一種木蹄復方提取物及其制備方法與用途

一種木蹄復方提取物及其制備方法與用途
【專利摘要】本發明涉及生物醫藥【技術領域】。具體的說，本發明涉及一種木蹄復方提取物及其制備方法和用途。木蹄復方按重量比組成為：木蹄層孔菌(1～10)∶松針層孔菌(1～9)∶赤芝(1)，復方提取物的提取方法為：配制好的術蹄復方，混合之后粉碎，加純水，水提醇沉后取上清液，減壓濃縮，濃縮液真空干燥，即得。本發明中木蹄復方提取物中三萜和三萜皂苷的含量不低于5.5％。該提取物具不僅具有有顯著的體外和體內抗腫瘤功效，而且沒有明顯急性毒性，小鼠的最大耐受量為0.2g(折合生藥量為4.58g)，為人口服用量的327倍。該提取物與藥學上可接受的載體混合，可制成復方制劑，其中復方制劑包括口服液、注射液、混懸劑、丸劑、片劑、膠囊、散劑、顆粒劑或滴丸劑。
【專利說明】一種木蹄復方提取物及其制備方法與用途 1【技術領域】
[0001] 本發明涉及生物醫藥【技術領域】。具體的說，本發明涉及一種木蹄復方提取物及其 制備方法，該復方提取物主要用于體外和體內抑制腫瘤細胞生長。 2【背景技術】
[0002] 近年來，我國腫瘤發病率處于快速上升期，每年癌癥發病人數約260萬，死亡180 萬，已成為中國城市和農村居民第一死因。由于腫瘤手術切除、化療和放療都存在固有缺 陷，天然藥物或中藥抗腫瘤研究被日益重視。藥用真菌是天然藥物中的一個重要組成部分， 而抗腫瘤作用是藥用真菌重要的功效之一。
[0003] 其中，木蹄層孔菌Fomes fomentarius(L. :Fr)Kick.又名樺菌芝，是多孔菌科、層 孔菌屬的藥用真菌。《中華本草》中記載：木蹄層孔菌子實體無柄。菌蓋馬蹄形，長徑3-40cm， 短徑2-27cm，厚2-18cm。表面有厚角質皮殼，灰色、淺褐色或黑色，光滑，有明顯的同心環棱 紋。管口面淺褐色或灰色，管口圓形，每1mm間3-4個。縱剖面可見菌管多層，每層厚5-25mm。 木栓質。氣微，味淡。其藥理作用主要是：顯著提高實驗小鼠減壓缺氧的耐受能力，延長其 存活時間，具有抗疲勞、抗高溫的作用。并且能影響缺氧機體腸系膜微循環的流速、流態，對 微循環具有改善作用。主治：消積；化瘀；抗癌（食管癌；胃癌和子宮癌）。通過小鼠實驗已 證明：木蹄層孔菌中分離出的單寧類酚性物對小鼠移植性腫瘤S180有明顯殺滅作用，而張 麗萍等深入研究發現木蹄層孔菌多糖對S180腫瘤細胞并無直接殺傷作用，而是通過激活 動物機體的免疫功能，激活巨噬細胞、自然殺傷細胞、殺傷性T細胞的活性，從而增強對腫 瘤免疫功能。
[0004] 松針層孔菌Phellinus pini.又名松針靈芝、松木層孔菌，為多孔菌科、層孔菌屬 藥用真菌。《中國大型真菌原色圖鑒》記載：其子實體多年生，木栓質，無輛，菌蓋扁米球形 至馬蹄形，4-14厘米7X24厘米，罕達23厘米X40厘米，厚2. 5-18. 5厘米或更大。蓋面初 期有紅褐色膠狀皮殼，漸角質化而成灰色至黑色，并有寬的棱帶，邊緣往鈍，初期近白色，后 漸變淡黃色至赤粟色，下側無子實層。菌肉近白色至淡黃褐色，有環紋，木栓質至木質。厚 0.5-2厘米，味苦。菌管多層，每層厚3-5毫米，淡黃色，管口白色至乳白色。孢子卵圓形或 橢圓形，無色。生于松、云杉、冷杉、鐵杉及落葉松等針葉樹的樹干或朽木上。偶爾也生于闊 葉樹的枯腐木上。王穩航、劉安軍等對松針層孔菌的藥理作用進行了比較系統的研究，結果 顯示：松針靈芝的三種多糖均不同程度地提高了小鼠血清、心、肝、腦、脾中SOD、GSH-Px活 力，降低了 MDA生成量，而對T0AC值影響較小；同時，三利多糖均顯著提高了小鼠體內血清 N0生成量。同時，他們提出三種多糖的抗氧化機制可能與其它抗氧化劑不同，其對小鼠體內 氧化壓力和抗氧水平呈雙重增加效果，可能是由于多糖作為免疫物質引起機體的免疫反 應造成的。松針層孔菌是針葉林里紅野生松、落葉松、云杉最主要的、危害最大的火立木腐 朽菌，對于針葉林無疑是一種癌，但是對于人類卻是抑制腫瘤、治療癌癥的一劑良藥。《中國 大型真菌原色圖鑒》73頁中記載：松針子實體含齒孔酸等活性物質，是所有真菌中治療癌癥 效果最好的品種，子實體提取物對小白鼠肉瘤180及艾氏腹水癌的抑制率均達100 %。然 而，松針具有毒性，為達到中醫理論中扶正祛邪的目的，所以松針必須要與其他中藥配合才 可解除毒性，安全使用。目前采用松針層孔菌為主要成份治療各類癌癥的有效配方的機構， 國內外僅有兩家，一家是美國的CELG，另一家用國內的漢草薈。
[0005] 赤芝Ganoderma lucidum(Leyss. ex Fr)Karst為多孔菌科、靈芝屬藥用真菌。據 《中國藥典》記載：赤芝外形呈傘狀，菌蓋腎形、半圓形或近圓形，直徑10?18cm，厚1? 2cm。皮殼堅硬，黃褐色至紅褐色，有光澤，具環狀棱紋和輻射狀皺紋，邊緣薄而平截，常稍內 卷。菌肉白色至淡棕色。菌柄圓柱形，側生，少偏生，長7?15cm，直徑1?3. 5cm，紅褐色 至紫褐色，光亮。孢子細小，黃褐色。氣微香，味苦澀。其主要功效為：補氣安神，止咳平喘。 用于眩暈不眠，心悸氣短，虛勞咳喘。此外，赤芝抗腫瘤功效已被廣泛報道，其抗腫瘤機制也 已被深入研究，主要包括：1.促凋亡：通過促進Bax表達，同時抑制Bcl-2和Bcl-xl等基因 表達，從而抑制淋巴瘤、炎性乳腺癌等生長，促使其凋亡；2.生長抑制：通過抑制周期蛋白 cyclinDl，抑制卵巢癌細胞生長；3.提高免疫：靈芝多糖和三萜類物質能廣泛調節免疫細 胞和免疫相關細胞的功能，包括B細胞、T細胞、NK細胞、樹突狀細胞、巨噬細胞等，同時它們 還時以促進TNF-α表達，降低IL-10, TGF-β 1和VEGF表達，增強免疫應答強度。
[0006] 目前，中藥、天然藥物復方已經成為治病用藥的最主要形式之一，把不同藥理機制 的真菌組成復方更有利于抗腫瘤治療。本研究首次提出木蹄層孔菌、松針層孔菌和赤芝三 者結合，以達到扶正氣，提高腫瘤免疫、腫瘤殺傷的作用。 3
【發明內容】

[0007] 本發明目的在于提供一種高效低毒的木蹄復方提取物及制備方法。
[0008] 本發明的另一目的在于提供該提取物在體內和體外抗腫瘤中的用途。該提取物能 在體外顯著殺傷腫瘤細胞，并有效抑制小鼠體內腫瘤生長；并且小鼠口服和腹腔注射均沒 有發現明顯毒性，最大耐受劑量為l〇g/kg。
[0009] 本發明涉及一利有顯著抗腫瘤功效的、低毒性的木蹄復方提取物及制備方法。
[0010] 本發明木蹄復方中，木蹄層孔菌：松針層孔菌：赤芝的重量比為1?10 : 1? 9:1。
[0011] 優選地，本發明木蹄復方中，木蹄層孔菌：松針層孔菌：赤芝的重量比為2? 7 : 1 ?6 : 1。
[0012] 更優選地，本發明木蹄復方中，木蹄層孔菌：松針層孔菌：赤芝的重量比為4? 5 : 1 ?3 : 1。
[0013] 本發明制備木蹄復方提取物方法步驟如下：
[0014] 步驟一：木蹄層孔菌、松針層孔菌和赤芝按照重量比要求配成木蹄復方，混合之后 粉碎；
[0015] 步驟二：粉碎之后的木蹄復方加純水，l〇〇°C加熱回流提取3次，每次2小時，料液 比分別為1 : 20、1 : 15和1 : 10,4°C靜置24小時后，gOOOr.mirT1離心30分鐘，上清液 減壓濃縮20倍體積。之后，濃縮液再加95%乙醇，使乙醇終濃度為80%，在4°C靜置24小 時后，9000r · mirT1離心30分鐘，取上清液，減壓濃縮20倍體積，濃縮液真空干燥，即得。
[0016] 本發明制備的木蹄復方提取物，其成分分析結果顯示其含有機酸，氨基酸、多肽和 蛋白質，糖、多糖和苷類，皂苷，內酯、香豆素及其苷類，植物留醇和三萜成分以及揮發油和 油脂等多種成分，其中三萜類和三萜皂苷的含量不低于5. 5%。
[0017] 本發明制備的木蹄復方提取物，其用途在于：⑴該提取物在體外對人肺腺癌 細胞（A549)、人宮頸癌細胞（Hela)、人肝癌細胞（QGY)、人前列腺癌細胞（DU145)、人結 腸癌細胞（HCT116)、人食管癌細胞（Ecal09)、人乳腺癌細胞（MDA-MB-435S)、人胃癌細胞 (SGC-7901)、人成骨肉瘤細胞（Saos-2)、人骨肉瘤細胞（U20s)等腫瘤細胞株有顯著殺傷作 用。（2)該提取物能有效誘導細胞凋亡，終濃度為100 μ g/ml作用24h后，A549的凋亡率為 14.8%。（3)該提取物在體內對小鼠肉瘤S180和Lewis肺癌移植瘤模型腫瘤有顯著的抑制 作用，在給藥劑量為150mg/kg時對S180肉瘤的抑瘤率為57. 7% ;在給藥劑量為100mg/kg 時對Lewis肺癌的抑瘤率為56. 5%。（4)該提取物能有效提高荷瘤小鼠免疫功能，能使荷 瘤小鼠的胸腺指數和外周血TNF-a含量提高。
[0018] 本發明制備的木蹄復方提取物與藥學上可接受的載體混合，可制成復方制劑，其 中復方制劑包括口服液、注射液、混懸劑、丸劑、片劑、膠囊、散劑、顆粒劑或滴丸劑。
[0019] 本發明與已有技術相比，具有如下顯著特征：
[0020] (1)提供一種新的抗腫瘤的木蹄復方：木蹄層孔菌抗腫瘤的作用機理在于其毒性 作用，作為復方中君藥，而松針層孔菌也有顯著抗腫瘤作用，作為臣藥，而赤芝有提高機體 免疫力的功效，與前兩者配伍使用，有很好扶正祛邪的作用。
[0021] ⑵提供一種新的抗腫瘤木蹄復方提取物，該提取物的提取方法為：水提醇沉，然 后離心取上清液，濃縮，干燥，即得。
[0022] (3)該提取物成分分析結果顯示其含有機酸，氨基酸、多肽和蛋白質，糖、多糖和苷 類，皂苷，內酯、香豆素及其苷類，植物留醇和三萜成分以及揮發油和油脂等多種成分，其中 三廠類和三廠阜苷的含量不低于5. 5%。
[0023] (4)該提取物具有明顯體內、體外抑制腫瘤細胞生長的作用；能提高荷瘤小鼠免 疫功能，能使荷瘤小鼠的胸腺指數和外周血TNF-a含量提高；且該提取物小鼠口服和腹腔 注射沒有明顯毒性，最大耐受劑量為l〇g/kg。
[0024] (5)該提取物易溶于水，水溶液顏色為棕色。
[0025] (6)該提取物與藥學上可接受的載體混合，可制成復方制劑 4【專利附圖】

【附圖說明】
[0026] 圖1木蹄復方提取物對A549細胞凋亡的影響 5【具體實施方式】
[0027] 以下結合具體實施例，進一步闡明本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明 而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條 件。
[0028] 實施例1木蹄復方提取物的制備
[0029] 木蹄層孔菌60g、松針層孔菌30g和赤芝15g，粉碎，加水，100°C加熱回流提取3 次，每次2h，料液比分別為1 : 20、1 : 15和1 : 10,過濾，合并濾液，4°C靜置24h，9000r/ min離心30min，上消液減壓濃縮20倍體積，濃縮液加95%乙醇，使乙醇終濃度為80%，4°C 靜置24h，9000r/min離心30min，上清液減壓濃縮20倍體積，濃縮液真空干燥，即得。
[0030] 實施例2木蹄復方提取物的制備
[0031] 木蹄層孔菌70g、松針層孔菌20g和赤芝15g，粉碎，加水，KKTC加熱回流提取3 次，每次2h，料液比分別為1 : 20、1 : 15和1 : 10,過濾，合并濾液，4°C靜置24h，9000r/ min離心30min，上清液減壓濃縮20倍體積，濃縮液加95%乙醇，使乙醇終濃度為80%，4°C 靜置24h，9000r/min離心30min，上清液減壓濃縮20倍體積，濃縮液真空干燥，即得。
[0032] 實施例3木蹄復方提取物成分分析
[0033] (1)組分分析
[0034] 把木蹄復方提取物溶于80%乙醇溶液，即得供試液，然后采用系統預試法對其進 行鑒別。①試管預試法向盛有供試液的試管中加入相關試劑，根據顏色、沉淀、熒光等反應 現象判斷某化學成分的存在。②圓形濾紙層法用毛細點樣管吸取供試液在圓形濾紙上點 樣，待干后使乙醇從中心展開，噴以不同顯色劑，根據出現的顏色、斑點或產生的熒光等現 象判斷某化學成分的存在。結果如表1所示，可知其含有有機酸，糖、多糖和苷類，皂苷，內 酯、香豆素及其苷類，植物留醇、三萜成分以及揮發油和油脂。可能含有生物堿，氨基酸、多 肽和蛋白質，黃銅及其苷類以及蒽醌及其苷類。
[0035] 表1木蹄復方提取物化學成分
[0036]
【權利要求】
1. 木蹄復方提取物，其特征在于三萜類和三萜皂苷的含量不低于5. 5%。
2. 權利要求1所述木蹄復方提取物的制備方法，其特征在于：包括以下步驟， 步驟一：將木蹄復方粉碎； 步驟二：粉碎之后的木蹄復方加水，加熱回流提取，低溫靜置后，離心，上清液減壓濃 縮。之后，濃縮液再加乙醇，使乙醇終濃度為80%，在低溫靜置后，離心，取上清液，再次減壓 濃縮，濃縮液真空干燥，即得。
3. 權利要求1中所述木蹄復方提取物的用途，其特征為：（(1)該提取物在體外對人肺 腺癌細胞（A549)、人宮頸癌細胞（Hela)、人肝癌細胞（QGY)、人前列腺癌細胞（DU145)、人 結腸癌細胞（HCT116)、人食管癌細胞（Ecal09)、人乳腺癌細胞（MDA-MB-435S)、人胃癌細胞 (SGC-7901)、人成骨肉瘤細胞（Saos-2)、人骨肉瘤細胞（U20s)等腫瘤細胞株有顯著殺傷作 用。（2)該提取物能有效誘導包括A549在內的腫瘤細胞凋亡。（3)該提取物在體內對小鼠 肉瘤S180和Lewis肺癌移植瘤模型腫瘤有顯著的抑制作用。（4)該提取物能有效提高荷瘤 小鼠免疫功能，能使荷瘤小鼠的胸腺指數和外周血TNF-a含量提高。
4. 根據權利要求2所述木蹄復方，其特征在于：木蹄層孔菌：松針層孔菌：赤芝的重 量比為1?10 : 1?9 : 1。
5. 權利要求2中所述木蹄復方提取物與藥學上可接受的載體混合，可制成復方制劑。
6. 權利要求5中所述復方制劑包括口服液、注射液、混懸劑、丸劑、片劑、膠囊、散劑、顆 粒劑或滴丸劑。
【文檔編號】A61K36/074GK104055803SQ201210355671
【公開日】2014年9月24日 申請日期:2012年9月19日 優先權日:2012年9月19日
【發明者】劉瓊, 沈先榮, 何穎, 蔣定文, 劉玉明, 侯登勇, 陳偉, 王慶蓉, 錢甜甜, 莫琳芳 申請人:中國人民解放軍海軍醫學研究所