抗黃海希瓦氏菌卵黃抗體及其制備方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物制品制備技術及應用領域，尤其是涉及一種抗黃海希瓦氏菌卵黃抗體的制備方法。
【背景技術】
[0002]黃海希瓦氏菌(ShewanellamarfIavi)是 Jung-Hoon Yoon 于 2004 年命名的，屬于希瓦氏菌屬。希瓦氏菌是主要的海洋病原菌之一。據報道黃海希瓦氏菌能感染牡蠣和仿刺參等海洋生物，是危害較高的菌種。
[0003]目前對于黃海希瓦氏菌引起的疾病的防治手段最主要的有以下幾種:抗生素、中草藥、單克隆抗體、滅活疫苗等。抗生素和化學藥物易引起應激反應，對生物有不同程度的毒性，且反復使用容易產生耐藥性，存在藥物殘留，在倡導綠色農業的今天必將退出歷史舞臺；中草藥的藥效持久，但卻很難迅速起效，且各地區中草藥藥性差別較大，使用不易控制，多用于疾病預防；疫苗接種是防治細菌性疾病最直接有效的方法，國外已經有多種商品化疫苗出售，但我國水產疫苗研制起步較晚，到目前為止僅有草魚出血病疫苗獲得了商品化生產批準，疫苗的研發、生產、銷售及廣泛使用都需要相當長的一段時間。
[0004]卵黃抗體(IgY)是從經抗原免疫的禽類所產卵中分離的具有特異性的蛋白，它具有產率高、穩定性好、特異性強等優點，是一種易于生產、廉價的抗體，免疫I只雞所收集到的僅I個雞蛋中含有的IgY的量(約100mg-200mg)遠遠高于免疫I只兔所收集到的全部血清中的抗體量。IgY具有較強的耐酸、耐堿、耐熱能力。高效卵黃抗體可以通過注射、拌餌投喂、浸浴等方式對水產動物起到保護和疾病治療作用，還可用于免疫學檢測等領域。目前，卵黃抗體在畜牧業上已經得到較廣泛的關注和應用，但在水產行業的研究開發還處于基礎階段，目前在水產方面申請公開和授權的專利有抗對蝦病毒、抗鰻弧菌、抗副溶血弧菌以及抗嗜水氣單胞菌的卵黃抗體，但是，目前還沒有關于抗黃海希瓦氏菌卵黃抗體及其制備方法的報道。
【發明內容】
[0005]本發明所要解決的技術問題是提供一種抗黃海希瓦氏菌卵黃抗體及其制備方法，該卵黃抗體純度較高，且對黃海希瓦氏菌有較強的抑制作用，同時高免卵黃的獲取廉價、方便，便于低成本、大批量生產，其制備方法簡便易行，可用于由黃海希瓦氏菌引起的疾病的預防和治療上及開發黃海希瓦氏菌檢測試劑盒和進行免疫學上的免疫反應及診斷。
[0006]本發明的第一方面提供一種抗黃海希瓦氏菌卵黃抗體，該卵黃抗體是用滅活黃海希瓦氏菌為抗原對蛋雞進行免疫，收集該被免疫的蛋雞的雞蛋，對雞蛋卵黃中分離得到的水溶性組分，再進行分離純化后得到的。
[0007]進一步地，所述的蛋雞為120日齡的健康產蛋母雞。
[0008]本發明的第二方面，提供一種上述所述的抗黃海希瓦氏菌卵黃抗體的制備方法，該制備方法包括如下步驟:
[0009](I)抗原的制備:將黃海希瓦氏菌在液體培養基中擴增培養至菌液濃度19CFU/mL，收集菌體，菌體用PBS稀釋后用甲醛滅活，得到滅活的黃海希瓦氏菌抗原；
[0010](2)免疫蛋雞:將步驟(I)得到的滅活的黃海希瓦氏菌抗原與弗式完全佐劑或弗式不完全佐劑按照等體積混合，乳化，制成弗式完全佐劑疫苗或弗式不完全佐劑疫苗；對蛋雞進行免疫，共免疫三次，初免時使用完全弗式佐劑疫苗，二免和三免時使用弗式不完全佐劑疫苗；
[0011](3) 二免后每隔一周收集雞蛋一次，將收集的雞蛋清洗、消毒后，收集卵黃液，卵黃液中加入6倍體積的去離子水稀釋，調pH至5.0-5.2，4°C靜置過夜后，離心，收集上清液，用0.45 μ m濾膜過濾，濾液為水溶性組分；
[0012](4)將步驟(3)所得水溶性組分經純化得到抗黃海希瓦氏菌卵黃抗體。
[0013]在上述技術方案中，步驟(2)所述的對蛋雞的免疫方法為:初免時弗式完全佐劑疫苗的總注射劑量為每只蛋雞lmL，其中左右胸肌各注射0.2?0.4mL，頸部皮下注射
0.2?0.6mL ;初免2周后進行二免，弗式不完全佐劑疫苗總注射劑量為每只蛋雞1.5mL，其中左右胸肌和頸部皮下各注射0.5mL ;二免2周后進行三免，弗式不完全佐劑疫苗總注射劑量為每只蛋雞2mL，其中左右胸肌各0.5?0.8mL，頸部皮下注射0.4?lmL。
[0014]在上述所有技術方案中，步驟(4)所述的純化方法為:在步驟(3)得到的水溶性組分中加入硫酸銨至飽和度為50 %，混勻，待完全溶解后置4°C過夜；4°C下離心，用去離子水重新懸浮沉淀至原體積，再加入硫酸鈉至飽和度為14%，混勻，置室溫過夜；25°C下離心，用去離子水重新懸浮沉淀至原體積，得到抗黃海希瓦氏菌卵黃抗體粗提液；將卵黃抗體粗提液用10KDa截留量的超濾膜包進行超濾，超濾后得到的卵黃抗體提取液在_80°C條件下預凍2h，然后在真空度20Pa條件下進行冷凍干燥，24h后獲得卵黃抗體凍干粉，4°C保存備用O
[0015]在上述技術方案中，步驟(3)中得到的水溶性組分先進行卵黃抗體效價測定后，選取抗體效價在1:10000以上的水溶性組分，再經純化得到抗黃海希瓦氏菌卵黃抗體。所述卵黃抗體的效價測定方法采用間接酶聯免疫吸附法。
[0016]在本發明中，采用上述制備方法制備得到的卵黃抗體(IgY)提取液，經BSA法測得IgY濃度達到12mg/ml，經SDS-PAGE測得IgY的純度達85%以上。
[0017]本發明的第三方面，提供上述所述的抗黃海希瓦氏菌卵黃抗體在制備治療黃海希瓦氏菌引起的疾病的制劑中的應用。所述制劑優選為藥物、保健品和飼料添加劑。具體為:將上述的方法制備得到的抗黃海希瓦氏菌卵黃抗體的水溶性組分或經純化得到的抗黃海希瓦氏菌卵黃抗體純品按一定比例與輔料配比，制成不同的制劑，包括液態制劑、顆粒制劑、膏劑、片劑或膠囊制劑等，可用于制備預防和治療抗黃海希瓦氏菌感染的疾病的藥物、保健品，以及水產養殖中防治黃海希瓦氏菌引起的疾病的藥物或飼料添加劑。所述輔料及比例不予特別限定，可以采用本領域常規添加劑或比例。
[0018]本發明的第四方面，提供上述所述的抗黃海希瓦氏菌卵黃抗體在制備以黃海希瓦氏菌為抗原的親和純化試劑或以黃海希瓦氏菌為抗原的免疫檢測試劑中的應用。其中，所述以黃海希瓦氏菌為抗原的親和純化試劑中，抗黃海希瓦氏菌卵黃抗體可以作為親和配基，用于相應抗原的親和純化；所述以黃海希瓦氏菌為抗原的免疫檢測試劑中的應用，具體包括酶聯免疫吸附法、免疫沉淀、免疫電鏡、免疫印跡、抗體芯片、時間分辨熒光免疫分析和免疫細胞學等一系列免疫診斷技術中的應用，用以檢測相應的抗原。
[0019]與現有技術相比，本發明的優點在于:本發明公開了一種抗黃海希瓦氏菌卵黃抗體及其制備方法，該方法制備得到的卵黃抗體純度較高，且對黃海希瓦氏菌有較強的抑制作用，同時高免卵黃的獲取廉價、方便，便于低成本、大批量生產，其制備方法簡便易行，最終獲得的高產、高效、較高純度的卵黃抗體可用于由黃海希瓦氏菌引起的疾病的預防和治療上及開發黃海希瓦氏菌檢測試劑盒和進行免疫學上的免疫反應及診斷。本發明首次提出了抗黃海希瓦氏菌卵黃抗體及其制備方法，填補了抗黃海希瓦氏菌卵黃抗體相關研究的空白，并為以后的研究與應用奠定基礎。
【附圖說明】
[0020]圖1為抗黃海希瓦氏菌卵黃抗體效價隨免疫時間的變化結果；
[0021]圖2為檢測抗黃海希瓦氏菌卵黃抗體純化效果的SDS-PAGE凝膠電泳結果，其中，泳道1:蛋白Marker，泳道2:水溶性組分，泳道3:硫酸錢鹽析后的IgY，泳道4:硫酸鈉鹽析后的IgY，泳道5:超濾后獲得的IgY，泳道6 =IgY凍干粉，泳道7:標準IgY ;
[0022]圖3為抗黃海希瓦氏菌卵黃抗體體外凝集趨勢圖，圖中顯示22h內添加不同濃度特異性IgY與非特異IgY對黃海希瓦氏菌的凝集效果；
[0023]圖4為透射電鏡檢測抗黃海希瓦氏菌卵黃抗體特異性結果，圖中顯示黃海希瓦氏菌與特異性IgY、非特異性IgY、不添加IgY共培養后與膠體金標記兔抗雞IgG的孵育效果；
[0024]圖5為免疫熒光檢測抗黃海希瓦氏菌卵黃抗體特異性結果，圖中顯示黃海希瓦氏菌與特異性IgY、非特異性IgY、不添加IgY共培養后與FITC標記兔抗雞IgG的孵育效果。
【具體實施方式】
[0025]為了使本發明的目的、方案、流程和優點更加清楚明晰，結合附圖和實施例對本發明做進一步的詳細說明，值得注意的是，此處具體實施例僅作為解釋說明本發明，并不用于限定本發明。下述實施例中，如無特殊說明，所使用的實驗方法均為常規方法，所用材料、試劑等均可從化學公司購買。
[0026]實施例1
[0027]—種抗黃海希瓦氏菌卵黃抗體的制備方法，包括以下步驟:
[0028](I)將保藏編號為 CGMCC N0.7303 的黃海希瓦氏菌(Shewanella marisflavi)接種于20ml 2216E液體培養基中，28°C培養12h，復蘇菌體。菌體復蘇后，將100 μ L菌液接種到TSA固體瓊脂培養基，28 °C倒置培養24h，挑取單菌落接種于2216E液體培養基中，在28°C，140rpm的條件下，搖床震蕩培養1h后，調節2216E液體培養基中的黃海希瓦氏菌菌量為3X 109CFU/mL。之后8000r/min，4°C條件下離心5min收集菌體。將收集的菌體用PBS重懸，8000r/min離心5min，棄上清，沉淀再用PBS重懸，這一過程重復三次。然后加入體積分數為0.5%的甲醛，37°C滅活24h，經無菌檢驗合格后，即得到滅活的黃海希瓦氏菌抗原，放4°C冰箱備用；
[0029](2)將步驟(I)中的滅活黃海希瓦氏菌抗原與弗式完全佐劑(初免)或弗式不完全佐劑(二免和三免)等體積混合，并采用雙推法進行乳化制備疫苗，疫苗4°C保存。并用PBS與弗式完全佐劑和弗式不完全佐劑等體積混合乳化制備非特異性疫苗作為對照。
[0030](3)免疫程序:40羽120日齡健康來杭蛋雞隨機分為兩組，一組用黃海希瓦氏菌疫苗免疫，