專利名稱：：日本血吸蟲重組多表位抗原及其表達、純化方法與應用的制作方法
技術領域：
：本發明涉及生物基因，具體涉及日本血吸蟲重組多表位抗原及其表達、純化方法與在制備日本血吸蟲病免疫預防疫苗和診斷試劑中的應用。
背景技術：
：日本血吸蟲病是一種重要的人獸共患寄生蟲病。由于中間宿主釘螺難以消滅及血吸蟲重復感染現象嚴重，單靠藥物治療不能控制血吸蟲病流行和最終消滅血吸蟲病，因此抗血吸蟲病疫苗研究已經成為血防科研工作的重點之一。至今已有上百個血吸蟲抗原基因被克隆和鑒定，不少于30種血吸蟲基因重組抗原疫苗和核酸疫苗用于動物免疫保護試驗，一些基因工程苗也取得了一定的保護效果。但由于血吸蟲蟲體大，抗原性復雜，單一抗原誘導的保護效果不夠理想。表位(印itope)又稱抗原決定簇，是指決定某抗原物質抗原特異性的化學基團。T細胞和B細胞表面均存在特異性抗原受體，能識別相應的抗原表位，根據表位設計疫苗，包括合成肽疫苗、多價基因工程疫苗及表位核酸疫苗，是疫苗設計的一種新途徑。抗原的加工就是天然蛋白質抗原在細胞內經過蛋白酶水解，轉變成和組織相容性復合物(MHC)分子相結合的肽段的過程，加工后的抗原被轉送至細胞表面以抗原肽—MHC相結合的形式進入三元體被免疫細胞識別，被稱為抗原呈遞。依照抗原加工呈遞原理可以人工預測、篩選抗原表位，而且研究人員已經根據此原理設計了計算機應用程序和數據庫來預測抗原加工呈遞過程并進行抗原表位篩選，構建多表位基因工程抗原疫苗或核酸疫苗，期望其可增強單一抗原的免疫原性，并誘導更高的免疫保護效果。表位是疫苗設計和免疫識別的基礎，因此，加強日本血吸蟲抗原表位研究，利用重組多表位抗原進行聯合免疫或設計含多個表位的基因工程重組抗原疫苗或核酸疫苗，是一條值得探索的提高疫苗保護力的途徑。曰本血吸蟲病診斷方法主要有病原診斷和免疫診斷兩種。牛、羊等大家畜的病原診斷方法目前應用較多的是尼龍篩淘洗集卵結合糞便毛蚴孵化法，該法結果可靠，但檢出率低、花費的時間較長。現有的家畜血吸蟲病血清學診斷方法的應用提高了診斷方法的敏感性，但特異性、重復性等還不夠穩定。應用現代生物技術，尋找更為理想的診斷抗原，對提高血清學診斷方法的敏感性、特異性將有很大的幫助。本發明應用生物信息學方法和基因工程技術研制的重組多價核酸疫苗pCMV-BSjGCP-BSj23、pCMV-BSjGCP-BSj23-BSj28和重組多表位抗原pGEX-BSJGCP-BSj23、pGEX-BSjGCP-BSj23-BSj28在小鼠免疫實驗中獲得了較好的免疫保護效果，重組多表位抗原在牛日本血吸蟲病診斷中具有較高的敏感性和特異性，表明該種多表位重組抗原和核酸疫苗的研制方法及其產物具有較高的應用價值。
發明內容本發明所要解決的技術問題在于研究設計日本血吸蟲重組多表位抗原的表達和純化以及在制備日本血吸蟲病免疫預防疫苗和診斷試劑中的應用。本發明提供了一種日本血吸蟲重組多表位抗原。所述日本血吸蟲重組多表位抗原編碼核苷酸片段具有如下核酸序列和相應的蛋白序列-1)BSjGCP-BSj23核酸序列(見序列表SEQID4)atgcgaattggatatgagggtctaccacgtgatcaatggccaaaagtgattcattggaat60ctacatgcacgtgacggtattatctgggtattagatggtctattgaaatgtccggaaaaa120ctttgcccattacttgctgaagatgttgattattattctagaatgactggtgctctggaa180aatccaaacgaggaaataacggcaaccatggatsagatacaaacgtcattccattgttgt240ggagtcaaaggtccagacgattataaagggaatgtgccagcatcatgtaaagaagggcaa300gaagtttatgttcagggttgtctatctgtctttagtgcattcttgaaacgcaac354BSjGCP-BSj23GlySerMetArg蛋白序列(見序列表SEQlieGlyTyrGluGlyLeuID9)ProArgAspGin1LysVallieLeuAspGluAsn65CysAsp50GluGly35ValHis20Leu5TrpAsnLeuHisLeuLysCysAspTyrTyrGlulieThrCysGlyValSerCysLysPheSerAla115Glu100PheLys85GlyAla70GlySer55ThrPro40ArgAla25Glu10ArgAspGlylieLysLeuCysMetThrGlyMetAspLysProAspAspGinGluValLeuLysArgTyr105LysTyr90ValLeulie75LysAla60GinPro45Leulie30LeuTrp15TrpProValLeuAlaGluAsnProThrSerPheGlyAsnValGinGlyCysLeu110Pro95SerHis80AlaValAsn1202)BSjGCP-BSj23-BSj28核酸序列(見序列表SEQID5)atgcgaattggatatgagggtctaccacgtgatcaatggccaaaagtgattcattggaat60ctacatgcacgtgacggtattatctgggtattagatggtctattgaaatgtccggaaaaa120ctttgcccattacttgctgaagatgttgattattattctagaatgactggtgctctggaa180aatccaaacgaggaaataacggcaaccatggataagatacaaacgtcattccattgttgt240ggagtcaaaggtccagacgattataaagggaatgtgccagcatcatgtaaagaagggcaa300gaagtttatgttcagggttgtctatctgtctttagtgcattcttgaaacgcaacgaattc360犯gccaccag站gaaaaagageiaaatctccaaggagatattgaacggtaaagttcccatt420cttctccaagcaatttgtgaaaccttaaaagagtctacaggtaatctgactgtcgga477BSjGCP-BSj23-BSj28蛋白序歹lj:(見序列表SEQID10)GlySerMetArglieGlyTyrGluGlyLeuProArgAspGinTrpPro151015LysVallieHisTrpAsnLeuHisAlaArgAspGlylielieTrpVal202530LeuAspGlyLeuLeuLysCysProGluLysLeuCysProLeuLeuAla354045GluAspValAspTyrTyrSerArgMetThrGlyAlaLeuGluAsnPro505560AsnGluGlulieThrAlaThrMetAspLyslieGinThrSerPheHis65707580CysCysGlyValLysGlyProAspAspTyrLysGlyAsnValProAla859095SerCysLysGluGlyGinGluValTyrValGinGlyCysLeuSerVal100105110PheSerAlaPheLeuLysArgAsnGluPheLysProProGluGluLys115120125GluLyslieSerLysGlulieLeuAsnGlyLysValProlieLeuLeu130135140GinAlalieCysGluThrLeuLysGluSerThrGlyAsnLeuThrVal145150155160GlyLysLeu。本發明另一目的提供了日本血吸蟲重組多表位抗原的表達和純化方法。本發明應用生物信息學方法預測和篩選了日本血吸蟲抱雌溝蛋白(SjGCP)的抗原表位，應用PCR技術擴增了日本血吸蟲23KDa表膜蛋白(SJ23)，日本血吸蟲谷胱甘肽-S-轉移酶(Sj28GST)和日本血吸蟲抱雌溝蛋白(SjGCP)的各一段富含表位的肽段所對應的編碼核苷酸片段，運用基因工程重組技術將此三種核苷酸片段重組到載體pCMV-script和pGEX-2T中，構建了pCMV-BSjGCP-BSj23、pCMV-BSjGCP-BSj23-BSj28多表位真核表達質粒及pGEX-BSjGCP-BSj23、pGEX-BSjGCP-BSj23-BSj28原核表達質粒。將真核表達質粒pCMV-BSJGCP-BSj23、pCMV-BSjGCP-BSj23-BSj28純化后直接以肌肉注射的方法免疫昆明系小鼠，分別獲得了14.76%、64.95%減蟲率。將重組原核表達質粒pGEX-BSjGCP-BSj23、pGEX-BSjGCP-BSj23-BSj28轉化大腸桿菌BL21后進行了誘導表達并且純化到重組蛋白。本發明提供的日本血吸蟲重組多表位抗原的表達和純化方法包括以下步驟(1)利用生物信息學在線分析程序RANKPEP篩選到日本血吸蟲抱雌溝蛋白SjGCP'的第539590位肽段的表位集中區為BSjGCP表位，截取日本血吸蟲23KD抗原(Sj23)的大親水區(LHD-SJ23)作為表位BSj23，選取和曼氏血吸蟲Sm28KdGST抗原的第115-153氨基酸肽段對應的Sj28GST肽段為BSj28表位，將三種抗原表位重組成BSjGCP-BSj23和BSjGCP-BSj23-BSj28多表位抗原；(2)根據上述表位的核酸序列分別設計PCR引物，并在兩端加上特異限制性內切酶酶切位點，PCR擴增各表位編碼核酸片斷，再利用特異限制性內切酶BamHI、XbaI、EcoRI、HindIII依次將編碼BSjGCP、BSj23、BSj28表位抗原的核酸片段定向克隆至真核表達載體pCMV的多克隆位點區，構建重組真核表達質粒pCMV-BSjGCP-BSj23及pCMV-BSjGCP-BSj23-BSj28,并在大腸桿菌DH5a中大量培養，肌肉注射免疫小鼠。(3)將重組真核表達質粒pCMV-BSjGCP-BSj23及pCMV-BSjGCP-BSj23-BSj28中的編碼BSjGCP-BSj23和BSjGCP-BSj23-BSj28多表位抗原的核酸片段利用特異限制性內切酶BamHI、EcoRI、HindIII定向克隆至原核表達載體pGEX-2T多克隆位點區，構建重組原核表達質粒pGEX-BSjGCP-BSj23及pGEX-BSjGCP-BSj23-BSj28;將上述兩種重組質粒分別轉化大腸桿菌BL21,用IPTG誘導表達，并用親和層析純化GST融合蛋白的方法純化到日本血吸蟲多表位重組蛋白，應用重組蛋白制備成疫苗進行血吸蟲病免疫預防試驗并將重組蛋白作為診斷試劑進行牛血吸蟲病診斷試驗。本發明又一目的提供了日本血吸蟲重組多表位抗原在制備預防日本血吸蟲的免疫預防疫苗和診斷日本血吸蟲的試劑中的應用。經動物試驗結果顯示，本發明提供的多表位核酸疫苗pCMV-BSjGCP-BSj23、pCMV-BSjGCP-BSj23-BSj28在昆明系小鼠中分別獲得了14.76%、64.95%的減蟲率。重組多表位抗原pGEX-BSjGCP-BSj23、pGEX-BSjGCP-BSj23-BSj28免疫BalB/c小鼠獲得了15.7%、57.99%的減蟲率，作為診斷抗原分別獲得了91.0%、89.9%的敏感性和97.8%、93.4%的特異性，可以用于制備診斷血吸蟲的試劑。圖1:重組真核表達質粒pCMV-BSjGCP-BSj23和pCMV-BSjGCP-BSj23-BSj28的構建圖2:重組真核表達質粒的酶切鑒定M:DL2000Marker,1:BamHI和Hindin酶切后空質粒pCMV,2:BamHI和HindIII酶切后的pCMV-BSj23-BSj28，3:BamHI和HindlII酶切后pCMV-BSjGCP-BSj23，4:BamHI和HindIII酶切后pCMV-BSjGCP-BSj23-BSj28圖3:重組原核表達質粒pGEX-BSjGCP-BSj23和pGEX-BSjGCP-BSj23-BSj28的構建圖4:重組質粒pGEX-BSjGCP-BSj23的雙酶切鑒定和PCR鑒定分析1、2、5、6:BamHI和EcoRI雙酶切空載pGEX，M:DNAMarker,3:BamHI和EcoRI雙酶切pGEX-BSjGCP-BSj23，4:pGEX-BSjGCP-BSj23PCR鑒定圖5:重組質粒pGEX-BSjGCP-BSj23-BSj28的雙酶切鑒定1、2、3、4:BamHI和HindIII雙酶切pGEX-BSjGCP-BSj23-BSj28M:DNAmarker圖6:SDS-PAGE分析IPTG誘導pGEX-BSjGCP-BSJ23/BL21的表達1:IPTG誘導了6小時的pGEX/BL21，2:IPTG誘導了6小時的空宿主菌BL21，3-8:分別為誘導了Oh、2h、4h、6h、8h、10h的pGEX-BSjGCP-BSj23/BL21，M:低分子量蛋白標準圖7:融合蛋白pGEX-BSjGCP-BSj23-BSj28時相表達的電泳分析1:IPTG誘導了6小時的空宿主菌BL21;2:IPTG誘導了6小時的pGEX/BL21;3-8:分別為誘導了Oh、2h、4h、6h、8h、10h的pGEX-BSjGCP-BSj23-BSj28/BL21，M:低分子量蛋白標準圖8:SDS-PAGE分析純化的pGEX-BSjGCP-BSj23與pGEX-BSjGCP-BSj23_BSj281:純化的pGEX-BSjGCP-BSj23-BSj28，2:純化的pGEX-BSjGCP-BSj23，M:低分子量蛋白標準實施例l、日本血吸蟲多表位重組核酸疫苗構建與免疫保護實驗1、材料1、1質粒與菌株真核表達載體pCMV-script,大腸桿菌DH5a等購自上海申能博彩生物技術公司。1、2實驗動物雄性昆明系小鼠，體重25g，購自上海實驗動物中心。1、3日本血吸蟲中國大陸株尾蚴中國農科院上海獸醫研究所釘螺室提供。1、5主要試劑氨芐青霉素、卡那霉素、Agarose、Tryptone、酵母提取物、NaCl等購自上海生工生物工程有限公司；DNAMarkerDL2000、dNTPMixture、MgCl2、TaqDNAPloyrose、限制性內切酶EcoRI、HindIII、B柳HI、XbaI、T<DNAligase連接酶等為大連寶生物技術有限公司產品。DNAAgaroseGelPurificationKit純化回收試劑盒、質粒提取試劑盒等購自天為時代生物有限公司。2、方法2、1抗原表位的預測與篩選2、1、1SjGCP表位篩選根據日本血吸蟲SjGCP(GenBankaccessionnumber:AF519183)的編碼基因序列及相應的氨基酸序列，在http:〃bio.dfci.harvard.edu/RANKPEP/網站上分析預測其線性T細胞抗原表位，篩選出的表位所對應的編碼核苷酸序列簡稱為BSjGCP。2、1、2Sj23抗原表位選取日本血吸蟲23KD抗原(Sj23)的大親水區(LHD-SJ23)(簡稱BSj23，其對應的編碼核苷酸序列共192bp)構建重組的多價疫苗，抗原表位預測表明，該肽段含有多個T細胞和B細胞抗原表位。2、1、3Sj28GST表位參照曼氏血吸蟲Sm28KdGST表位分析與鑒定結果選取，Sm28GST抗原的115-131，140-153肽段為其兩個重要的T細胞表位，blast比較發現Sj28GST與Sm28GST的具有很高的同源性，其115-153肽段與曼氏血吸蟲的對應肽段極為相似(相似率為76%)，故本研究中選擇了這一肽段。將所對應的其編碼核苷酸序列簡稱為BSj28(共117bp)。2、2重組真核表達質粒pCMV-BSjGCP-BSj23和pCMV-BSjGCP-BSj23-BSj28的構建根據表位分析篩選結果，確定克隆策略(如圖l所示)，分別設計引物，以日本血吸蟲成蟲cDNA為模板PCR擴增目的片段BSjGCP、BSj23和BSj28，并進行酶切、連接等基因重組，將各表位片段重組到pCMV-script載體中，構建pCMV-BSJGCP-BSj23和pCMV-BSjGCP-BSj23-BSj28重組真核表達質粒。根據日本血吸蟲抱雌溝蛋白(GCP)539590位氨基酸的編碼核苷酸序列設計兩對引物，在BSjGCP的上游引物BSjGCP(叩)5'端加上限制性內切酶BamHI和啟動密碼子ATG,在BSjGCP下游引物BSjGCP(down)5'端加上限制性酶切位點XbaI，具體如下BSjGCP(up)5，-AATAGGATCCATGCGAATTGGATATG-3，，BSjGCP(down)5,-GCGCTCTAGAATAATAATCAACATCTTCAG-3，;根據日本血吸蟲Sj23大親水區編碼核苷酸序列分別設計兩對引物，在LHD-SJ23上游引物BSj23(up)5'端加上限制性酶切位點XbaI，在BSj23下游引物BSj23(down)的5'端加上限制性酶切位點EcoRI，具體如下；BSj23(up)5，-AATA3HA^ATGACTGGTGCTCTGGA-3',BSj23(down)5，-CGCGGAATTCGTTGCGTTTTAAG-3，根據日本血吸蟲Sj28GST的115153區段氨基酸的編碼核苷酸序列分別設計兩對引物，在BSj28上游引物BSj28(叩)5'端加上限制性酶切位點EcoRI，在BSj28下游引物BSj28(down)5'端加上限制性酶切位點HindIII及終止密碼子，具體如下BSj28(up)5，-CGGCGAATTCAAGCCACCAGAAGAA-3，，BSj28(down)5，-ATTAAAGCTTCTATCCGACAGTCAGATTA-3'。所有引物的5'端添上四個保護性堿基，由基康生物公司合成。根據下列PCR反應體系和條件進行PCR。PCR反應體系Template(日本血吸蟲成蟲cDNA)mi,10XPCRBuffer5W，MgCl23W，dNTP(2.5mM)扭l，PCRprimer(20pmol/l4)各0.5l4，TaKaRaTaqpolyrase(5uM)，滅菌去離子水35.5Pl加至總體積50W。PCR擴增條件如下:預變性，94°C5分鐘;按94。C變性45秒，BSjGCP55。C、BSj2353°C、BSj2857t:各復性45秒；72'C延長反應1分，共擴增30個循環，再于72'C延長反應10分鐘,最后將PCR產物保存于4'C，進行瓊脂糖水平電泳觀察PCR產物。按天為時代生物有限公司DNAAgaroseGelPurificationKit純化、回收試劑盒的操作手冊進行PCR產物回收純化。最后將DNA溶解于30WTE或水。利用上述PCR引物兩側和pCMV-script載體中的限制性內切酶位點，用特異限制性內切酶BamHI、XbaI、EcoRI、HindIII將上述表位的DNA片斷依次克隆進pCMV-script載體，構建pCMV-BSjGCP-BSj23-BSj28重組真核表達質粒。首先用BamHI、XbaI將BSjGCP表位DNA片斷和pCMV-script載體酶切，用^DNAligase將兩者重組連接，制備pCMV-BSjGCP重組質粒。然后用XbaI、EcoRI將BSj23表位DNA片斷和pCMV-BSjGCP重組質粒酶切，用T《DNAligase將兩者重組連接，制備pCMV-BSjGCP-BSj23重組質粒。最后用EcoRI、Hind11I將BSj28表位DNA片斷和pCMV-BSjGCP-BSj23重組質粒酶切，用T4DNA1igase將兩者重組連接，制備pCMV-BSjGCP-BSJ23-BSj28重組質粒，轉入大腸桿菌DH5a。最后將重組質粒用酶切鑒定，并將陽性克隆送上海基康生物公司測序。2、3動物免疫保護實驗2、3、1大量制備重組質粒和空載體大量培養含pCMV-BSjGCP-BSj23和pCMV-BSjGCP-BSj23-BSj28重組質粒和空載體pCMV-script的大腸桿菌，按照上海天為時代生物有限公司的質粒抽提試劑盒方法，大量制備重組質粒pCMV-BSjGCP-BSj23、pCMV-BSjGCP-BSj23-BSj28和pCMV-script載體，紫外分光光度計分別測量兩種質粒的A^和A^，并計算出純度和含量，-2(TC保存。2、3、2免疫和攻擊感染30只昆明系小鼠分三個組，每組10只，每只小鼠在后腿肌肉部位分別多點注射pCMV-BSjGCP-BSj23、pCMV-BSjGCP-BSj23-BSj28重組質粒或pCMV-script空載體各50Pg，每隔兩周免疫一次，共免疫三次。第三次免疫后第三周，試驗鼠經腹部皮膚感染日本血吸蟲尾呦(40土1)條。2、3、3計算減蟲率攻擊感染日本血吸蟲尾蚴42天后，剖殺小鼠，沖蟲計數，按照公式減蟲率=(對照組平均檢獲成蟲數-實驗組平均檢獲成蟲數)+對照組平均檢獲成蟲數X100X，計算減蟲率。3、結果3、1抗原表位分析結果3、1、1SjGCP的抗原表位分析結果根據日本血吸蟲SjGCP(GenBankaccessionnumber:AF519183)的編碼基因序列及相應的氨基酸序列，在http:〃bio.dfci.harvard.edu/RANKPEP/網站上分析預測其線性T細胞抗原表位，以不同大小的TAP肽段作為條件選擇參數，分析結果表明在該蛋白的C端集中著對人類HLA-ALL具有較好結合效率的抗原肽。進一步進行MHCI類分子結合的普適性分析和結合特異性分析，結果顯示該蛋白的539548位，578590位的肽段具有較好的參與抗原呈遞的特性，適合作為表位，另外在這兩個肽段之間被篩選出來的肽段也較多，并且分值較高，如553562位的肽段。結果表明在SjGCP的539590位的肽段(其編碼核苷酸序列共156bp)是一個潛在的表位集中區。因此優先選擇了該肽段作為研究的表位之一。具體序列(見序列表SEQID6)如下MRIGYEGLPRDQWPKVIHWNLHARDGIIWVLDGLLKCPEKLCPLLAEDVDYY對應的核苷酸序列(見序列表SEQID1)為acgtgacggtattatctgggtattagatggtctattgaaatgtccggaaaaactttgcccattacttgctgaagatgttgattattat3、1、2BSj23的抗原表位分析及序列截取日本血吸蟲23KD抗原(Sj23)的大親水區(LHD-SJ23)作為BSj23序列(見序列表SEQID7)MTGALENPNEEITATMDKIQTSFHCCGVKGPDDYKG證ASCKEGQEVYVQGCLSVFSAFLKRN對應的核苷酸序列為(見序列表SEQID2)ccattgttgtggagtcaaaggtccagacgattataaagggaatgtgccagcatcatgtaaagaagggcaagaagtttatgttcagggttgtctatctgtctttagtgcattcttgaaacgcaac3、1、3BSj28的抗原表位分析及序列截取和曼氏血吸蟲Sm28KdGST抗原的第115-153氨基酸肽段對應的Sj28GST肽段為BSj28表位序列(見序列表SEQID8):KPPEEKEKISKEILNGKVPILLQAICETLKESTGNLTVG對應的核苷酸序列(見序列表SEQID3)為Aagccaccagaaga朋aagagaaaatctcceiaggagatattgaacggtaaagttcccattcttctccaagcaatttgtgaaaccttaaaagagtctacaggtaatctgactgtcgga3、2多表位重組質粒的構建將BSjGCP和BSj23表位的核苷酸序列用限制性內切酶連接，序列如下(見序列表SEQID4)AAGCTT相應的氨基酸序列為(見序列表SEQID9)ATMDKIQTSFHCCGVKGPDDYKGNVPASCKEGQEVYVQGCLSVFSAFLKRNKL將BSjGCP、BSj23和BSj28表位的核苷酸序列用限制性內切酶連接，序列如下:(見序列表SEQID5)AAGCAATTTGTGAAACCTTAAAAGAGTCTACAGGTAATCTGACTGTCGGAAAGCTT對應的氨基酸序列為(見序列表SEQID10)GSMRIGYEGLPRDQWPKVIHWNLHARDGIIWVLDGLLKCPEKLCPLLAEDVDYYSRMTGALENPNEEITATMDKIQTSFHCCGVKGPDDYKGNVPASCKEGQEVYVQGCLSVFSAFLKRNEFKPPEEKEKISKEILNGKVPILLQAICETLKESTGNLTVGKL三種重組質粒經酶切后，分別出現了約300bp,340bp,500bp左右大小的DNA條帶,表明為正確重組質粒。重組質粒經測序鑒定為重組正確(見圖2)。3、4動物免疫保護實驗結果試驗小鼠于攻擊感染42天后剖殺、沖蟲計數，pCMV空載體對照組平均蟲荷數為17.75，pCMV-BSjGCP-BSj23、pCMV-BSjGCP-BSj23-BSj28試驗組平均蟲荷數分別為15.13、6.25，和對照組相比其減蟲率分別為14.76%、64.95%。其中三價重組質粒試驗組的蟲荷數明顯低于對照組，統計結果顯示差異非常顯著(P<0.01)(見表l)。表l:動物免疫保護實驗結果<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>實施例2、日本血吸蟲多表位重組抗原的表達、純化與免疫預防實驗1、材料1、1質粒與菌株原核表達載體pGEX-2T，大腸桿菌DH5a，BL21等購自上海申能博彩生物技術公司。1、2實驗動物BALB/c系小鼠雄性，6周齡，購自上海實驗動物中心。1、3閂本血吸蟲尾蚴由中國農科院上海家畜寄生蟲病研究所釘螺室提供。1、4酶類及其它相關試劑氨芐青霉素、IPTG、X-gal、谷胱甘肽、尿素等購自上海生工生物工程公司。DNA膠回收試劑盒、質粒提取試劑盒、標準蛋白Marker等購自天為時代生物公司，蛋白重折疊試劑盒購自普飛生物公司。Ta^DNA聚合酶、限制性內切酶EcoRI、Xbal、HindIII、BamHI購自TaKaRa公司。考馬斯亮蘭R250為Fluka進口分裝。氯仿、異丙醇等生化試劑購自中國醫藥集團化學試劑公司。2、方法2、1重組原核表達質粒pGEX-BSjGCP-BSj23和pGEX-BSjGCP-BSj23-BSj28的構建分別以前述BSjGCP(叩)和BSj23(down)或BSjGCP(up)和BSj28(down)為引物，以質粒pCMV-BSjGCP-BSj23-BSj28為模板，應用PCR擴增目的DNA片斷BSjGCP-BSj23和BSjGCP-BSj23-BSj28。(如圖3所示)DNA片斷BSjGCP-BSj23的引物BSjGCP(叩)5'-AATAGGATCCCATGCGAATTGGATATG-3，，BSj23(down)5'-CGCGgMIieGTTGCGTTTTAAG-3，DNA片斷BSjGCP-BSj23-BSj28的引物BSjGCP(up):5'-AATAGGATCCCATGCGAATTGGATATG-3，，BSj28(down):5'-ATTAAAGCTTTCCGACAGTCAGATTA-3，；PCR反應體系同前，94'C預變性5分鐘；按94。C變性45秒，56。C復性45秒，72'C延長反應1分，共擴增30個循環，再于72。C延長反應10分鐘，最后將PCR產物保存于4。C，進行瓊脂糖水平電泳觀察PCR產物。按天為時代生物有限公司DNAAgaroseGelPurificationKit純化回收試劑盒的操作手冊進行PCR產物回收純化。最后將DNA溶解于30riTE或水。用BamHI、EcoRI將表位BSjGCP-BSj23的DNA片斷和pGEX-2T載體酶切，用^DNAligase重組連接，構建pGEX-BSjGCP-BSj23重組質粒。用BamHI、HindIII將表位BSjGCP-BSj23-BSj28的DNA片斷和pGEX-2T載體酶切，用T,DNAligase將兩者重組連接，構建pGEX-BSjGCP-BSj23-BSj28重組組質粒(如圖3所示)，將質粒轉入大腸桿菌DH5a。然后將重組質粒用酶切、PCR鑒定，并將陽性克隆送上海基康生物公司測序。2、2重組多表位質粒pGEX-BSjGCP-BSj23和pGEX-BSjGCP-BSj23-BSj28的誘導表達將陽性重組多表位質粒pGEX-BSjGCP-BSj23、pGEX-BSjGCP-BSj23-BSj28分別轉化BU感受態細胞。將含重組質粒的陽性菌按l.0%接種入一定量的含50^/1111氨卞青霉素的2YT培養液中，37。C劇烈振搖4小時，加入IPTG至終濃度lmmol/ml，37。C誘導表達0、2、4、6、8、IO小時，各取出lml細菌培養物于Eppendorf管；10000rpm離心lmin，去掉LB上清培養液。在離心沉淀的菌體中加入2X上樣緩沖液5(mi，(1朋2050^，在混勻器上超聲裂解后于沸水中煮3到5分鐘后，進行SDS-PAGE電泳，用考馬氏亮藍對SDS-PAGE電泳膠進行染色，室溫搖動染色4小時以上。脫色后，對凝膠進行掃描，分析其分子量和表達狀況。2、3重組多表位抗原pGEX-BSjGCP-BSj23、pGEX-BSjGCP-BSj23-BSj28的純化將前述鑒定的菌株過夜培養，第二天按W的量加入200ml液體LB培養基中擴大培養3h后，加入IPTG誘導6h。4°C,1000r/min離心收集菌體。將收集的菌體在一7(TC冰箱和室溫反復凍融5次。超聲裂解破碎細胞10次(10sec/次)，4°C5000g離心15min，分別取離心后的沉淀和上清樣品，以SDS-PAGE電泳分析重組蛋白的溶解性。根據novagen蛋白重折疊試劑盒預處理包涵體蛋白，進行復性處理，并進一步按Amersham公司提供的GlutathioneS印harose4B親和層析方法進行pGEX-BSjGCP-BSj23、pGEX-BSjGCP-BSj23-BSj28重組蛋白的純化。純化后的重組蛋白用PBS透析去除小分子，經SDA-PAGE分析和蛋白含量測定后，用PBS稀釋至一定濃度，于-2(TC保存備用。2、4動物免疫實驗2、4、1免疫將6—7周齡BALB/c系小鼠分成4組，每組6只。其中三個試驗組分別應用重組多表位抗原pGEX-BSjGCP-BSj23、pGEX-BSjGCP-BSj23-BSj28與福氏佐劑結合進行免疫(每只鼠每次注射抗原50Pg)，每兩周免疫一次，共免疫三次。試驗設兩個對照組分別為空白對照組和佐劑對照組，分別注射福氏佐劑和PBS。2、4、2攻擊感染第三次免疫后二周試驗組及對照組小鼠經腹部皮膚感染日本血吸蟲尾呦40條。感染42天后，剖殺小鼠，沖蟲計數，按照公式減蟲率=(對照組平均檢獲成蟲數_實驗組平均檢獲成蟲數)+對照組平均檢獲成蟲數X100X計算減蟲率。3、結果3、1多表位重組表達質粒構建利用PCR和限制性內切酶位點BamHI、EcoRI、HindIII，將BSjGCP-BSj23、BSjGCP-BSj23-BSj28表位目的核苷酸片段亞克隆入載體pGEX-2T中，PCR、酶切鑒定重組的原核表達質粒均出現了與預期大小一致的DNA片段(見圖4、5)。對陽性克隆的菌落小量液體培養后，將菌液樣本送上海基康生物公司測序，結果證實含多表位的核苷酸序列編碼閱讀框正確。3、2融合蛋白pGEX-BSjGCP-BSj23、pGEX-BSjGCP-BSj23-BSj28誘導表達結果將含重組質粒pGEX-BSjGCP-BSj23、pGEX-BSjGCP-BSj23-BSj28的BL21大腸桿菌于含50Mg/ml氨卞青霉素的2YT培養液中振搖培養，加入IPTG誘導表達O、2、4、6、8、IO小時，分別取細菌培養物進行SDS-PAGE電泳分析。結果表明，禾BpGEX/BL21或BL21空宿主菌相比，pGEX-BSjGCP-BSJ23/BL21經IPTG誘導后不同時相的菌液均有預期大小的特異目的蛋白(約39KDa)條帶出現，在誘導6小時后其表達量達到最高水平(見圖6)。SDS-PAGE電泳分析誘導后pGEX-BSjGCP-BSj23-BSj28/BL21不同時間的菌液樣品表明也有預期大小的目的蛋白(接近45KDa)條帶出現，在誘導6小時后重組蛋白的表達量達到最高水平，8小時j^達量開始下降(見圖7)。3、3融合蛋白純化結果分別大量培養菌株BL21/pGEX-BSjGCP-BSj23、BL21/pGEX-BSjGCP-BSj23-BSj28，IPTG誘導后，離心收集菌體，反復凍融、超聲裂解破碎細菌，SDS-PAGE電泳分析發現pGEX-BSjGCP-BSj23、pGEX-BSjGCP-BSj23-BSj28重組蛋白均以包涵體表達。按novagen蛋白重折疊試劑盒預進行復性處理，并進一步用親和層析方法純化。如圖8所示，經過純化得到了純度較高的重組蛋白。3、4動物免疫實驗結果試驗小鼠于攻擊感染42天后剖殺、沖蟲計數，空白對照組、佐劑對照組、pGEX-BSJGCP-BSj23免疫組、pGEX-BSjGCP-BSj23-BSj28免疫組的平均蟲荷數分別為21.83、19、18.4和9.17，和對照組相比兩個試驗組的減蟲率分別為15.7%(P〉0.05)和57.99%(P<0.01)(見表2)。表2動物免疫保護試驗結果<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>實施例3、重組多表位抗原用于診斷牛血吸蟲病研究試驗1、材料1、1抗原重組多表位抗原pGEX-BSjGCP-BSj23、pGEX-BSjGCP-BSj23-BSj28，根據前述的方法制備。-20°(:保存備用。1、2血清水牛血吸蟲病陽性血清采自云南省日本血吸蟲病疫區放牧水牛。采集前由當地獸醫對目標水牛的糞便根據國標法進行糞便毛蚴孵化法檢査以診斷水牛曰本血吸蟲病，將糞檢陽性水牛的血清作為日本血吸蟲病陽性血清，共有189份，92份陰性血清采自血吸蟲病非疫區河南的健康牛血清，分離血清保存于-20。C備用。取健康水牛血清50份混合后作水牛標準陰性血清。1、3明膠、TMB等購自天為時代生物公司，兔抗牛IgG購自普飛生物公司，其它生化試劑購自中國醫藥集團上海化學試劑公司。'2、方法2、1ELISA法檢測水牛日本血吸蟲病陰、陽性血清分別應用重組多表位抗原pGEX-BSjGCP-BSj23、pGEX-BSjGCP-BSj23-BSj28作為抗原(15Pg/ml)以間接ELISA法檢測水牛血清。主要步驟如下'2、2抗原(15^g/ml)用pH9.6碳酸鹽緩沖液稀釋后包被96孔酶標板，抗原稀釋度按預試驗結果進行，每孔加100ul，4'C過夜。用PBST洗二次，每次5min。2、3用3%明膠37。C封閉3hr，每孔加150y1。結束后用PBST洗三次，每次5min。2、4加l:IOO稀釋的待檢血清，每份血清加二孔，每孔100ul，37。C作用lhr，每次試驗都設標準陰性對照孔。結束后用PBS洗四次，每次5min。2、5加HRP標記的兔抗牛IgG,每孔100ul，37'C作用45min。結束后用PBST洗四次，每次5min。2、6加TMB/檸檬酸緩沖液顯色，每孔75ul，37"C作用10min左右。每孔加20u12M硫酸終止反應。2、7于450nM測0D值，計算平均OD值。2、8結果判斷把待檢血清的平均0D值大于和等于標準陰性血清的平均0D值+2倍標準差的，判斷為陽性，小于的判斷為陰性。3、結果以重組表位抗原pGEX-BSjGCP-BSj23、pGEX-BSjGCP-BSj23-BSj28作為診斷抗原，應用間接ELISA法檢測疫區189份水牛血清和92份健康牛血清，結果pGEX-BSjGCP-BSj23-BSj28三價表位抗原的敏感性和特異性分別為89.9%、93.4%，pGEX-BSjGCP-BSj23二價表位抗原的敏感性和特異性比三價稍高，分別為91.0%、97.8%(見表3)。表3重組表位抗原檢測水牛血吸蟲病結果<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>從以上結果看出，以二價表位重組抗原pGEX-BSjGCP-BSj23作為診斷抗原，獲得的平均OD值、對陽性牛的檢出率和對健康牛的陰性符合率都最高，可以看出pGEX-BSjGCP-BSj23有潛力發展成為一種新的、特異、敏感的血吸蟲病診斷抗原。同時由于基因重組抗原可以大量生產制備，易于產品的標準化和診斷技術的規范化。列及相應的蛋白序列:SEQID1:日本血吸蟲抱雌溝蛋白表位核酸序列atgcgaattggat已tgagggtctaccacgtgatcaatggccaaaagtgattcattggaat60ctacatgcacgtgacggtattatctgggtattagatggtctattgaaatgtccggaaaaa120ctttgcccattacttgctgaagatgttgattattat156SEQID2:日本血吸蟲23KD抗原表位核酸序列atgactggtgctctggaaaatcc犯acgaggaaataacggcaaccatggataagatacaa60acgtcattccattgttgtggagtcaaaggtccagacgattataaagggaatgtgccagca120tcatgtaaagaagggcaagaagtttatgttcagggttgtctatctgtctttagtgcattc180ttgaaacgcaac192SEQID3:日本血吸蟲28KD谷胱苷肽-S-轉移酶抗原表位核酸序列aagccsccagaaga已aaagagaaaatctccaaggagatattgaacggtaaagttcccatt60cttctccaagcaatttgtgaaaccttaaaagagtctax;aggtaatctgactgtcgga117SEQID4:日本血吸蟲抱雌溝蛋白-23KD抗原重組表位核酸序列atgcgaattggatatgagggtctaccacgtgatc犯tggcca犯agtgattcattggaat60ctacatgcacgtgacggtattatctgggtattagatggtctattgaaatgtccgg犯aaa120ctttgcccattacttgctgaagatgttgattattattctagaatgactggtgctctggeia180aatccaaacgaggaaataacggcaaccatggat犯gatacaaacgtcattccattgttgt240ggagtcasaggtccagacgattataaagggaatgtgccagcatcatgtaaag犯gggcaa300gaagtttatgttcagggttgtctatctgtctttagtgcattcttgaaacgcaac354SEQID5:日本血吸蟲抱雌溝蛋白-23KD抗原-28KD谷胱苷肽-S-轉移酶抗原重組表位核酸序列atgcgaattggatatg鄉gtctaccacgtgstc犯tggcC犯肌gtg3ttcattggaat60ctacatgcacgtg3Cggt3ttatctgggtatt3gatggtctattga犯tgtccggaaaaa120ctttgcccattacttgctgaa_gatgttgattattattctagaatgactggtgctctggaa180aatccaaacgagga犯taacggcaaccatggataagatacaaacgtc已ttccattgttgt240ggagtc犯aggtccagacgattataaagggaatgtgccagc已tcatgt已a300ga已gttt3tgttcagggttgtctatctgtctttagtgcattcttgaaacgcaacg33ttc360犯gCC3CC3ggaaaatctcctgaacggtaaagttcccatt420cttctccaagcaatttgtgaaaccttaaaagagtctacaggta已tctgactgtcgg3477SEQID6:日本血吸蟲抱雌溝蛋白表位蛋白序列MetArglieGlyTyrGluGlyLeuProArgAspGinTrpProLysVal151015lieHisTrpAsnLeuHisAlaArgAspGlylielieTrpValLeuAsp202530GlyLeuLeuLysCysProGluLysLeuCysProLeuLeuAlaGluAsp354045ValAspTyrTyr50SEQID7:日本血吸蟲23KD抗原表位蛋白序列MetThrGlyAlaLeuGluAsnProAsnGluGlulieThrAlaThrMet151015AspLyslieGinThrSerPheHisCysCysGlyValLysGlyProAsp202530AspTyrLysGlyAsnValProAlaSerCysLysGluGlyGinGluVal354045TyrValGinGlyCysLeuSerValPheSerAlaPheLeuLysArgAsn505560SEQID8:日本血吸蟲28KD谷胱苷肽-S-轉移酶抗原表位蛋白序列LysProProGluGluLysGluLyslieSerLysGlulieLeuAsnGly1510.15LysValProlieLeuLeuGinAlalieCysGluThrLeuLysGluSer202530ThrGlyAsnLeuThrValGly35SEQIDGlySer1LysValLeuAspGluAsp50AsnGlu65CysCysSerCysPheSer9:日本血吸蟲抱雌溝蛋白MetArglieGlyTyrGlu-23KD抗原重組表位蛋白序列GlyLeuProArgAspGinTrplieHis20GlyLeu35ValAsp5TrpGlyValLysGlu100AlaPhe115Lys85GlyAsnLeuHisLeuLysCysTyrTyrGlulieThrAla70GlySer55ThrPro40ArgLeuLysArgAsn120Ala25GluGinGluValTyr105Lys10ArgProAspAspAspGlylieLysLeuCysMetThrGlyMetAspLysTyr90ValLeulie75LysAla60GinPro45Leulie30Leu15TrpProValLeuAlaGluAsnProThrSerPheGlyAsnValGinGlyCysLeu110Pro95SerHis80AlaValSEQID10:日本血吸蟲抱雌溝蛋白-23KD抗原-28KD谷胱苷肽-S-轉移酶抗原重組表位蛋白序列GlySerMetArglieGlyTyrGluGlyLeuProArgAspGinTrpPro151015LysVallieHisTrpAsnLeuHisAlaArgAspGlylielieTrpVal202530LeuAspGlyLeuLeuLysCysProGluLysLeuCysProLeuLeuAla354045GluAspValAspTyrTyrSerArgMetThrGlyAlaLeuGluAsnPro505560AsnGluGlulieThrAlaThrMetAspLyslieGinThrSerPheHis65707580CysCysGlyValLysGlyProAspAspTyrLysGlyAsnValProAla859095SerCysLysGluGlyGinGluValTyrValGinGlyCysLeuSerVal100105110PheSerAlaPheLeuLysArgAsnGluPheLysProProGluGluLys115120125GluLyslieSerLysGlulieLeuAsnGlyLysValProlieLeuLeu130135140GinAlalieCysGluThrLeuLysGluSerThrGlyAsnLeuThrVal145150155160GlyLysLeu2權利要求1、一種日本血吸蟲重組多表位抗原，其特征在于所述多表位表原為BSjGCP-BSj23，它由日本血吸蟲23KD抗原表位和日本血吸蟲抱雌溝蛋白抗原表位重組組成，具有如下核酸序列和相應的蛋白序列BSjGCP-BSj23核酸序列atgcgaattggatatgagggtctaccacgtgatcaatggccaaaagtgattcattggaat60ctacatgcacgtgacggtattatctgggtattagatggtctattgaaatgtccggaaaaa120ctttgcccattacttgctgaagatgttgattattattctagaatgactggtgctctggaa180aatccaaacgaggaaataacggcaaccatggataagatacaaacgtcattccattgttgt240ggagtcaaaggtccagacgattataaagggaatgtgccagcatcatgtaaagaagggcaa300gaagtttatgttcagggttgtctatctgtctttagtgcattcttgaaacgcaac354BSjGCP-BSj23蛋白序列GlySerMetArgIleGlyTyrGluGlyLeuProArgAspGlnTrpPro151015LysValIleHisTrpAsnLeuHisAlaArgAspGlyIleIleTrpVal202530LeuAspGlyLeuLeuLysCysProGluLysLeuCysProLeuLeuAla354045GluAspValAspTyrTyrSerArgMetThrGlyAlaLeuGluAsnPro505560AsnGluGluIleThrAlaThrMetAspLysIleGlnThrSerPheHis65707580CysCysGlyValLysGlyProAspAspTyrLysGlyAsnValProAla859095SerCysLysGluGlyGlnGluValTyrValGlnGlyCysLeuSerVal100105110PheSerAlaPheLeuLysArgAsnLysLeu115120。2、一種日本血吸蟲重組多表位抗原，其特征在于所述多表位抗原為BSjGCP-BSj23-BSj28，它由日本血吸蟲23KD抗原表位、日本血吸蟲抱雌溝蛋白抗原表位和日本血吸蟲28KD谷胱甘肽-S-轉移酶抗原表位重組組成，具有如下核酸序列和相應的蛋白序列BSjGCP-BSj23-BSj28核酸序列atgcgaattggatatgagggtctaccacgtgatcaatggccaaaagtgattcattggaat60ctacatgcacgtgacggtattatctgggtattagatggtctattgaaatgtccggaaaaa120ctttgcccattacttgctgaagatgttgattattattctagaatgactggtgctctggaa180aatccaaacgaggaaataacggcaaccatggataagatacaaacgtcattccattgttgt240ggagtcaaaggtccagacgattataaagggaatgtgccagcatcatgtaaagaagggcaa300gaagtttatgttcagggttgtctatctgtctttagtgcattcttgaaacgcaacgaattc360aagccaccagaagaaaaagagaaaatctccaaggagatattgaacggtaaagttcccatt420cttctccaagcaatttgtgaaaccttaaaagagtctacaggtaatctgactgtcgga477BSjGCP-BSj23-BSj28蛋白序列GlySerMetArglieGlyTyrGluGlyLeuProArgAspGinTrpProLysVallieHisTrpAsnLeuHisAlaArgAspGlylielieTrpValLeuAspGlyLeuLeuLysCysProGluLysLeuCysProLeuLeuAlaGluAspValAspTyrTyrSerArgMetThrGlyAlaLeuGluAsnProAsnGluGlulieThrAlaThrMetAspLyslieGinThrSerPheHisCysCysGlyValLysGlyProAspAspTyrLysGlyAsnValProAlaSerCysLysGluGlyGinGluValTyrValGinGlyCysLeuSerVal(100105110PheSerAlaPheLeuLysArgAsnGluPheLysProProGluGluLys(115120125GluLyslieSerLysGlulieLeuAsnGlyLysValProlieLeuLeu(130135140GinAlalieCysGluThrLeuLysGluSerThrGlyAsnLeuThrVal145150155160GlyLysLeu。3、一種權利要求1或2所述日本血吸蟲重組多表位抗原的表達、純化方法，其特征在于該方法包括下列步驟(1)利用生物信息學在線分析程序RANKPEP篩選到日本血吸蟲抱雌溝蛋白SjGCP的第539590位肽段的表位集中區為BSjGCP表位，截取日本血吸蟲23KD抗原SJ23的大親水區LHD-SJ23作為表位BSj23,選取和曼氏血吸蟲Sm28KdGST抗原的第115-153氨基酸肽段對應的Sj28GST肽段為BSj28表位，將三種抗原表位重組成BSjGCP-BSj23或BSjGCP-BSj23-BSj28多表位抗原；(2)根據上述表位的核酸序列分別設計PCR引物，并在兩端加上特異限制性內切酶酶切位點，PCR擴增各表位編碼核酸片斷，再利用特異限制性內切酶BamHI、XbaI、EcoRI、HindIII依次將編碼BSjGCP、BSj23、BSj28表位抗原的核酸片段定向克隆至真核表達載體pCMV的多克隆位點區，構建重組真核表達質粒pCMV-BSjGCP-BSj23或pCMV-BSjGCP-BSj23-BSj28;(3)將重組真核表達質粒pCMV-BSjGCP-BSj23及pCMV-BSjGCP-BSj23-BSj28中的編碼BSjGCP-BSj23和BSjGCP-BSj23-BSj28多表位抗原的核酸片段利用特異限制性內切酶BamHI、EcoRI、HindIII定向克隆至原核表達載體pGEX-2T多克隆位點區，構建重組原核表達質粒pGEX-BSjGCP-BSj23或pGEX-BSjGCP-BSj23-BSj28;將上述兩種重組質粒分別轉化大腸桿菌BL21，用IPTG誘導表達，并用親和層析純化GST融合蛋白的方法純化到日本血吸蟲多表位重組蛋白pGEX-BSjGCP-BSj23或pGEX-BSjGCP-BSj23-BSj28。4、一種如權利要求1或2所述的日本血吸蟲重組多表位抗原在制備日本血吸蟲病免疫預防疫苗中的應用。5、根據權利要求4所述的應用，其特征在于所述制備免疫預防疫苗時，使用的重組蛋白是帶有GST標簽的融合蛋白。6、根據權利要求4所述的應用，其特征在于所述制備的免疫預防疫苗為日本血吸蟲重組多表位抗原的DNA疫苗。7、根據權利要求6所述的應用，其特征在于制備所述免疫預防疫苗時，使用的宿主菌為大腸桿菌DH5a，真核表達質粒為pCMV-script。8、一種如權利要求1或2所述的日本血吸蟲重組多表位抗原在制備診斷日本血吸蟲病的試劑中的應用。9、根據權利要求8所述的應用，其特征在于制備所述診斷試劑時，使用的重組蛋白為帶有GST標簽的融合蛋白。全文摘要本發明公開了日本血吸蟲重組多表位抗原BSjGCP-BSj23和BSjGCP-BSj23-BSj28的基因序列和表達、純化方法及在制備日本血吸蟲病免疫預防疫苗和診斷試劑中的應用。重組多表位核酸疫苗pCMV-BSjGCP-BSj23和pCMV-BSjGCP-BSj23-BSj28在昆明系小鼠中分別獲得了14.76％、64.95％的減蟲率。重組多表位抗原pGEX-BSjGCP-BSj23和pGEX-BSjGCP-BSj23-BSj28免疫BalB/c小鼠獲得了15.7％、57.99％的減蟲率，作為診斷抗原分別獲得了91.0％、89.9％的敏感性和97.8％、93.4％的特異性。文檔編號C07K14/435GK101624422SQ20081004038公開日2010年1月13日申請日期2008年7月9日優先權日2008年7月9日發明者傅志強,劉金明,周偉芳,朱傳剛,浩李,林矯矯,石耀軍,章登吉,珂陸申請人:中國農業科學院上海獸醫研究所