專利名稱：促血管生成素1基因修飾的間充質干細胞、及其構建方法與應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物醫學技術領域，尤其涉及一種促血管生成素I基因修飾的間充質干細胞、及其構建方法與應用。
背景技術：
急性肺損傷(ALI)和急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)是臨床常見的高發病率、高病死率的疾患，目前全球發病率在8-20人/10萬人/年。骨髓源性間充質干細胞在肺損傷和炎癥修復中發揮重要作用，是肺損傷修復的重要潛在途徑。但是間充質干細胞修復肺損傷的研究揭示一些問題，如外源性干細胞到達肺部的細胞數稀少、修復水平低，無法達到預期的效果。有研究者采用突光蛋白示蹤間充質干細胞(mesenchymal stem cells,MSCs)的研究指出，除去自發熒光、死亡細胞和受污染的血細胞后，甚至檢測不到骨髓干細胞在肺內對上 皮細胞的有效重建與修復。由此可見，增加MSCs在肺內的駐留及有效修復可能是提高干預效率的關鍵。前期研究證實促血管生成素I (angiopoietin I,Angl)在肺損傷及許多疾病中起重要作用。Angl通過激活血管內皮細胞上酪氨酸激酶型受體Tie2 (tyrosine kinase withIg and EGF homology domains)受體發揮強大作用。多項研究證實Angl穩定內皮細胞的特異性結構一細胞間粘附連接復合體(adherens junction complexes,AJCs),抑制炎癥因子所致的內皮細胞滲透性增加、減少中性粒細胞粘附于內皮細胞、降低IL-8的分泌，減輕炎癥反應及肺損傷。但如何將Angl回輸肺內并使其發揮生物活性，目前并無較好的方法。研究表明Tie2受體表達在血管內皮上，且以肺內血管的Tie2表達最為豐富。通過Angl-Tie2間的受體配體結合力(范德華力)，Angl可最大限度地在肺內龐大的血管網內駐留。綜上所述，本領域有必要進一步開發一種方法，使Angl在MSCs上過表達，從而修飾過的MSCs在經過肺血管網時，高效滯留在肺部，并在此微環境中通過細胞及體液方式修復肺損傷。
發明內容
本發明的目的是提供一種促血管生成素I基因修飾的間充質干細胞。本發明所提供的促血管生成素I基因修飾的間充質干細胞，是攜帶有促血管生成素I基因的間充質干細胞。所述促血管生成素I基因來源于pCR2. I-Angl質粒，所述間充質干細胞來源于哺乳動物，如小鼠、大鼠、兔子、羊、狗、豬、猴或人等。本發明的第二個目的是提供一種構建上述促血管生成素I基因修飾的間充質干細胞的方法。本發明所提供的上述促血管生成素I基因修飾的間充質干細胞的構建方法，可以包括以下步驟
1)將促血管生成素I基因導入慢病毒包裝系統中的目的基因轉移載體中，得到攜帶有促血管生成素I基因的重組慢病毒載體；
2)將攜帶有促血管生成素I基因的重組慢病毒載體與慢病毒包裝系統中的包裝質粒和包膜質粒按16-24:5. 7-11. 7:5. 5-10. 5的重量份數比混合，轉染慢病毒包裝細胞，得到攜帶有促血管生成素I基因的重組慢病毒；
3)將攜帶有促血管生成素I基因的重組慢病毒轉染間充質干細胞，得到過表達促血管生成素I的促血管生成素I基因修飾的間充質干細胞。在上述步驟中，所述步驟I中優選地，所述促血管生成素I基因來源于pCR2. I-Angl質粒；獲得Angl基因的方法可以為從pCR2. I-Angl質粒中調取Angl基因，在克隆引物的引導下PCR擴增Angl基因，然后使用重組酶將PCR產物與經BamHI內切酶酶切后的Age I酶切載體連接，對重組后的Age I酶切載體進行酶切鑒定，瓊脂糖電泳檢測和 基因測序，檢測PCR擴增是否獲得了序列正確的Angl基因。在上述步驟中，所述步驟I中優選地，間充質干細胞來源于哺乳動物，如小鼠、大鼠、兔子、羊、狗、豬、猴或人等。慢病毒包裝系統中的目的基因轉移載體優選為PLV質粒，pLV質粒可以表達綠色熒光蛋白(GFP)，pLV質粒中含有Ubiqutin啟動子，能夠在宿主細胞中持續表達GFP。所述步驟2中，包裝質粒可以為pCMV-dR8. 74質粒，pCMV_dR8. 74質粒中含有HIV病毒的編碼病毒主要的結構蛋白的gag基因，編碼病毒特異性的酶的pol基因，和編碼調節gag和pol基因表達的調節因子rev基因；包膜質粒可以為pMD2G，pMD2G質粒中含有單純皰疹病毒來源的VSVg基因，提供病毒包裝所需要的衣殼蛋白；慢病毒包裝細胞可以為293T細胞。攜帶有促血管生成素I基因的重組慢病毒載體與慢病毒載體體系中的包裝質粒和包膜質粒混合后，可以通過磷酸鈣法EAE-葡聚糖法或人工脂質體法等方法轉染慢病毒包裝細胞，得到攜帶有促血管生成素I基因的重組慢病毒。本發明的另一個目的是提供促血管生成素I基因修飾的間充質干細胞在制備修復肺損傷藥物或材料中的應用。本發明提供了一種促血管生成素I基因修飾的間充質干細胞。可利用慢病毒包裝系統將促血管生成素I基因導入間充質干細胞，從而得到本發明過表達促血管生成素I的促血管生成素I基因修飾的間充質干細胞。實驗證明，本發明的促血管生成素I基因修飾的間充質干細胞經靜脈回輸后，促血管生成素I能在肺組織內過表達，明顯改善肺部病理損傷、炎癥反應與肺水腫，效果明顯且持久。本發明促血管生成素I基因修飾的間充質干細胞及其構建方法將為肺損傷的修復提供適宜的微環境，應用前景廣闊。下面結合附圖和具體實施例對本發明進行詳細的介紹和描述，以更好的理解本發明，在下文中促血管生成素I基因修飾的間充質干細胞簡稱為MSCs-Angl。
圖I為重組Age I酶切載體基因測序結果；
圖2為包裝病毒的病毒滴定的檢測結果，EGFP為熒光顯微鏡檢測綠色熒光結果，DIC為光鏡檢測結果；
圖3為小鼠MSCs經標準流程誘導多向分化鑒定結果a為分化前，b為成骨分化，c為成脂分化，d為成軟骨分化；
圖4為轉染指數M0I=20，轉染第5天時，倒置熒光顯微鏡下MSCs-Angl表達的GFP熒光強度鑒定結果a為光鏡圖片，b為熒光倒置顯微鏡圖片，c為a和b的重疊 圖5為MSCs-Angl表達的Angl蛋白SDS-PAGE電泳檢測結果，其中，條帶(Iane)I轉染前，條帶2為轉染3天后，條帶3為轉染5天后；
圖6為MSCs-Angl特異性表型的流式細胞術檢測結果；
圖7為MSCs-Angl靜脈回輸后Angl在肺組織內過表達檢測結果,其中，a為Angl蛋白電泳檢測圖，b為檢測結果曲線圖；· 圖8為MSCs-Angl靜脈回輸后GFP在肺組織受損處表達檢測結果；
圖9為光學顯微鏡下肺部病理，MSCs-Angl靜脈回輸明顯改善內毒素所致的肺損傷；
圖10為MSCs-Angl靜脈回輸后肺泡灌洗液中蛋白含量、中性粒細胞數量和肺組織髓過氧化物酶(MPO)活性檢測結果。
具體實施例方式一、構建促血管生成素I基因修飾的間充質干細胞 I)表達Angl基因的慢病毒載體質粒的構建
I.I.提取Angl基因 克隆引物為
ANGIF - CTTTTTTGTTAGACAGGATCCGAGTGTGCTGGCAGTACAATGAC AGTTTTCCANGIR — CTCACCATGGTGGCGACCGGTggAAAATCTAAAGGTCGAATCAT CANGl-seq TCGTCGTGTCGTGACGTC + ANGIR
從pCR2. I-Angl質粒中調取Angl基因，在克隆引物的引導下PCR擴增Angl基因，對PCR擴增產物進行瓊脂糖電泳檢測，結果獲得大小為1556bp的DNA片段，與預期結果相符。回收并純化該PCR產物，然后使用重組酶將PCR產物與經BamHI內切酶酶切后的Age I酶切載體連接，對重組后的Age I酶切載體進行酶切鑒定，對酶切產物進行瓊脂糖電泳檢測，與預期結果相符，再對重組Age I酶切載體使用ANGl-seq測序，測序結果如圖I所示，測序結果表明PCR擴增獲得了序列正確的Angl基因。I. 2.載體質粒的構建
將重組后的Age I酶切載體酶切，回收并純化獲得的1556bp的DNA片段，將其連入經同樣酶酶切的慢病毒包裝系統中的目的基因轉移載體PLV質粒中。2)慢病毒包裝
取細胞密度為O. 5 X IO6細胞/ml對數生長期的293T細胞，接種25ml細胞于25ml的細胞培養皿，在37 °C、5% C02培養箱內培養，待細胞密度達60 %_70 %時即可用于轉染。上一步驟中構建的攜帶有Angl基因的慢病毒載體pLV質粒和包裝質粒pCMV-dR8. 74及包膜質粒pMD2分別溶于除菌的TE中，以紫外光吸收法測定其濃度及純度，保證所提質粒DNA的A260/A280在I. 8 2. O之間，DNA濃度在500 ng/μ I以上。向一滅菌離心管中加入所制備的各質粒溶液(pLVT 20 μ g, pCMV-dR 8.7415 μ g，pMD2G 7. 5 μ g)，無菌水定容至1800 μ I,再加入200 μ I CaCl2 (2. 5mol/L)溶液，輕輕混勻；逐滴緩慢加入2000 μ I PBS緩沖鹽溶液，輕彈管壁混勻，室溫放置20 30 min,溫育結束時,用小吸尖輕輕吹打一次，重懸混合液。將DNA-磷酸鈣混合液轉移至含293T細胞的培養液中，混勻，于37°C培養箱中培養。倒去含有轉染混和物的培養基，再加入15ml的PBS液，輕輕左右晃動一下培養瓶以洗滌殘余的轉染混和物，然后倒去。重復該步驟3次。加入含10 %血清的細胞培養基15ml繼續培養48小時。收集轉染后72小時的293T細胞上清液。于4 °C,4000 rpm離心10 min，除去細胞碎片。用0.45 μ m濾器過濾上清液于40ml超速離心管中，25000 rpm(Beckman V70ti)，4 °C，離心90min。以冰的PBS液重旋病毒沉淀，于4 °C溶解過夜。以10 μ I/管分裝病毒液置于一 70 °C低溫冰箱中保存。對在293T細胞中制備病毒顆粒進行病毒滴度測定，結果如圖2所示，病毒包裝完成。對在293T細胞中制備病毒顆粒進行克隆鑒定，克隆鑒定為包含完整Angl序列并表達所含不蹤基因的GFP蛋白。3)小鼠間充質細胞的轉染
分離純化小鼠MSCs，并分析MSCs細胞表型及誘導多向分化(成骨、成軟骨和成脂分 化)，鑒定MSCs，鑒定結果如圖I所示，小鼠間充質干細胞具有多向分化潛能。MSCs經培養傳代至第四代后，將細胞接種于12孔培養板，在37 1、5%0)2培養箱內培養，使細胞密度大致在70%左右，按MOI值=20接種相應體積的上述包裝好的病毒液于細胞中，繼續培養箱內培養，并密切監測轉染效率。每8小時采用倒置熒光顯微鏡觀察GFP熒光強度。結果提示本系統轉染時間較慢但穩定，在轉染第5天，細胞熒光強度和細胞Angl的表達均達到高峰，轉染效率達到90%以上，如圖4和圖5所示。經上述基因工程和組織工程技術處理后，構建過表達Angl的MSCs細胞，在常規細胞培養條件下可以增殖并傳代。收集轉染前后的MSCs細胞，經處理后，通過流式細胞儀鑒定其干細胞特異性表型⑶44、⑶73、⑶105、Sca-I、⑶45、⑶31、⑶I lb、⑶14等，結果表明轉染前后細胞表型無明顯差異，如圖6所示，Angl基因修飾對MSCs細胞的表型無明顯影響。促血管生成素I基因修飾的間充質干細胞構建成功，可用于體外和體內研究。二、促血管生成素I基因修飾的間充質干細胞修復肺損傷
經靜脈回輸Angl修飾的MSCs (MSCs-Angl)后,細胞經體循環進入肺組織,到達肺損傷部位，發揮干細胞治療和基因治療的多重作用。MSCs-Angl預期進入肺循環，充分利用血液循環和肺血管特點，在肺循環龐大的毛細血管網的阻留及Angl-Tie2間的結合力作用下，最大限度地滯留于肺部，提高MSCs-Angl在肺部特定微環境中定向分化為肺組織細胞的概率；同時針對肺損傷的靶點一肺上皮和內皮細胞進行修復。最終MSCs-Angl可改善肺組織損傷，修復細菌內毒素所致的肺損傷，如圖7-10所示。圖7中，靜脈回輸MSCs-AngI后，提取肺組織中總蛋白后，經SDS-PAGE電泳和western blot檢測Angl蛋白，條帶大小75kD。比較各組各時間點條帶可見，空白對照組(NSgroup) Angl蛋白在脂多糖誘導肺損傷后下降,直至14d仍然低于肺損傷前；Angl組(Anglgroup) Angl蛋白也有下降趨勢,但第3天高于空白對照組；MSCs組(MSCs group) Angl蛋白同樣下降，但第14天已有回升；MSCs-Angl組(MSCs-Angl group)在第7天與第14天明顯高于MSCs組和Angl單獨組，提示MSCs-Angl的回輸具有明顯的放大效應，MSCs-Angl回輸后Angl在肺組織內過表達。圖8中MSCs-Angl回輸可修復病理性肺損傷。外源性MSCs-Angl攜帶Angl-eGFP基因，經靜脈輸入體內后，在第14天可見肺組織受損處多處表達GFP的細胞出現(免疫組化顯示為棕色顆粒的細胞為GFP陽性細胞。a、b為MSCs-Angl回輸組，a xlOO, b x400 ；c、d :對照組)。由于小鼠本身不表達GFP蛋白，表達GFP蛋白的細胞只可能是MSCs轉化而來。熒光顯微鏡直接觀察和免疫組化均可見細胞GFP的表達(e熒光顯微鏡觀察到綠色熒光；f為同一視野的DAPI染色顯示細胞核)。圖9中，與MSCs及Angl單獨回輸相比,MSCs-Angl明顯改善光學顯微鏡下所見的肺部病理損傷、炎癥反應與肺水腫(a、b :空白對照組；c、d :轉染MSCs組；e、f Angl組；g,h MSCs 組。a、C、e、g xl00 ;b、d、f > h :x400)。圖10中，MSC-Angl回輸明顯減輕肺泡灌洗液(BALF)中總蛋白含量、中性粒細胞數量和肺組織過氧化物酶(MPO)活性。這些指標反映肺組織炎癥反應程度和肺損傷程度。MSCs或Angl單獨直接輸入體內，作用較微弱而短暫，而以MSC作為載體轉入Angl，其效果更為明顯和持久(*與同一時間點對照組比較，P〈0. 05)。
實驗證明，本發明的促血管生成素I基因修飾的間充質干細胞可改善肺組織損傷，修復細菌內毒素所致的肺損傷。以上對本發明的具體實施例進行了詳細描述，但其只是作為范例，本發明并不限制于以上描述的具體實施例。對于本領域技術人員而言，任何對本發明進行的等同修改和替代也都在本發明的范疇之中。因此，在不脫離本發明的精神和范圍下所作的均等變換和修改，都應涵蓋在本發明的范圍內。
權利要求
1.一種促血管生成素I基因修飾的間充質干細胞，其特征在于，是攜帶有促血管生成素I基因的間充質干細胞。
2.根據權利要求I所述的促血管生成素I基因修飾的間充質干細胞，其特征在于，所述促血管生成素I基因來源于pCR2. I-Angl質粒。
3.根據權利要求I所述的促血管生成素I基因修飾的間充質干細胞，其特征在于，所述間充質干細胞來源于哺乳動物。
4.一種構建權利要求I所述的促血管生成素I基因修飾的間充質干細胞的方法，其特征在于，包括以下步驟 1)將促血管生成素I基因導入慢病毒包裝系統中的目的基因轉移載體中，得到攜帶有促血管生成素I基因的重組慢病毒載體； 2)將攜帶有促血管生成素I基因的重組慢病毒載體與慢病毒包裝系統中的包裝質粒 和包膜質粒(16-24) : (5. 7-11. 7) : (5. 5-10. 5)的重量份數比混合，轉染慢病毒包裝細胞，得到攜帶有促血管生成素I基因的重組慢病毒； 3)將攜帶有促血管生成素I基因的重組慢病毒轉染間充質干細胞，得到過表達促血管生成素I的促血管生成素I基因修飾的間充質干細胞。
5.根據權利要求4所述的構建方法，其特征在于，所述間充質干細胞從哺乳動物中分離純化得到。
6.根據權利要求4所述的構建方法，其特征在于，所述促血管生成素I基因來源于pCR2. I-Angl 質粒。
7.根據權利要求4所述的構建方法，其特征在于，所述步驟I)中的慢病毒包裝系統中的目的基因轉移載體為PLV質粒，pLV質粒中含有Ubiqutin啟動子。
8.根據權利要求4所述的構建方法，其特征在于，所述步驟2)包裝質粒為pCMV-dR8.74質粒，包膜質粒為PMD2G質粒，慢病毒包裝細胞為293T細胞。
9.根據權利要求4所述的構建方法，其特征在于，所述步驟2)中的轉染慢病毒包裝細胞采用磷酸鈣法、DEAE-葡聚糖法或人工脂質體法。
10.權利要求I至3中任何一項所述的促血管生成素I基因修飾的間充質干細胞在制備修復肺損傷藥物或材料中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種促血管生成素1基因修飾的間充質干細胞及其構建方法和應用，該間充質干細胞攜帶有促血管生成素1基因，實驗證明，本發明促血管生成素1基因修飾的間充質干細胞能過表達促血管生成素1，經靜脈回輸后，促血管生成素1能在肺組織內過表達，明顯改善肺部病理損傷、炎癥反應與肺水腫，效果明顯且持久，本發明促血管生成素1基因修飾的間充質干細胞及其構建方法將為肺損傷的修復提供適宜的微環境，應用前景廣闊。
文檔編號A61K48/00GK102899293SQ201210431720
公開日2013年1月30日 申請日期2012年11月1日 優先權日2012年11月1日
發明者徐金富, 瞿介明 申請人:上海市肺科醫院