菌的卵黃抗體的滅活疫苗制法，該方法以病原鰻利斯頓氏菌BHl UAstonella anguillarum BHl)經甲醒溶液滅活后作為免疫原，以白油、司班80和硬脂酸鋁作油乳劑，以黃芪浸出液作為免疫增強劑，乳化制備成油乳劑滅活疫苗；其具體步驟如下
(1)將病原鰻利斯頓氏菌BHl菌株接種在普通營養瓊脂肉湯培養基上，29°C搖床培養24h，加入體積終濃度O. 3%的甲醛28°C滅活48h，離心得滅活菌體；
(2)取黃芪用蒸餾水浸泡60min后煎煮，過濾，濃縮至終濃度為原藥lg/mL，得黃芪浸出
液；
(3)將白油加熱至52°C，加入硬脂酸鋁，硬脂酸鋁與白油的重量體積比為3:100 g /ml，繼續加熱至68 V，加入司班80，司班80與白油的體積比為7 :100，直至終溫度118°C，維持18 min，制得油相，冷卻備用；
(4)將滅活菌體與黃芪浸出液混合，制得疫苗水相；水相中病原鰻利斯頓氏菌BHl免疫原為10ncells/mL，黃芪浸出液為lg/mL，水相中還加入了終體積濃度為4%的吐溫80 ；
(5)將油相和水相按體積比2:1混合乳化研磨5min，制得黃芪和白油為聯合佐劑的鰻利斯頓氏菌油乳劑滅活疫苗。實施例3，一種用于制備抗鰻利斯頓氏菌的卵黃抗體的滅活疫苗制法，該方法以病原鰻利斯頓氏菌BHl UAstonella anguillarum BHl)經甲醒溶液滅活后作為免疫原，以白油、司班80和硬脂酸鋁作油乳劑，以黃芪浸出液作為免疫增強劑，乳化制備成油乳劑滅活疫苗；其具體步驟如下
(1)將病原鰻利斯頓氏菌BHl菌株接種在普通營養瓊脂肉湯培養基上，28°C搖床培養24h，加入體積終濃度O. 3%的甲醛28°C滅活48h，離心得滅活菌體；
(2)取黃芪用蒸餾水浸泡45min后煎煮，過濾，濃縮至終濃度為原藥lg/mL，得黃芪浸出
液；
(3)將白油加熱至55°C，加入硬脂酸鋁，硬脂酸鋁與白油的重量體積比為2:100 g /ml，繼續加熱至70°C，加入司班80，司班80與白油的體積比為6 :100，直至終溫度120°C，維持20 min，制得油相，冷卻備用；
(4)將滅活菌體與黃芪浸出液混合，制得疫苗水相；水相中病原鰻利斯頓氏菌BHl免疫原為10ncells/mL，黃芪浸出液為lg/mL，水相中還加入了終體積濃度為4%的吐溫80 ；
(5)將油相和水相按體積比2:1混合乳化研磨5min，制得黃芪和白油為聯合佐劑的鰻利斯頓氏菌油乳劑滅活疫苗。實施例4，取實施例3制得的鰻利斯頓氏菌油乳劑滅活疫苗進行的應用實驗。I.鰻利斯頓氏菌油乳劑滅活疫苗免疫產蛋雞。鰻利斯頓氏菌油乳劑滅活疫苗采用頸部皮下注射免疫的方法免疫成年產蛋雞，第I次免疫劑量為O. 5 mL，一周后按前述方法加強免疫，免疫劑量為O. 5 mL，一周后按前述方法繼續加強免疫，免疫劑量為I mL，一周后按前述方法再加強免疫，免疫劑量為O. 5 mL，共免疫4次，收集被免疫雞所產雞蛋，分離出卵黃作高免卵黃抗體，并測定其抗體效價。免疫結束后第I周至第2周卵黃抗體效價維持在213，第3周以后卵黃抗體效價為214。2.用抗鰻利斯頓氏菌的高免卵黃抗體進行的免疫實驗及其結果。實驗時間2011年度4月 5月。實驗地點江蘇省淮海工學院水產動物病害實驗室。實驗動物半滑舌鰨和大菱鲆。高免卵黃抗體與方法使用所述的方法制得的抗鰻利斯頓氏菌的高免卵黃抗體。使用時以所獲得的高免雞蛋作為原料，經冷凍干燥(蛋黃液厚度6_，凍干時間IOh)制備成含有抗鰻利斯頓氏菌的高免卵黃抗體的蛋黃粉，按5%比例添加在配合飼料中投喂使用。試驗用半滑舌鰨和大菱鲆投喂抗鰻利斯頓氏菌的高免卵黃抗體飼料2d后，分別 用濃度為 I. 56X 108CFU/mL 的獲利斯頓氏菌 BHl {Listonella anguillarum BHl)菌懸液 注射感染受免半滑舌鰨和大菱鲆，感染劑量為O. 3mL。試驗期為7d，并持續投喂抗鰻利斯頓氏菌的高免卵黃抗體飼料。對照組為用濃度I. 56X 108CFU/mL 的鰻利斯頓氏菌ΒΗ1(ΖΥ5· ο/7<977<3 anguillarumBHl)菌懸液注射感染投喂普通飼料的半滑舌鰨和大菱鲆，感染劑量為O. 3mL。實驗結果半滑舌鰨和大菱鲆經實驗例I所述的抗鰻利斯頓氏菌的高免卵黃抗體和使用方法進行免疫后，兩種海水魚都能產生一定的免疫保護力，其免疫保護率分別為85%、75%。見下表
權利要求
1. 一種用于制備抗鰻利斯頓氏菌的卵黃抗體的滅活疫苗制法，其特征在于該方法以病原鰻利斯頓氏菌BHl {Listonella anguillarum BHl)經甲醛溶液滅活后作為免疫原，以白油、司班80和硬脂酸鋁作油乳劑，以黃芪浸出液作為免疫增強劑，乳化制備成油乳劑滅活疫苗；其具體步驟如下 (1)將病原鰻利斯頓氏菌BHl菌株接種在普通營養瓊脂肉湯培養基上，28-30°C搖床培養24h，加入體積終濃度O. 3%的甲醛28°C滅活48h，離心得滅活菌體； (2)取黃芪用蒸餾水浸泡30-60min后煎煮，過濾，濃縮至終濃度為原藥lg/mL，得黃芪浸出液； (3 )將白油加熱至50-55 V，加入硬脂酸鋁，硬脂酸鋁與白油的重量體積比為1-3 :100g / ml，繼續加熱至65-70°C，加入司班80，司班80與白油的體積比為5_7 :100，直至終溫度115-120°C，維持15-20 min，制得油相，冷卻備用； (4)將滅活菌體與黃芪浸出液混合，制得疫苗水相；水相中病原鰻利斯頓氏菌BHl免疫原為10ncells/mL，黃芪浸出液為lg/mL，水相中還加入了終體積濃度為4%的吐溫80 ； (5)將油相和水相按體積比2:1混合乳化研磨5min，制得黃芪和白油為聯合佐劑的鰻利斯頓氏菌油乳劑滅活疫苗。
全文摘要
一種用于制備抗鰻利斯頓氏菌的卵黃抗體的滅活疫苗制法，該方法先將病原鰻利斯頓氏菌BH1菌株滅活、離心得滅活菌體；然后制得黃芪浸出液；再由白油、硬脂酸鋁、司班80制得油相，滅活菌體與黃芪浸出液混合制得疫苗水相；最后將油相和水相按體積比2:1混合乳化研磨5min，制得黃芪和白油為聯合佐劑的副溶血弧菌油乳劑滅活疫苗。該疫苗可以得到抗鰻利斯頓氏菌的高免卵黃抗體，高免卵黃抗體的使用能增強半滑舌鰨等海水魚類對病原鰻利斯頓氏菌的免疫力，提高其成活率，增加其產量，提高半滑舌鰨等海水魚類養殖生產的經濟效益。從根本上解決了目前半滑舌鰨等海水魚類養殖生產過程中易發生鰻利斯頓氏菌所致疾病的問題。
文檔編號A61K39/395GK102836431SQ201210335928
公開日2012年12月26日 申請日期2012年9月12日 優先權日2012年9月12日
發明者張曉君, 畢可然, 陳麗, 閆斌倫, 秦國民 申請人:淮海工學院