專利名稱：一種高生物活性卵黃抗體的制備方法
技術領域：
一種高生物活性卵黃抗體的制備方法，屬于生物制品和工業化分離技術領域。
背景技術：
雞卵黃中富含卵黃抗體、高磷蛋白等生物活性蛋白，并被認為是活性抗體含量與活性最高，也是最廉價的資源。但迄今為止，還沒有如人們所期望的那樣得到工業化利用。其主要原因是因為卵黃中含有豐富的脂肪、蛋白質、膽固醇、卵磷脂等多種物質，對卵黃抗體的工業化分離造成了嚴重的困難。目前分離卵黃抗體的方法主要有以下幾種(1)采用乙醇、聚乙二醇、丙酮等有機試劑分離的方法，雖然分離效果較好，但因為卵黃抗體主要是用于功能食品添加劑、生物醫藥等領域，因此如采用上述辦法則有以下幾個方面的問題。一是成本較高(試劑耗量大，如目前普遍采用的PEG-6000的用量最高達到12％的高濃度)；二是工藝復雜，操作條件難以掌握，且易造成卵黃抗體活性損失；三是產品最終有化學有害物質殘留，產品的安全性達不到要求。(2)采用離子交換、金屬螯合色譜、親和色譜分離的方法，雖然純度較高，但生產規模只以克計，而成本更可高達每克上百元。(3)采用CMC、海藻酸鈉和殼聚糖等大分子膠的水相抽提法，由于直接將大分子膠加入蛋黃體系，因此抽提效率較低，并在蛋黃中仍然含有較多的雜質及CMC、海藻酸鈉等殘留膠體大分子，直接影響了下一步超濾分離濃縮工藝。
發明內容
本發明的目的是提供一種高生物活性卵黃抗體的制備方法，采用食品級天然高分子膠高效澄清技術，結合低溫超濾濃縮分離新工藝，徹底解決了在分離過程中蛋黃液中殘留高分子膠體的缺點，有利于卵黃抗體的分離提取，同時又使得蛋黃液可以得到進一步的應用。采用本發明能夠以年產10噸以上的規模生產高生物活性卵黃抗體產品。同時剩余蛋清和蛋黃粉經加工后，還可得到蛋白粉、剩余蛋黃粉或蛋黃油與蛋黃卵磷脂等副產品，使得蛋黃的加工深度得到了極大的提高，產品附加值也大增加，而成本則遠低于以前的方法。
本發明的技術方案主要創新點有如下幾點(1)以蛋雞為生物轉化器，采用疫苗對蛋雞進行免疫接種，以提高卵黃抗體的生物效價，一般可提高16倍至64倍。其疫苗為人體口腔、胃腸道常見致病菌、病毒等，如致病性大腸桿菌、沙門氏菌、綠膿桿菌、變異鏈球菌或胃幽門螺桿菌。上述菌種與免疫佐劑制成疫苗后，對20～25周齡的蛋雞進行免疫注射，共4～6次，其雞蛋中的抗體高活性可維持1年左右。如只需生產普通的、無特異性的蛋黃抗體也可以省掉此免疫步驟，而生產工藝則完全相同。(2)采用食品級天然高分子膠高效澄清技術，結合工業化超濾濃縮分離技術，從蛋黃中分離提取活性卵黃抗體，使活性卵黃抗體的低成本、工業化分離得以實現，可達到年產10噸以上卵黃抗體產品的生產規模。卵黃抗體的產品純度可達到30％-50％。(3)采用有機膜或陶瓷膜微濾對濃縮液進行冷除菌，其產品的總菌數可小于500CFU/g，大大好于類似產品一初乳粉或初乳清粉中的微生物指標。(4)整個工藝流程都在低溫下(0～12℃)進行，確保了產品的高生物活性。
本發明的工藝為(1)將蛋雞免疫后所產之新鮮雞蛋或普通新鮮雞蛋作為原料，經檢查消毒后，采用手工或機械方式分離蛋清和蛋黃。蛋清可直接經噴霧干燥制得副產品蛋白粉，或經發酵后噴霧干燥制得脫糖蛋白粉。將蛋黃經純水稀釋、攪拌、離心或沉淀分離后，得卵黃抗體粗提液，技術條件為蛋黃∶純水＝1∶6～20(w/w)，直接攪拌5～25分鐘，用蝶式離心機3000～8000r/min分離或在0～12℃下自然沉降4～16小時后分離。上清液為卵黃抗體粗提液。沉淀物(剩余蛋黃)經噴霧干燥后制得副產品蛋黃粉或采用超臨界提取方法分離得到蛋黃卵磷脂、蛋黃油和剩余蛋黃粉等副產品。
(2)將卵黃抗體粗提液，按順序加入食品級天然高分子膠和食品級無機或有機鈣鹽，分別經攪拌、離心分離或板框過濾后得到澄清液，技術條件為食品級天然高分子膠為阿拉伯膠、卡拉膠、海藻酸鈉、黃原膠等，無機或有機鈣鹽為食品級醋酸鈣、氯化鈣、乳酸鈣等，其組成比例視料液情況而稍有不同，食品級天然高分子膠的用量為卵黃抗體粗提液質量的0.01％～2.8％，攪拌5～30min，然后靜置10min～40min后，經蝶式離心或板框過濾后去除沉淀物，蝶式離心機2000～5000r/min分離或加入卵黃抗體粗提液質量的0.1％～1.5％的硅藻土進行板框過濾，沉淀物等雜質棄去，取澄清液。
(3)澄清液進行低溫連續超濾膜分離，得到濃縮截留液。超濾溫度為4～12℃，超濾膜的截留相對分子質量為50,000～150,000，采用聚偏氟乙烯膜(PVDF膜)、改性聚砜膜(PS膜)或聚醚砜膜(POS)。膜總面積可達300M2以上。
(4)超濾透過液主要是一些低分子物質，可棄去。最后將濃縮截留液在4～12℃微濾除菌，微濾膜材料為改性聚砜膜(PS膜)或陶瓷膜等，孔徑為0.1-0.5μm。
(5)微濾透過液在-40～-30℃冷凍120分鐘，再逐步升溫至30℃，干燥22小時，得到主產品生物活性卵黃抗體。
本發明的有益效果(1)通過雞的疫苗免疫可得到高含量，高效價的活性卵黃抗體，極大地提高了對人體常見致病菌的抑菌能力，一般效價可提高16～64倍。
(2)該工藝采用食品級天然高分子膠提取技術，大大降低了后道工序中超濾膜的污染，使得工業化超濾生產得以實現。
(3)超濾工藝具有無相態變化，不存在高溫或化學因素破壞的優點，從根本上攻克了卵黃抗體在加工過程中容易失活的難關，可最大程度地保留產品的活性。
(4)微濾除菌既能夠去除包括活菌體和死菌體在內的絕大多數的細菌體，又保留了產品的生物活性，而其他方法(如巴氏熱殺菌或輻照低溫殺菌)都會使蛋黃抗體的效價大大降低，從而大大降低產品的生物活性。
(5)由于該工藝在水相提取卵黃抗體時，只使用了純水，不必調節pH，從而使得對副產品蛋黃粉或全蛋粉的影響比其他工藝要小得多。而且采用了膜分離等高新技術后，可保證卵黃抗體產品中不含任何有害物質，不含激素，高效安全。
(6)提高了資源利用度，在生產過程中避免使用有機溶劑等有害物質，減少污染，保護了環境。
(7)自動化程度較高，操作條件容易掌握，生產效率高，生產成本可大幅降低。
圖1高生物活性卵黃抗體制備工藝流程框圖。
具體實施例方式
實施例1將10噸新鮮雞蛋經消毒、打蛋、分蛋，所得蛋清經噴霧干燥或微生物發酵后制得副產品蛋白粉或脫糖蛋白粉約600公斤左右，所得蛋黃約2.3噸加入25～45噸純水，攪拌15分鐘，沉淀4～16小時，離心分離。沉淀物為剩余蛋黃，經噴霧干燥制得副產品蛋黃粉，約1200公斤左右。上清液為卵黃抗體粗提液，按配比加入食品級添加劑黃原膠和乳酸鈣，攪拌15分鐘，經板框過濾后將沉淀物棄去。澄清液經POS膜超濾，4～12℃，膜面積100m2。濃縮截留液經0.22μmPS膜或陶瓷微濾膜除菌后，再急凍至-40～-30℃，保持120min左右，然后在不大于10Pa真空度，不超過30℃條件下干燥22小時，得到主產品生物活性卵黃抗體，約為23～30公斤。
實施例2蛋雞的免疫方法免疫的疫苗為人體口腔、胃腸道常見致病菌或病毒致病性大腸桿菌、沙門氏菌、綠膿桿菌、變異鏈球菌或胃幽門螺桿菌，上述菌種與免疫佐劑制成疫苗后，對20～25周齡的蛋雞進行免疫注射，共4～6次。
取10噸蛋雞經上述方法免疫后所產之新鮮雞蛋為原料，所得卵黃抗體粗提液，按配比加入食品添加劑卡拉膠和氯化鈣，其余操作同實施例1，所得主產品為高生物活性卵黃抗體，比實施例1從普通雞蛋中所得的生物活性卵黃抗體的生物效價高16～64倍。
應用例本產品可用于含生物活性卵黃抗體的嬰兒、老年人及免疫功能低下人群的功能食品中，如嬰兒仿母乳產品，其主要成分有活性抗體(即活性免疫球蛋白)、乳鐵蛋白、DHA(及EPA)、溶菌酶、低分子量蛋白質和碳水化合物，其配比近似于母乳組成，由低含量的乳糖、礦物質、50％以上的蛋白質和不少于5％的免疫球蛋白和1％的乳鐵蛋白組成，稀釋成濃度3.0-5.0g/L的溶液，其免疫活力與初乳相近。這類嬰兒食品在脂肪酸和活性抗體的組成含量上與母乳相近，有利于嬰兒吸收并提高對疾病的免疫能力，對嬰兒的生長發育也有明顯的促進作用。另外，也可直接添加于新一代仿母乳嬰兒配方奶粉中，生產功能性更接近于母乳的新一代嬰兒配方奶粉，其產品含有0.2％～2.0％以上的生物活性卵黃抗體。
權利要求
1.一種高生物活性卵黃抗體的制備方法，其特征是采用食品級天然高分子膠提取技術，結合超濾技術，從蛋黃中分離生物活性卵黃抗體，其工藝為(1)以蛋雞免疫后所產之新鮮雞蛋或普通新鮮雞蛋為原料，經消毒、分離蛋清后，將所得蛋黃液經純水稀釋、攪拌、離心或沉淀分離處理蛋黃∶純水質量比為1∶6～20，攪拌5～25分鐘，用蝶式離心機3000～8000r/min分離或在0～12℃下自然沉降4～16小時，上清液為卵黃抗體粗提液；(2)卵黃抗體粗提液中依次加入食品級天然高分子膠和食品級無機或有機鈣鹽，經攪拌、離心分離或板框過濾處理食品級天然高分子膠的用量為卵黃抗體粗提液質量的0.01％～2.8％，食品級無機或有機鈣鹽的用量為卵黃抗體粗提液質量的0.01％～3.50％，攪拌5～30分鐘，靜置10～40分鐘，蝶式離心機2000～5000r/min分離，或加入卵黃抗體粗提液質量的0.1％～1.5％的硅藻土進行板框過濾，取澄清液；(3)將澄清液進行連續超濾膜分離，得到濃縮截留液，超濾溫度4～12℃，超濾膜的截留相對分子質量為50,000～150,000，膜材料為聚偏氟乙烯膜、改性聚砜膜或聚醚砜膜；(4)將濃縮截留液在4～12℃微濾除菌，微濾膜孔徑為0.1-0.5μm，膜材料為陶瓷膜或改性聚砜膜；(5)將微濾透過液經-40～-30℃冷凍120分鐘，再逐步升溫至30℃，干燥22小時，得到主產品生物活性卵黃抗體。
2.根據權利要求1所述的制備方法，其特征是蛋雞的免疫免疫的疫苗為人體口腔、胃腸道常見致病菌或病毒致病性大腸桿菌、沙門氏菌、綠膿桿菌、變異鏈球菌或胃幽門螺桿菌，上述菌種與免疫佐劑制成疫苗后，對20～25周齡的蛋雞進行免疫注射，共4～6次，蛋雞經免疫后所產之新鮮雞蛋比普通雞蛋所含有卵黃抗體的生物效價高16～64倍，其雞蛋中的抗體高活性可維持1年。
3.根據權利要求1所述的方法，其特征是所用食品級天然高分子膠為阿拉伯膠、卡拉膠、海藻酸鈉或黃原膠，所用食品級無機或有機鈣鹽為醋酸鈣、氯化鈣或乳酸鈣。
4.根據權利要求1所述的方法，其特征是采用微濾技術對超濾濃縮截留液進行冷除菌，主產品生物活性卵黃抗體的微生物指標總菌數小于500CFU/g。
5.根據權利要求1所述的方法，其特征是主產品生物活性卵黃抗體中卵黃抗體的含量達到30％-50％。
6.根據權利要求1所述的方法，其特征是實現了年產10噸以上的工業化規模生產生物活性卵黃抗體。
7.根據權利要求1所述的方法，其特征是原料雞蛋分離所得之蛋清，直接經噴霧干燥制得副產品蛋白粉，或者經發酵后噴霧干燥制得副產品脫糖蛋白粉；蛋黃經抽提后的剩余蛋黃沉淀物經噴霧干燥制得副產品蛋黃粉，或進一步加工得到蛋黃油與蛋黃卵磷脂。
全文摘要
一種高生物活性卵黃抗體的制備方法，屬于生物制品和工業化分離技術領域。本發明采用食品級天然高分子膠高效提取技術，結合超濾技術，實現了工業化規模從蛋黃中分離提取高生物活性卵黃抗體，年產10噸以上。產品中卵黃抗體含量可達30％－50％，同時蛋清和剩余蛋黃經加工后，還可得到蛋白粉、蛋黃粉或蛋黃油與蛋黃卵磷脂等副產品。本發明采用了生物免疫、膜分離等高新技術，具有技術含量高，資源利用度高，自動化程度高的特點，是清潔工藝生產綠色生物活性食品的典型代表。
文檔編號C07K16/02GK1844144SQ20061004041
公開日2006年10月11日 申請日期2006年5月8日 優先權日2006年5月8日
發明者楊嚴俊, 徐榕榕 申請人:江南大學