日本血吸蟲PGMRC2基因的siRNA及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了日本血吸蟲PGMRC2基因的siRNA，該siRNA選自下述的一對或任意兩對以上的組合：SEQ?ID?NO.1和SEQ?ID?NO.2所示的核苷酸序列；SEQ?ID?NO.3和SEQ?ID?NO.4所示的核苷酸序列；SEQ?ID?NO.5和SEQ?ID?NO.6所示的核苷酸序列；SEQ?ID?NO.7和SEQ?ID?NO.8所示的核苷酸序列。本發明還公開了日本血吸蟲PGMRC2基因的siRNA的應用。本發明日本血吸蟲PGMRC2基因的siRNA，可明顯抑制Sj?PGMRC2基因的轉錄，并能獲得24％的減蟲率，適用于制備治療血吸蟲病的藥物。
【專利說明】日本血吸蟲PGMRC2基因的s i RNA及其應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及分子生物學和生物醫藥【技術領域】，尤其涉及一種日本血吸蟲PGMRC2 (膜相關的孕酮受體組件2)基因的siRNA及其應用。
【背景技術】
[0002]日本血吸蟲病是一種重要的人獸共患寄生蟲病。雖然我國在血吸蟲病的防治上已經取得了巨大成就，但是由于中間宿主釘螺難以消滅及血吸蟲重復感染現象嚴重，全面控制血吸蟲病傳播的前景仍不容樂觀。吡喹酮自問世以來，以其高效、低毒、使用方便、價格低廉等優點在血吸蟲病臨床治療和防治工作中得到廣泛應用，并成為目前治療血吸蟲病的唯一藥物，20多年來，未見有新的治療血吸蟲病的藥物出現。然而，近年來在曼氏血吸蟲上已經有了吡喹酮抗性蟲株的報道，耐藥蟲株的出現引起了人們的不安與高度關注。因此，有必要尋找新的治療血吸蟲病的藥物。
[0003]PGMRC2 (膜相關的孕酮受體組件2)以及和其密切相關的PGMRCl屬于膜相關的孕酮受體家族(MAPR)，該天然蛋白首次從豬的肝臟細胞中純化得到，并隨后證實存在于多種真核動物中，包括線蟲、昆蟲、酵母菌和擬南芥等，其氨基酸序列擁有一個信號橫跨膜結構和潛在的細胞色素b5的結合位點。該蛋白對孕酮有高親和力，這種親和力是相對于睪酮或者糖皮質激素的2-10倍，而且還可以結合其他分子例如亞鐵血紅素、膽固醇等。對于PGMRCl功能的研究，有證據表明，其可能參與并調節了大鼠粒層細胞中孕酮介導的抗細胞凋亡的過程并且其可能是哺乳動物精子頂體反應中孕酮感應的中間物。
[0004]RNA干擾(RNAi)技術目前已經在功能基因組學、基因治療、微生物學研究和藥物研發等領域里取得了令人矚目的進展。RNA干擾是一種進化上保守的抵御轉基因或外來病毒侵犯的防御機制，是雙鏈RNA(dsRNA)介導的、序列特異的靶基因轉錄后基因沉默的過程。將與靶基因轉錄的產物mRNA存在同源互補序列的雙鏈RNA導入細胞后，能特異性地降解該mRNA,從而產生相應的功能表型缺失。所謂的小分子干擾RNA (small interferingRNAs, siRNAs)，是能夠以同源互補序列mRNA為靶目標并將其降解而介導RNA干擾途徑的短片段雙鏈RNA分子，通常由20多個核苷酸組成，能進行特異性的轉錄后基因沉默。SiRNA已經廣泛應用于基因表達調控機制研究等領域。
【發明內容】
[0005]本發明要解決的技術問題是提供一種日本血吸蟲PGMRC2基因的siRNA，該siRNA可明顯抑制SjPGMRC2基因的轉錄，可用于制備治療血吸蟲病的藥物。
[0006]此外，還需要提供一種日本血吸蟲PGMRC2基因的siRNA在制備治療血吸蟲病的藥物中的應用。
[0007]為了解決上述技術問題，本發明通過如下技術方案實現:
[0008]在本發明的一個方面，提供了一種日本血吸蟲PGMRC2基因的siRNA，所述siRNA選自下述的一對或任意兩對以上的組合:[0009]SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2所示的核苷酸序列；
[0010]SEQ ID N0.3和SEQ ID N0.4所示的核苷酸序列；
[0011]SEQ ID N0.5和SEQ ID N0.6所示的核苷酸序列；
[0012]SEQ ID N0.7和SEQ ID N0.8所示的核苷酸序列。
[0013]優選的，所述siRNA為SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2所示的核苷酸序列。
[0014]在本發明的另一方面，提供了一種治療血吸蟲病的藥物，所述藥物的活性成分為:通過RNA干擾抑制日本血吸蟲PGMRC2基因表達的siRNA，該siRNA為SEQ ID N0.1和SEQID N0.2所示的核苷酸序列。
[0015]在本發明的另一方面，還提供了一種日本血吸蟲PGMRC2基因的siRNA在制備治療血吸蟲病的藥物中的應用，該siRNA為SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2所示的核苷酸序列。
[0016]在本發明的另一方面，還提供了一種日本血吸蟲PGMRC2基因的siRNA在制備預防血吸蟲病的藥物中的應用，該siRNA為SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2所示的核苷酸序列。
[0017]本發明日本血吸蟲PGMRC2基因的siRNA，可用于干擾日本血吸蟲PGMRC2基因轉錄、表達及血吸蟲的生長發育，小鼠的體內RNA干擾實驗表明，該siRNA能獲得24%的減蟲率，適于制備治療血吸蟲病的藥物。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0018]下面結合附圖和【具體實施方式】對本發明作進一步詳細的說明。
[0019]圖1是本發明實施例1實時定量PCR分析體外干擾效果圖；
[0020]圖2是本發明實施例2實時定量PCR分析體內干擾效果圖；
[0021]圖3是本發明實施例2用Western-blotting分析體內蛋白表達的干擾效果圖。
【具體實施方式】
[0022]下列實施例中，未注明具體條件的實驗方法，通常按常規條件，如《分子克隆實驗指南》(J.薩姆布魯克，D.W.拉塞爾著，黃培堂，汪嘉璽，朱厚礎，等譯.第3版，北京:科學出版社，2002)中所述的方法進行。
[0023]實施例1體外RNA干擾
[0024]1.siRNA分子的設計
[0025]根據日本血吸蟲PGMRC2基因序列(GeneBank:FN317689.1)設計四對siRNA分子(見下表1)，NC-RL siRNA分子為無關對照，siRNA由上海吉瑪制藥技術有限公司設計并合成。
[0026]表1siRNA 序列
[0027]
【權利要求】
1.一種日本血吸蟲PGMRC2基因的siRNA，其特征在于，所述SiRNA選自下述的一對或任意兩對以上的組合: SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2所示的核苷酸序列； SEQ ID N0.3和SEQ ID N0.4所示的核苷酸序列； SEQ ID N0.5和SEQ ID N0.6所示的核苷酸序列； SEQ ID N0.7和SEQ ID N0.8所示的核苷酸序列。
2.根據權利要求1所述日本血吸蟲PGMRC2基因的siRNA，其特征在于，所述siRNA為SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2所示的核苷酸序列。
3.一種治療血吸蟲病的藥物，其特征在于，所述藥物的活性成分為:通過RNA干擾抑制日本血吸蟲PGMRC2基 因表達的siRNA，該siRNA為SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2所示的核苷酸序列。
4.權利要求1所述日本血吸蟲PGMRC2基因的siRNA在制備治療血吸蟲病的藥物中的應用，所述siRNA為SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2所示的核苷酸序列。
5.權利要求1所述日本血吸蟲PGMRC2基因的siRNA在制備預防血吸蟲病的藥物中的應用，所述siRNA為SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2所示的核苷酸序列。
【文檔編號】A61K48/00GK103667286SQ201210343029
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2012年9月14日 優先權日:2012年9月14日
【發明者】傅志強, 吳秀娟, 林矯矯, 洪煬, 石耀軍, 陸珂 申請人:中國農業科學院上海獸醫研究所