基因轉移介導的血管生成療法和血管內基因傳遞技術的制作方法

專利名稱：基因轉移介導的血管生成療法和血管內基因傳遞技術的制作方法
背景當心肌不能接受足夠的血液供給因此缺乏必需水平的氧和營養物質時會出現心肌缺血。心肌缺血最常見的病因是動脈硬化，動脈硬化使得為心肌提供血流的血管(冠狀動脈)堵塞。目前的治療包括藥理學療法，冠狀動脈分流術和使用如氣囊血管成形術的技術進行的經皮換血管術。標準藥理學療法依據的策略是增加心肌的血液供給或降低心肌對氧和營養物質的需求。增加心肌的血液供給可通過如鈣通道阻滯劑或硝酸甘油的藥劑來實現。據認為這些藥劑可通過使動脈壁的平滑肌松弛來增加患病動脈的直徑。降低心肌對氧和營養物質的需求可通過降低心臟血液動力學負荷的藥劑，如動脈血管舒張藥或降低心臟對給定血液動力學負荷的收縮反應的藥劑，如β-腎上腺素能受體拮抗劑來實現。缺血性心臟病的外科療法基于用精心放置的分流移植物(通常是隱靜脈或乳房內部的動脈移植物)來分流患病的動脈區段。經皮換血管術基于使用導管來降低患病冠狀動脈的狹窄程度。所有這些策略都被用來降低心肌缺血發作的次數或根除此病，但它們都有這樣那樣的局限性。
初步報告描述了通過直接注射血管生成蛋白質或肽在心臟中生成了新血管，從而可治療心肌缺血。生長和發育過程中血管生成的調節涉及成纖維細胞生長因子(FGF)家族的幾個成員(即酸性成纖維細胞生長因子，aFGF；堿性成纖維細胞生長因子，bFGF；成纖維細胞生長因子-5,FGF-5等)。aFGF蛋白促進成年動物血管生成的作用是一個最新報道的主題。該報道中提到將被膠原包被的基質中的aFGF蛋白置于成年大鼠的腹腔中可導致血管分布良好并能正常灌注的結構(Thompson等，PNAS 86:7982-7932,1989)。據報道，將bFGF蛋白注入成年犬冠狀血管閉塞的冠狀動脈中會導致心肌功能障礙降低，心肌梗塞面積變小，危險區域的血管分布增加(Yanagisawa-Miwa等，科學257:1401-1403,1992)。使用bFGF蛋白在心肌缺血的動物模型中也可得到類似結果(Harada等，J Clin Invest 94:623-630,1994,Unger等，美國生理學雜志，266H1588-H1595,1994)。
然而，用這些蛋白質達到血管生成效果的前提條件是需要重復地或長期地傳遞該蛋白質，這就限制了在臨床環境使用這些蛋白質刺激血管生成的實用性。換句話說，對人的成功療法需要持續地和長期地灌注一種或多種這些血管生成肽或蛋白質，所述肽或蛋白質本身的價格高得讓人不敢問津，而且需要通過置于冠狀動脈中的導管來傳遞，這進一步抬高了價格并增加了治療難度。
最近，多篇文獻都致力于使用基因轉移來治療或預防疾病，包括心臟病，例見Mazur等，“冠狀動脈再狹窄和基因治療”，分子和細胞藥理學，21:104-111,1994；French，“基因轉移和心血管疾病”，Herz 18:222-229,1993；Williams，“缺血性心臟病基因療法展望”，美國醫學科學雜志，306:129-136,1993；Schneider和French，“腺病毒的出現心血管病的基因療法”，循環88:1937-1942,1993。另一篇文獻，即Leiden等，題為“針對心臟和血管平滑肌的腺病毒介導的基因轉移”的國際專利申請PCT/US93/11133中報道了使用腺病毒介導的基因轉移來調節心血管平滑肌細胞的功能。Leiden等提到可將含有編碼基因產物之DNA序列的重組腺病毒傳遞至心臟或血管平滑肌細胞并維持細胞直至基因產物得以表達。根據Leiden等的報道，通過改變基因轉錄和改變基因轉錄產物，如多核苷酸或多肽的產生可調節肌細胞的功能。
使用腺病毒和其它載體成功地將基因轉移至如心臟的器官仍有一定的困難。例如，將轉基因插入快速分裂的細胞群體會導致轉基因表達的時間大大縮短。這種細胞的例子包括構成所有血管內層的內皮細胞和分散在整個心臟中的成纖維細胞。還需著重考慮的是靶向轉基因以使僅有所需細胞能接受并表達轉基因，而轉基因不會全身性地分布。如果不能做到這一點，就會導致轉基因的全身性表達并引發一系列問題。例如，經記載，肝臟中由腺病毒介導的基因轉移會導致炎性滲入(Yang，等，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)91:4407,1994)。
本文描述和要求的發明致力于解決和克服與現有技術有關的這樣或那樣的問題。
圖2顯示了用lacZ(對照基因)和FGF-5進行基因轉移之前和14±1天之后，在右心房起博(HR=200bpm)過程中缺血血管床壁增厚的百分比(％WTh)，該百分比是通過測定舒張結束時血管壁的厚度(EDWTh)和收縮結束時血管壁的厚度(ESWTh)計算出的。用FGF-5轉移之后，缺血血管床的功能增加了2.6倍(p=0.0001)，而對照基因卻不起作用。
圖3顯示了用lacZ(對照基因)和FGF-5進行基因轉移之前和14±1天之后，心房起博(200bpm)過程中的峰對比率(與血流相關)，該對比率以缺血區域(LCx床)的峰視頻強度除以室間隔(IVS)的峰視頻強度的比率表示，是使用基于計算機的視頻分析程序由視頻影像測得的。用FGF-5轉移之后，流向缺血床的血流比正常情況下增加2倍(p=0.0018)，但用對照基因轉移之后，血流只為正常情況下的50％。
圖4顯示了心肌對比超聲心動描記圖(未顯示)的對應圖，白色區域表示對比增強(更多血流)，黑色區域表示血流減少。圖4A表示正常豬的急性LCx閉塞，圖4B表示LacZ基因轉移后14±1天，圖4C表示FGF-5基因轉移后14±1天。
圖5顯示了用FGF-5和lacZ基因轉移之后，通過對缺血和非缺血區域進行顯微分析而定量測定的毛細血管數目與纖維數目的比率。FGF-5基因轉移之后，血管生成增加(p＜0.038)。
發明簡述本發明涉及用于治療心臟病，如心肌缺血和外周血管病以及其它疾病的基因療法，其中通過血管內傳遞導入基因治療載體。本發明的一個目的是提供治療心臟病的方法，其中通過用含有血管生成蛋白或肽(如FGF-5或FGF-4)基因的載體構建體，優選為病毒載體，如復制缺損的腺病毒構建體靶向心臟而持續地在心肌中產生治療有效量的所述血管生成蛋白或肽，所述構建體是通過冠內注射傳遞的，優選通過導管傳遞，所述導管位于一個或兩個冠狀動脈或者一個或多個隱靜脈或乳房內部動脈移植物(internal mammary artery graft)開口下較遠的位置(一般至少約1cm)。因此，希望注射到一個冠狀動脈或移植物動脈，優選注射到右和左冠狀循環中。特別優選通過三次注射進行傳遞，一次注射至左前降(left anterior descending,LAD)動脈，一次注射至左旋(left circumflex,LCx)冠狀動脈，一次注射至右冠狀動脈。
如本文所述，為了進一步增強基因傳遞，優選在施用基因傳遞載體的同時在血管內傳遞所靶向的位點處灌注血管活性劑(例如組胺，組胺激動劑或血管內皮生長因子(VEGF)蛋白)；最優選在導入載體之前的幾分鐘內灌注血管活性劑。
本發明的另一方面是治療患有心肌缺血之患者的心臟病的方法，所述方法包括通過冠內注射，優選通過將載體直接注射至一個或兩個冠狀動脈(或移植物)中而將含有轉基因的載體傳遞至患者的心肌中，以轉染患病心肌的心肌細胞，所述載體含有編碼血管生成蛋白或肽(例如FGF-5,FGF-4,aFGF,bFGF或VEGF(血管內皮生長因子))的轉基因，并在心臟中表達轉基因，籍此促進患病心肌區域的血管生成。如下文所述，也可使用其它轉基因，例如編碼β-腎上腺素能信號傳導蛋白的基因。本發明所用載體可以是質粒，或優選為病毒載體，例如復制缺損的腺病毒或腺伴隨病毒(AAV)。通過以107-1013個病毒顆粒的優選量(經光密度測定法測定，更優選為109-1011個病毒顆粒)，將病毒載體原種，例如不含有野生型病毒的上述原種深深注射至一個或兩個冠狀動脈(或移植物)的腔中，優選注射至右和左冠狀動脈(或移植物)中，可以用編碼血管生成蛋白或肽的基因局部轉染患病心肌內所需數目的細胞，尤其是心肌細胞，從而使基因轉移的治療效力最大化，并使心臟外位點不必要的血管生成和對病毒蛋白質之炎癥反應的可能性最小化。如果使用的是心室肌細胞特異性的啟動子，啟動子能更可靠地確保只在心肌細胞中進行表達從而避免非心組織，如視網膜中血管生成的潛在有害的影響。為了進一步增強本發明基因傳遞載體的局部傳遞，可以按本文所述的方式利用導管在心肌中灌注血管活性劑，優選灌注組胺或組胺激動劑或血管內皮生長因子(VEGF)蛋白。
另一方面，本發明提供了經過濾可以注射的腺病毒載體制品，其含有重組腺病毒載體和藥學可接受的載體，優選最終的病毒滴度為107-1013個病毒顆粒，所述載體不含野生型病毒，但含有部分腺病毒序列，其中一個或多個賦予復制能力所需的腺病毒基因，例如EIA/EIB基因已缺失，還含有側翼為部分腺病毒序列的啟動子驅動的編碼血管生成蛋白或肽(如aFGF,bFGF,FGF-4,FGF-5或VEGF)的轉基因。通過使用這一可注射的腺病毒載體制品，任選同時使用血管活性劑如組胺或組胺激動劑或血管內皮生長因子(VEGF)蛋白增強本文所述的基因傳遞，可以進行有效的腺病毒介導的FGF基因傳遞以治療心臟病，如臨床心肌缺血或外周血管病，而沒有任何有害的副作用。
另一方面，本發明提供了生產含有重組載體的病毒原種的方法，其中所述載體能在心肌中體內表達血管生成蛋白或肽，所述生產方法包括將轉基因(優選編碼血管生成蛋白或肽，如FGF-4,FGF-5,aFGF,bFGF或VEGF)克隆至含有啟動子、多接頭以及位于側翼的人腺病毒5基因組左末端的部分腺病毒序列的質粒中，其中賦予復制能力的一個或多個所需的腺病毒基因，例如EIA/EIB基因已缺失；用所述質粒與含有整個人腺病毒5基因組和另外的插入物使得質粒太大以致于不能被包裹的質粒共轉染用缺失的復制所需基因轉化的哺乳動物細胞，籍此在含有轉基因的質粒和具有整個腺病毒基因組的質粒之間發生獲救重組，從而產生含有轉基因而不含復制所需基因的重組基因組，所述重組基因組小得足以被包裹；鑒定細胞培養物中成功的重組子；在被缺失的復制所需基因轉化的哺乳動物細胞中增殖所得重組子；純化增殖的重組子使其中含有重組載體，而不含野生型病毒，任選將純化的載體穿過濾器，優選為10-50微米的濾器，更優選為30微米的濾器。
另一方面，可通過插入股動脈近側部分的導管來傳遞表達血管生成肽或蛋白質的重組腺病毒，優選同時使用血管活性劑，如組胺或組胺激動劑，從而將基因轉移至接受來自股動脈之血流的骨骼肌細胞中。籍此提供血管生成刺激物，導致腿骨骼肌中的血管生成，從而治療特征在于腿肌肉供血不足的外周血管病。
在本發明的另一方面，通過將載體傳遞至用血管活性劑，如組胺或組胺激動劑或血管內皮生長因子(VEGF)蛋白共灌注或預灌注的血管(如動脈)中，可增強使用載體，如病毒載體(如腺病毒或腺伴隨病毒)進行基因傳遞的效力。最優選在導入載體之前的幾分鐘內將血管活性劑灌注至血管中。
優選實施方案的詳細描述本發明的轉基因在本發明中，可使用多種能促使心肌血流向心臟(對外周血管病而言為骨骼肌)缺血區域的蛋白質或肽生長因子以及其它轉基因。至于待表達的血管生成蛋白或肽，可例舉如aFGF,bFGF,FGF-4和FGF-5的血管生成蛋白或肽。在蛋白質灌注的過程中合理地確定了FGF家族的血管生成活性(YanagisawaMiwa等，科學，257:1401-1403,1992,Harada等，J Clin Invest 94:623-630,1994,Unger等，美國生理學雜志，266:H1588-H1595,1994)。也可使用VEGF(血管內皮生長因子，它是新血管生成的有效刺激物)基因。基因轉移方法的成功需要合成基因產物并由轉染細胞分泌該產物。由此看來，編碼FGF-5或FGF-4的基因是優選的，優選選擇的基因中包括信號肽編碼序列，該序列使得基因產物(一旦被表達)可進入心臟(或骨骼肌)間質組織并誘導血管生成。可以使用的血管生成蛋白包括成纖維細胞生長因子(FGF)，血管內皮生長因子(VEGF)，血小板-衍生的生長因子(PDGF)，胰島素樣生長因子(IGF)等家族的成員。FGF家族成員包括但不限于aFGF(FGF-1),bFGF(FGF-2),FGF-4(也稱為“hst/KS3”),FGF-5,FGF-6。體外和體內的心肌細胞對缺血所作的反應是表達VEGF；VEGF是生理狀況下以及對病理狀況的適應反應過程中血管生成的調節劑(Banai等，循環89:2183-2189,1994)。VEGF家族包括但不限于VEGF-A亞族的成員(如VEGF-121,VEGF-145,VEGF-165,VEGF-189和VEGF-206)以及VEGF-B亞族的成員(如VEGF-167和VEGF-186)和VEGF-C亞族。PDGF家族包括PDGF A和PDGF B。編碼這些蛋白質之基因的核苷酸序列和相應的氨基酸序列是本領域已知的(例見這些和其它序列的GENBANK序列數據庫)。有關FGF家族，例見Burgess,Ann,N.Y.Acad.Sci.638:89-97,1991；Burgess等，生物化學年評，58:575-606,1989；Muhlhauser等，人類基因治療6:1457-1465,1995；Zhan等，分子細胞生物學，8:3487,1988；Seddon等，Ann,N.Y.Acad.Sci.638:98-108,1991。有關人hst/KS3(即FGF-4)，例見Taira等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:2980-2984,1987。有關人VEGF，例見Tischer等，生物化學雜志，206:11947-11954,1991和其中的參考文獻；Muhlhauser等，Cir.Res.77:1077-1086,1995。從諸如GenBank或EMBL的序列數據庫中易于得到所述基因和所編碼多肽的序列資料。也可使用例如PCR或本領域的常規雜交技術從基因文庫中得到編碼這些蛋白質的多核苷酸。編碼FGF-4,FGF-5或FGF-6的基因是優選的，因為這些蛋白質含有功能性的分泌信號序列，易于從細胞中分泌出來。很多(如果不是大多數)人VEGF蛋白(包括但不限于VEGF-121和VEGF-165)也是易于分泌的，并且在分泌之后可以擴散。因此，這些血管生成蛋白一旦表達，即易于進入心臟間質組織并誘導血管生成。至于缺乏天然分泌信號序列的其它血管生成蛋白，如aFGF(FGF-1)和bFGF(FGF-2)，使用本領域技術人員熟知的標準重組DNA方法學可重組產生具有分泌信號序列的融合蛋白。據信aFGF和bFGF天生具有一定的分泌水平；然而，可再包含另外的分泌信號序列以增強蛋白質的分泌。分泌信號序列一般位于所需蛋白質的N末端，但也可位于適于分泌血管生成因子的任何位置。例如，含有適當信號序列的多核苷酸可與選定血管生成蛋白基因的第一個密碼子5’端融合。適當的分泌信號序列包括FGF-4,FGF-5,FGF-6基因的信號序列或不同分泌蛋白，如IL-1β的信號序列。血管生成蛋白經修飾可含有另一種蛋白質的信號序列，所述修飾如用介導分泌第二種分泌型蛋白質的殘基取代血管生成蛋白中的殘基，例見1997年5月6日提交的共同懸而未決的美國流水號08/852,779(列入本文作為參考)。可使用心肌細胞正常分泌之蛋白質的信號序列。為了治療人，優選使用來源于人的編碼血管生成蛋白的基因，但也可使用來源于其它哺乳動物，并表現出種間交叉反應性，即在人中具有血管生成活性的血管生成蛋白。
除了血管生成因子以外，也可使用能增強心臟功能的β-腎上腺素能信號傳導蛋白(β-ASP)。這種β-ASP的例子包括β-腎上腺素能受體(β-AR),G-蛋白受體激酶抑制劑(GRK抑制劑)和腺苷酸環化酶(AC)，其詳細描述于1997年9月5日提交的共同懸而未決的美國流水號08/924,757(基于1997年6月16日提交的美國申請60/048,933和1996年9月5日提交的美國申請08/708,661)以及1997年9月5日提交的PCT/US97/15610和1998年1月16日提交的美國繼續申請流水號08/…。這些和所有其它專利申請以及專利申請中提及的參考文獻都列入本文作為參考。基因傳遞所用的載體在本發明的方法中，載體可以是質粒載體或病毒載體，例如復制缺損的腺病毒載體或腺伴隨病毒載體。下文提供了描述多種載體(包括病毒和非病毒載體)的構建和使用的參考文獻。
作為實例，將所需基因體內轉移至心臟(或骨骼肌)，包括心肌細胞(和骨骼肌細胞)并介導所編碼蛋白質的組成型產生。可以使用幾種不同的基因轉移方法，優選使用不依賴于輔助病毒的復制缺損的人腺病毒系統。通過使用該系統，我們證明通過單次冠內注射可體內轉染60％以上的心肌細胞(Giordano和Hammond，臨床研究，42:123A,1994)。非復制型重組腺病毒載體對轉染冠狀內皮細胞和心肌細胞并在冠內注射后獲得高度有效的轉染特別有用。對轉染外周血管系統的靶細胞也特別有用。
基于人腺病毒5(病毒學，163:614-617,1988)的重組腺病毒載體缺乏腺病毒基因組中必需的早期基因(通常是E1A/E1B)，因此不能復制，除非在可反式提供缺失基因產物的允許細胞系中生長時才能復制。替代缺失的腺病毒基因組序列，可克隆所需的轉基因并在被該復制缺損的腺病毒感染的組織/細胞中表達。盡管基于腺病毒的基因轉移不會使轉基因整合至宿主基因組(低于0.1％的腺病毒介導的轉染會導致轉基因摻入宿主DNA)，因此是不穩定的，但腺病毒載體可以高滴度增殖并轉染非復制細胞。盡管轉基因不能傳遞至子代細胞，但基因轉移至不分裂的成年骨骼肌和心肌細胞是可以接受的。逆轉錄病毒載體提供了穩定的基因轉移，目前經由逆轉錄病毒假型化可以得到高滴度的病毒載體(Burns等，Proc.Natl.Acad.Sci(USA)90:8033-8037,1993)，但最新的逆轉錄病毒載體不能有效轉導非復制細胞(成年骨骼肌和心肌細胞)。另外，如果只需進行短期基因轉移即已足夠的話，轉基因摻入宿主DNA的潛在危害就不復存在。實際上，我們已發現在有限的時間內表達血管生成蛋白就足以生成大量血管，對心血管病和外周血管病進程進行瞬時基因轉移即可進行充分的治療。
被腺病毒E1A/E1B基因轉化的人胚腎細胞，即人293細胞是有用的允許細胞系的典型代表。然而，也可使用允許復制缺損的腺病毒載體在其中增殖的其它細胞系，包括HeLa細胞。構建基因傳遞所用的重組腺病毒載體和其它載體通過Graham，病毒學163:614-617,1988所述的獲救重組技術可構建本發明中所用的所有腺病毒載體。簡單地說，將所需轉基因克隆至含有啟動子、多接頭和部分側翼腺病毒序列的穿梭載體中，該部分腺病毒序列中已缺失了EIA/EIB基因。作為穿梭載體，可例舉質粒pAC1(病毒學，163:614-617,1988)(或類似物)，其編碼人腺病毒5基因組左末端部分(病毒學，163:614-617,1988)，并缺失了對病毒復制至關重要的編碼早期蛋白質的E1A和E1B序列；和質粒ACCMVPLPA(生物化學雜志，267:25129-25134,1992)，其含有多接頭，CMV啟動子和SV40聚腺苷酸化信號，以及位于側翼的EIA/EIB基因已缺失的部分腺病毒序列。質粒pAC1或ACCMVPLA的使用便于克隆過程。然后用穿梭載體與含有整個人腺病毒5基因組，因長度太大以致于不能被包裹的質粒共轉染293細胞。通過磷酸鈣沉淀或脂轉染法(生物技術，15:868-872,1993)可進行共轉染。質粒JM17編碼整個人腺病毒5基因組及載體pBR322的一部分，其中包括氨芐青霉素抗性基因(4.3kb)。盡管JM17編碼獲得成熟的病毒顆粒所必需的所有腺病毒蛋白質，但它太大以致于不能被包裹(40kb，而野生型為36kb)。在共轉染細胞的一小群中，含有轉基因的穿梭載體(如質粒pAC1)和具有整個腺病毒5基因組的質粒(如質粒pJM17)之間的獲救重組提供了E1A/E1B序列缺損的重組基因組，其含有所需轉基因，但在重組過程中失去了額外的序列，如pBR322序列，因而小得足以被包裹(見

圖1)。關于上述方法，我們已報道了成功的結果(Giordano等，循環88:1-139,1993和Giordano和Hammond，臨床研究，42:123A,1994)。可使用CMV驅動的編碼β-半乳糖苷酶的腺病毒HCMVSP1lacZ(CLIN RES 42:123A,1994)，利用X-gal處理來評價基因轉移的效力。
最初的基因轉移模式使用了上文所述的腺病毒載體。這些載體的優點包括能實現高效基因轉移(體內轉染60％以上的靶器官細胞)，易于得到高滴度的病毒原種，并且這些載體還能對如心肌細胞的不分裂細胞進行基因轉移。
描述多種其它基因傳遞載體的文獻是本領域已知的，本文提到了其中的一些文獻。所述其它載體包括例如其它病毒載體(如腺伴隨病毒(AAV))，脂質體和其它含有脂質的復合物，和其它能介導多核苷酸傳遞至宿主細胞的大分子復合物。如上文和所述參考文獻中所述，載體也可含有其它能進一步調節基因傳遞和/或基因表達，或要不然能為靶細胞提供有利特性的組分或功能元件。所述其它組分包括例如可影響結合或靶向細胞的組分(包括介導細胞型或組織特異性結合的組分)；影響細胞攝取載體核酸的組分；影響攝取后多核苷酸在細胞中的定位的組分(如介導核定位的試劑)；和影響多核苷酸表達的組分。所述組分也可包括標記物，如可用于檢測或選擇已吸收并表達由載體傳遞之核酸的細胞的可測的和/或可選擇的標記物。所述組分可作為載體的天然特征被提供(例如使用某些具有介導結合和攝取的組分或功能元件的病毒載體)，或者對載體進行修飾以提供所述功能元件。選擇標記可以是陽性，陰性或雙功能的。陽性選擇標記可選擇攜有標記物的細胞，而陰性選擇標記可選擇標記物被選擇性消除的細胞。已描述了多種標記基因，其中包括雙功能(即陽性/陰性)標記(例見Lupton,S.,WO92/08796,1992年5月29日公開；和Lupton,S.,WO94/28143,1994年12月8日公開)。這種標記基因另外還可作為對照，這對基因治療過程而言是有利的。多種此類載體是本領域已知的，并且一般是可以得到的(例見上述多篇文獻)。
描述本發明方法中可用的腺病毒載體和其它病毒載體的其它文獻包括下列Horwitz,M.S.，腺病毒科及其復制，Fields,B等(編)，病毒學，Vol.2,Raven出版社，紐約，p1679-1721,1990；Graham,F等，p109-128，分子生物學方法，Vol.7:基因轉移和表達方法，Murray,E(編)，Humana出版社，Clifton,N.J(1991)；Miller,N等，FASEB Journal 9:190-199,1995；Schreier,H.PharmaceuticaActa Helvetiae 68:145-159,1994；Schneider and French，循環，88:1937-1942,1993；Curiel D.T等，人類基因治療，3:147-154,1992；Graham,F.L等，WO 95/00655(1995年1月5日)；Falck-Pedersen,E.S.,WO 95/16772(1995年6月22日)；Denefle,P等，WO 95/23867(1995年9月8日)；Haddada,H等，WO94/26914(1994年11月24日)；Perricaudet,M等，WO 95/02697(1995年1月26日)；Zhang,W等，WO 95/25071(1995年10月12日)。多種腺病毒質粒也可以商購自，包括例如Microbix Biosystems ofToronto,Ontario(例見Microbix產品目錄腺病毒載體構建所用質粒，1996)，也可參見Vile等的論文，天然生物技術，15:840-841,1997,Feng等，天然生物技術，15:866-870,1997，其中描述了可用于基因傳遞的腺病毒/逆轉錄病毒嵌合載體的構建和使用。
描述本發明方法中可用的AAV載體的其它文獻包括下列Carter,B，細小病毒手冊，vol.1,p169-228,1990；Berns，病毒學，p1743-1764(Raven出版社，1990)；Carter,B.，生物技術最新觀點，3:533-539,1992；Muzyczka,N.，微生物學和免疫學最新論題，158:92-129,1992；Flotte,T.R等，Am.J.Respir.Cell Mol.Biol.7:349-356,1992；Chatterjee等，Ann.NY Acad.Sci.,770:79-90,1995；Flotte,T.R等，WO 95/13365(1995-5-18)；Trempe,J.P等，WO 95/13392(1995-5-18)；Kotin.R.，人類基因治療，5:793-801,1994；Flotte,T.R等，基因治療，2:357-362,1995；Allen,J.M.,WO 96/17947(1996-6-13)；和Du等，基因治療，3:254-261,1996。
描述本發明方法中可用的非病毒載體的其它文獻包括下列Ledley,FD，人類基因治療，6:1129-1144,1995；Miller,N等，FASEB Journal 9:190-199,1995；Chonn.A等，生物技術最新觀點，6:698-708,1995；Schofield,J.P等，British Med.Bull.51:56-71,1995；Brigham,K.L等，脂質體研究雜志，3:31-49,1993；Brigham,K.L.,WO 91/06309(1991-5-16)；Felgner,P.L等，WO 91/17424(1991-11-14)；Solodin等，生物化學34:13537-13544,1995；WO 93/19768(1993-10-14)；Debs等，WO 93/25673；Felgner,P.L等，美國專利5,264,618(1993-11-23)；Epand,R.M等，美國專利5,283,185(1994-2-1)；Gebeyehu等，美國專利5,334,761(1994-8-2)；Felgner,P.L等，美國專利5,459,127(1995-10-17)；Overell,R.W等，WO95/28494(1995-10-26)；Jessee,WO 95/02698(1995-1-26)；Haces和Ciccarone,WO 95/17373(1995-6-29)；Lin等，WO 96/01840(1996-1-25)。組織特異性啟動子本發明也希望不僅通過將轉基因傳遞至冠狀動脈或股動脈，還使用組織特異性啟動子進行細胞靶向。通過將左心室肌球蛋白輕鏈-2(MLC2v)或肌球蛋白重鏈(MHC)的組織特異性轉錄控制序列與腺病毒構建體內的轉基因，如FGF-5融合，可將轉基因的表達局限于心室心肌細胞。針對lacZ，使用本發明的重組腺病毒系統測定了由MLC2v和MHC啟動子提供的基因表達的效力以及特異性程度。Lee等以前曾報道過心臟特異性表達(生物化學雜志，267:15875-15885,1992)。MLC2v啟動子由250bp組成，容易符合腺病毒-5的包裝限制范圍。已知肌球蛋白重鏈啟動子是強有力的轉錄啟動子，它是另一個合理的心臟特異性啟動子，由低于300bp組成。盡管其它啟動子(如肌鈣蛋白-C啟動子)是高效的并且足夠小，但卻缺乏足夠的組織特異性。通過使用MLC2v或MHC啟動子并在體內傳遞轉基因，據信只有心肌細胞(即在心臟內的內皮細胞，平滑肌細胞和成纖維細胞中不相伴表達)中足量表達了血管生成蛋白，如FGF-5以促進血管生成。將表達局限于心肌細胞對利用基因轉移治療臨床心肌缺血是有利的。通過將表達局限于心臟，避免了非心臟組織(如視網膜)中血管生成的潛在有害的影響。另外，在心臟細胞中，由于肌細胞不會快速轉換，因而可能提供最長的轉基因表達；因此表達不會因內皮細胞可能會發生的細胞分裂和死亡而降低。已得到了內皮細胞特異性的啟動子可用于此目的(Lee等，生物化學雜志，265:10446-10450,1990)。
在本發明中，關于治療心臟病，目前優選通過冠內注射高滴度的載體靶向心臟并轉染所有細胞類型。增殖并純化腺病毒載體可根據標準方法噬斑純化成功的重組載體。在反式提供E1A和E1B功能的293細胞上增殖所得的病毒載體至滴度的優選范圍為1010-1012個病毒顆粒/ml。然后感染80％鋪滿的細胞，48小時后收獲病毒。3次凍融循環之后，離心沉淀細胞碎片，通過CsCl梯度超離心(優選雙CsCl梯度超離心)純化病毒。體內注射之前，通過Sepharose柱(如G25Sephadex)進行凝膠過濾使病毒原種脫鹽。然后將產物流經30微米的濾器以過濾，籍此降低冠內注射未經過濾的病毒的有害影響(對生命有威脅的心率失常)并促進有效的基因傳遞。所得病毒原種最終的病毒滴度范圍為1011-1012個病毒顆粒/ml。重組的腺病毒必需是高度純化的，不含野生型(可能會復制的)病毒。不純的構建體可導致宿主動物強烈的免疫應答。由此看來，可通過例如使用適當引物經PCR鑒定成功的重組子，進行兩輪噬斑純化和雙CsCl梯度超離心進行增殖和純化以排除污染物和野生型病毒。另外，我們發現通過在冠內注射之前將重組腺病毒流經適當大小的濾器進行過濾即可避免因將腺病毒載體注射至患者體內而誘導的心率失常的相關問題。此策略似乎可大大改善基因轉移和表達。重組載體的傳遞本發明的載體，包括病毒載體以及非病毒載體可以是(例如，必要時)含有藥物可接受的載體，如鹽水的可注射制劑形式。
優選的載體是上文所述的復制缺損的腺病毒載體。可注射制劑中該載體最終滴度的優選范圍為允許有效基因轉移的107-1013個病毒顆粒。下文描述了其它藥物學載體，制劑和劑量。通過在熒光鏡的指導下，使用基于標準經皮導管的方法，灌注一個或兩個冠狀動脈(或移植血管)可將載體轉基因構建體傳遞至心肌，灌注的量足以使轉基因的表達水平可達到高效治療。
注射應深入冠狀動脈(或移植血管)的腔內(動脈腔內約1cm)，優選在兩個冠狀動脈內進行，因為各個患者的側血管生長是高度可變的。因此，也包括注射至一個冠狀動脈或移植動脈；然而，優選注射至右和左冠狀動脈循環。特別優選通過三次注射進行傳遞，一次注射至左前降動脈(LAD)，一次注射至左旋(LCx)冠狀動脈，一次注射至右冠狀動脈。通過用冠狀導管直接將治療物質注射至冠狀動脈腔內(當需要增強基因治療時，優選與血管活性劑聯合，如組胺或組胺激動劑或VEGF蛋白)，可以更有效地靶向基因，并使注射過程中流向近側主動脈的重組載體損失最小化。我們發現當以此方式傳遞時，基因表達不會在肝細胞中發生，在冠內注射后任何時間的尿液中也未曾發現病毒RNA。本發明可使用任一種冠狀導管或使用例如Stack灌注導管。另外，也可使用本領域技術人員已知的其它技術將基因轉移至動脈壁。
可以類似的方法經由動脈內灌注至供給靶組織的動脈內而將基因傳遞至其它器官或組織，優選按本文所述聯合灌注血管活性劑，如組胺或組胺激動劑或血管內皮生長因子(VEGF)蛋白以增強基因傳遞。
作為實例，為了治療外周血管病(其特征在于腿部供血不足)，可通過插入股動脈近側部分的導管來傳遞表達血管生成肽或蛋白質的重組載體，優選聯合使用血管活性劑，如組胺或組胺激動劑，從而將基因轉移至接受來自股動脈之血流的骨骼肌細胞中。籍此提供血管生成刺激物，導致欲治療的腿骨骼肌中的血管生成，同時使血流增加。
本文所用的血管活性劑指的是可誘導血管通透性增加并增強大分子(如基因傳遞載體)轉移穿過毛細血管壁的天然或合成的物質。通過增加血管對大分子的通透性或要不然便于大分子轉移至被動脈灌注的毛細血管床中，血管活性劑可增強這些載體至靶位點的傳遞，因而有效地增強轉基因在靶組織中的全面表達。在下文說明性的實施例中(例見實施例5)，將組胺用作血管活性劑，發現它能大大增強載體至灌注位點如心肌的傳遞。可以使用的組胺衍生物(和激動劑，如與組胺H1受體相互作用的那些化合物)包括例如2-甲基組胺，2-吡啶基乙胺，培他司汀(betahistine)和2-噻唑基乙胺。這些和其它組胺激動劑描述于例如Garrison JC.,Goodman和Gilman，治療劑的藥物學基礎(第8版:Gilman AG,Rall TW,Nies AS,Taylor P編)Pergamon出版社，1990,p575-582。
除了組胺和組胺激動劑可用作血管活性劑以外，血管內皮生長因子(VEGF)和VEGF激動劑(如上文和提到的參考文獻中所述)也可使血管通透性增加，因此在本文所述的組合物和方法中也可用作血管活性劑以增強基因傳遞。與組胺一樣，優選在灌注載體之前的幾分鐘內將VEGF灌注至供給靶位點的血管中。關于人VEGF，可參見例如Tischer等，生物化學雜志，206:11947-11954,1991和其中的參考文獻；和Muhlhauser等，循環研究，77:1077-1086,1995。
可在施用載體的同時導入血管活性劑，但優選在導入載體前的幾分鐘內將血管活性劑導入靶位點(例如通過預灌注)以使血管活性劑能在細胞暴露于載體之前在灌注細胞中引發反應。不希望受理論的束縛，據信施用這種血管活性劑可增強穿過毛細血管內皮細胞壁的跨毛細血管囊轉運，從而便于轉移大分子復合物，如病毒載體。心肌缺血的動物模型成功地研究基因治療的重要前提條件是(a)組建適用于臨床心肌缺血的動物模型，該模型可提供有關心肌缺血情況下血管生成機理的有用數據，和(b)準確評價基因轉移的效果。由此看來，現有技術無一令人滿意。我們已使用了模擬臨床冠狀動脈病的豬心肌缺血模型。將ameroid縮窄器置于左旋(LCx)冠狀動脈的周圍會導致逐步完全的閉塞(在置入7天內)，而梗塞的程度最低(左心室1％,LCx床4±1％)(Roth等，循環，82:1778,1990,Roth等，美國生理學雜志，235:H1279,1987,White等，循環研究，71:1490,1992,Hammond等，Cardiol23:475,1994和Hammond等，J Clin Invest 92:2644,1993)。由于生成了側血管，先前被閉塞動脈灌注的區域(指的是缺血區域)的心肌功能和血流在休息時是正常的，但是當心肌對氧的需求增加時，血流儲備不足以防止缺血。因此，LCx床遭遇類似于臨床心絞痛的陣發性缺血。在放置ameroid后21天內，側血管生成和流動-功能的關系是穩定的，在4個月內保持不變(Roth等，循環，82:1778,1990,Roth等，美國生理學雜志，235:H1279,1987,White等，循環研究，71:1490,1992)。經遠距測定法證實，動物體內處于危險之中的血管床在整個白天表現出周期性的缺血機能異常，這與飼喂過程被管理員中斷時心率的突然增加有關(數據未公開)，因此，該模型所具有的血管床具有穩定但不充足的側血管，因而會發生周期性的心肌缺血。該模型的另一個與眾不同的優點是有一個正常灌注和起作用的區域(LAD床)與異常灌注并起作用的區域(LCx床)相鄰，籍此在每個動物體內提供一個對照床。
使用心肌對比超聲心動描記法估計區域性心肌灌注。對比材料由半乳糖的微聚集體組成，可增加影像的回波產生(白色)。微聚集體以同血流成比例的方式分布于冠狀動脈和心肌壁(Skyba等，循環，90:1513-1521,1994)。經微球體測定，已證明對比峰的強度與心肌血流密切相關(Skyba等，循環，90:1513-1521,1994)。為了證明本發明所用的超聲心動描記法可準確地鑒定LCx床，而且可使用心肌對比超聲心動描記法評價心肌血流，可將液壓套閉塞器置于LCx近側周圍，與ameroid相鄰。
在本研究中，當處死動物時，(在生理壓力下，用戊二醛原位)灌注固定心臟以通過顯微鏡定量毛細血管的生長。使用PCR檢測已接受基因轉移的動物心肌中的血管生成蛋白DNA和mRNA。另外，如下文所述，基因轉移2周后，取自所有5只lacZ感染動物的心肌樣品都在組織學檢查中顯示出顯著的β-半乳糖苷酶活性。最后，使用針對血管生成蛋白的多克隆抗體闡明了取自已接受基因轉移的動物的細胞和心肌中血管生成蛋白的表達。
治療研究的策略包括轉基因傳遞的時機，轉基因施用的途徑和血管生成基因的選擇。在心肌缺血的ameroid模型中，在生成了穩定但不充足的側血管之后進行基因轉移。使用ameroid模型的先前研究包括在發生心肌缺血和產生側血管之前，在閉塞ameroid的過程中傳遞血管生成肽。然而，因下列幾個原因不使用該策略。首先，以前的研究不適于準確地再現治療臨床心肌缺血時(其中在不斷發展的心肌缺血狀態下進行基因轉移)所處的狀態；以前的研究類似于在心肌缺血之前提供肽，因此相關性較差。第二，根據以前對細胞培養物的研究，推測缺血刺激與肽聯合可能是刺激血管生成的最佳環境。在心肌缺血已經發生時傳遞轉基因可以最好地達到上述目的。與這些決定相關的是選擇獲得轉基因傳遞的方法。技術應適用于隨后進行的對冠狀動脈病患者的治療這一限制因素使得幾種方法站不住腳(不斷將肽灌注至冠狀動脈，直接將質粒注射至心臟，用含有肽的樹脂包被心臟以提供長期緩慢的釋放)。最后，豬模型提供了極好的方法，可以在基因傳遞之前和之后追蹤區域性血流和功能。接受相同重組腺病毒構建體但具有報道基因的對照動物的使用為這些研究提供了對照。本領域技術人員應懂得下文中所描述的豬的結果可以預測人的結果。豬天生具有與人非常類似的冠狀動脈循環，包括缺乏天生的冠狀側血管。治療應用本發明的載體，如復制缺損的腺病毒可以在體內進行高效基因轉移而不會在基因表達區域引起細胞病變或炎癥。根據下文實施例中將進一步描述的這些結果，可以看出水平足夠高的體內基因轉移在體內進行，獲得了功能上的改變。在治療心臟病時，通過冠內注射對血管生成蛋白進行基因轉移可促進血管生成并增強心臟功能。因此，可在觀察到最初的心肌缺血發作之后對心肌缺血進行治療。另外，在基因轉移之后，缺血區域的毛細血管數目、血流和功能會增加。將這些技術應用于臨床將十分有用，對不能手術的冠狀動脈病和致人死地的心絞痛尤其有用。本發明的數據證明表達成纖維細胞生長因子(如FGF-5)的重組腺病毒的基因轉移能有效地大大降低心肌缺血的發病率。血管生成蛋白和轉基因也可用于1997年5月6日提交的共同懸而未決的美國申請流水號08/852,779(列入本文作為參考)中所述的組合物和治療方法。如本文所述，血管活性劑，如組胺或組胺激動劑或VEGF蛋白可與這些方法和組合物聯合使用以進一步增強血管內注射所靶向位點的基因傳遞。
如上文所述，也可使用β-腎上腺素能信號傳導蛋白(β-ASP)，例如β-腎上腺素能受體(β-AR),G-蛋白受體激酶抑制劑(GRK抑制劑)和腺苷酸環化酶(AC)來增強心臟功能，其詳細描述于1997年9月5日提交的共同懸而未決的美國流水號08/924,757(基于1997年6月16日提交的美國申請60/048,933和1996年9月5日提交的美國申請08/708,661)以及1997年9月5日提交的PCT/US97/15610和1998年1月16日提交的美國繼續申請流水號08/…，這些參考文獻都列入本文作為參考。如本文所述，血管活性劑，如組胺或組胺激動劑或VEGF蛋白可與這些方法和組合物聯合使用以進一步增強血管內注射所靶向位點的基因傳遞。
本發明的組合物或產物可以適于冠內給藥的制劑形式方便地提供。適當的給藥方式最好由醫務人員根據各個患者的情況來確定。適當的藥物可接受的載體及其制劑描述于標準的有關制劑的論文中，例見E.W.Martin的Remington藥物科學，也可參見Wang,Y.J和Hanson,M.A.蛋白質和肽的胃腸外制劑穩定性和穩定劑”，Journals ofParental Science and Technology,Technical Report No.10,Supp.42:2S(1988)。應優選在中性pH，例如約pH6.5至約pH8.5，更優選在約pH7至8的溶液中配制本發明的載體，加入賦形劑，如4.5％甘露糖醇或0.9％氯化鈉使溶液大致等滲，用本領域已知的一般被認為是安全的緩沖溶液，如磷酸鈉來緩沖pH，另外還可加入可接受的防腐劑，如0.1％至0.75％的間甲酚，更優選為0.15％至0.4％的間甲酚。使用氯化鈉或其它藥物可接受的試劑，如葡萄糖，硼酸，酒石酸鈉，丙二醇，多元醇(如甘露糖醇和山梨糖醇)或其它無機或有機溶質可獲得所需的等滲性。對于含有鈉離子的緩沖液，特別優選氯化鈉。必要時，也可制備上述組合物溶液以增強貯存期限和穩定性。根據通常可接受的方法混合成分即可制備本發明的治療有用的組合物。例如，可混合選定的成分以產生濃縮的混合物，再通過加入水調整至最終的濃度和粘度和/或加入緩沖液以控制pH或加入其它溶質控制張力。
為了便于醫師使用，所提供的組合物的劑量形式中所含本發明載體的量應能在一個或多個劑量中有效誘導一定水平的血管生成。本領域技術人員應理解，治療劑的有效量因多個因素的不同而不同，所述因素包括患者的年齡和體重，患者的生理狀況和想達到的血管生成水平和其它因素。
本發明優選化合物，如復制缺損的腺病毒的有效劑量一般至少約為107個病毒顆粒，優選約為109個病毒顆粒，更優選約為1011個病毒顆粒。病毒顆粒的數目可以達，但優選不超過1013個。需說明的是，給藥的精確劑量由臨床護理醫生決定，但優選于1ml磷酸緩沖鹽水中。
為了治療心臟病，本發明優選的給藥模式是使用適當的冠狀導管冠內注射一個或兩個冠狀動脈(或一個或多個隱靜脈或乳房內部動脈移植物)。如本文所述，優選注射至右和左冠狀動脈循環。特別優選通過三次注射進行傳遞，一次注射至左前降動脈(LAD)，一次注射至左旋(LCx)冠狀動脈，一次注射至右冠狀動脈。盡管兩次左冠狀動脈進行系列注射比較方便，但這應在注射右冠狀動脈之前或之后進行。在右冠狀動脈不易進入的情況下(不具有搭橋并行血管因而閉塞的結果或因為太小而不能進行選擇性注射)，全部的載體劑量可都通過注射至左冠狀動脈循環(優選為上述的LAD和LCx)來傳遞。每次注射一般都在1至幾分鐘內進行，一般約為1.5分鐘。為了治療外周血管病，本發明優選的給藥模式是使用適當的動脈導管注射股動脈的近側部分。
如本文所述，可在傳遞載體的同時或之前通過導管將血管活性劑灌注至靶位點以促進基因傳遞。使用這種試劑可導致基因傳遞效力增強，這一點可由靶位點處表達轉基因的細胞的百分比增加來證實。有關組胺和其它血管活性劑的生理學和藥物學作用，例見Altura BM和Halevy S.組胺對心血管的作用，《組胺Ⅱ和抗-組胺劑化學，代謝和生理學及藥物學作用》(Rocha e Silva M編)Handbuch derExperimentellen Pharmakologie,Vol 18,Part 2,Springer Verlag,Berlin,1978,p1-39。可以使用的組胺衍生物(和激動劑，如與組胺H1受體相互作用的那些化合物)包括例如2-甲基組胺，2-吡啶基乙胺，培他司汀和2-噻唑基乙胺。這些和其它組胺激動劑描述于例如Garrison JC.,Goodman和Gilman，治療劑的藥物學基礎(第8版Gilman AG,Rall TW,Nies AS,Taylor P編)Pergamon出版社，1990,p575-582。
為了有助于理解本發明，提供了下列實施例來描述一系列實驗的結果。當然，不應認為與本發明相關的實驗特別地限制了本發明，目前已知的或以后產生的對本發明的改動是本領域技術人員易于做到的，落在本文所述和下文所要求的本發明的范圍之內。實施例1腺病毒構建體使用了不依賴于輔助病毒的復制缺損的人腺病毒5系統。目的基因是lacZ和FGF-5。以1.1kb EcoRI片斷的形式從質粒pLTRI22E(Zhen等，分子細胞生物學，8:3487,1988)上釋放人FGF-5的全長cDNA，其包括981bp的基因開放閱讀框，將該片斷克隆至質粒ACCMVPLPA的多接頭中，所述質粒含有CMV啟動子和SV40聚腺苷酸化信號，以及位于側翼的其中EIA和EIB基因(病毒復制所必需的)已缺失的部分腺病毒序列。用該質粒和質粒JM17共轉染(脂轉染)293細胞，質粒JM17含有整個人腺病毒5基因組以及另外的4.3kb插入物，從而使pJM17太大以致于不能被包裹。同源獲救重組導致腺病毒載體含有轉基因而缺乏EIA/EIB序列。盡管這些重組子在哺乳動物細胞中不能復制，但它們在被EIA/EIB轉化并反式提供這些必需基因產物的293細胞中可以增殖。監測轉染細胞中通常在轉染后10至14天發生的細胞病變效應的表現。
為了鑒定成功的轉化子，于56℃用蛋白酶K(50mg/ml，含0.5％十二烷基硫酸鈉和20mM EDTA)將表現出細胞病變效應的培養板中的細胞上清液處理60分鐘，用苯酚/氯仿提取，乙醇沉淀。通過PCR鑒定成功的轉化子，PCR使用了與CMV啟動子和SV40聚腺苷酸化序列互補以擴增插入物(預期為1.1kb片斷)的引物(生物技術15:868-872,1993)，和經設計可同時擴增腺病毒序列的引物(生物技術15:868-872,1993)。然后對成功的重組子進行兩輪噬斑純化。在293細胞中增殖病毒原種直至滴度為1010-1012個病毒顆粒，使用前通過兩次CsCl梯度離心進行純化。使用全長cDNA構建編碼β-半乳糖苷酶或FGF-5的重組腺病毒。用于產生重組腺病毒的系統最多可包裝5kb轉基因插入物。建議由CMV啟動子驅動并含SV40聚腺苷酸化序列的基因小于4kb，剛好處于包裝限制的范圍內。通過標準方法噬斑純化重組載體，在293細胞中增殖所得病毒載體直至滴度為1010-1012個病毒顆粒，感染80％鋪滿的細胞，36至48小時之后收獲細胞，凍融循環之后，通過標準離心方法沉淀細胞碎片，通過兩次CsCl梯度超離心(不連續的1.33/1.45 CsCl梯度在5mM Tris,1mM EDTA(pH7.8)中制備的銫；90,000×g(2小時)，105,000×g(18小時))進一步純化病毒。體內注射之前，通過Sepharose柱(如G25 Sephadex)進行凝膠過濾使病毒原種脫鹽。所得病毒原種最終的病毒滴度范圍為1011-1012個病毒顆粒。腺病毒構建體被高度純化，不含野生型(可能會復制的)病毒。實施例2細胞培養中的成年大鼠心肌細胞根據標準方法，通過用含有膠原酶的灌注液進行Langendorf灌注制備成年大鼠心肌細胞。在覆蓋有層粘連蛋白的培養板上培養桿狀細胞，24小時后用實施例1所得的編碼β-半乳糖苷酶的腺病毒感染細胞，感染復數為1:1。再過36小時之后，用戊二醛固定細胞并與X-gal保溫。用重組腺病毒感染之后，一般有70-90％成年心肌細胞表達β-半乳糖苷酶轉基因。當感染復數為1-2:1時，未觀察到細胞毒性。
對組織切片進行顯微分析(冠內注射含有lacZ的腺病毒96小時之后，LAD床的透壁切片)，結果表明在LAD冠狀動脈床中觀察到大量基因轉移，很多組織切片中50-60％以上細胞的β-半乳糖苷酶染色呈陽性。離LAD循環床很遠的心肌區域未見X-gal染色，可用作陰性對照，而在肌細胞和內皮細胞中觀察到基因的擴散表達。大多數肌細胞顯示出β-半乳糖苷酶活性(染成藍色)，在隨后使用閉胸冠內注射的研究中，基因轉移(n=8)14天后也發現類似活性。在基因表達的區域未見炎癥或壞死。
放置ameroid后35±3天開始研究，其時側血管生成和起博誘導的功能異常是穩定的(Roth等，美國生理學雜志，253:H1279-1288,1987和Roth等，循環，82:1778-1789)。將清醒的動物吊在懸帶上，以數字的形式在線記錄LV,LA和主動脈的血壓以及心電圖(休息時和心房以200bpm起博的過程中)。使用Hewlett Packard超聲顯像系統得到二維和M-模式圖像。在中乳頭肌肉水平上由右胸骨旁方法得到圖象并記錄在VHS磁帶上。記錄處于基礎狀態和右心房起博過程中(HR=200bpm)的動物的圖象。在基因轉移前1天進行這些研究，14±1天之后重復這一研究。基因轉移之前和之后，兩組的速率-壓力乘積和左心房壓力類似，這表明心肌氧需求和負荷狀況類似。使用標準化標準進行超聲心動圖的測定(Sahn等，循環58:1072,1978)。由5次連續的心跳測定舒張結束時血管壁的厚度(EDWTh)和收縮結束時血管壁的厚度(ESWTh)并取平均值。計算壁增厚的百分比(％WTh)[(EDWTh-ESWTh)/EDWTh]×100。在不知道動物接受了何種基因的情況下分析數據。為了闡明超聲心動測定結果的可重復性，連續2天對動物(n=5)進行顯像研究，結果顯示出高度的相關性(r2=0.90；p=0.005)。
放置ameroid后35±3天，在ameroid閉塞之后，但在基因轉移之前，使用在心房起博(200bpm)過程中注射至左心房的對比材料(Levovist)進行對比超聲心動研究。基因轉移后14±1天重復該研究。使用基于計算機的視頻分析程序(Color Vue Ⅱ,Nova Microsonics,Indianapolis,Indiana)由視頻影像測得峰對比強度，這樣可以客觀地測定視頻強度。在不知道動物接受了何種基因的情況下分析對比研究的數據。
研究結束時，麻醉動物，進行中線胸廓切開術。分離短頭動脈，插入插管，連接其它大血管。給動物靜脈內施用肝素(10,000IU)和罌粟堿(60mg)。施用氯化鉀以誘導舒張心停滯，交叉夾住主動脈。通過短頭動脈插管(120mmHg壓力)傳遞鹽水，籍此灌注冠狀動脈。灌注戊二醛溶液(6.25％,0.1M二甲胂酸鹽緩沖液)(120mmHg壓力)直至心臟被很好地固定(10-15分鐘)。然后取出心臟，使用順行注射至左前降動脈(LAD)，左旋動脈(LCx)和右冠狀動脈的顏色編碼染料鑒定血管床。檢查ameroid以證實閉塞，將取自正常灌注和缺血區域的樣品分成三份，用可塑性材料包埋取自心內膜和心外膜的三份樣品。按上文所述(Mathieu-Costello等，美國生理學雜志，369:H204,1990)進行顯微分析以定量毛細血管的數目。4個1微米厚的橫切片取自各個次生樣品(各個區域的心內膜和心外膜)，以400倍的放大倍數，使用點計數測定毛細血管數目/纖維數目的比率。每個次生樣品計數20至25個高強視野。在各個區域中，心內膜和心外膜的毛細血管與纖維數目的比類似，因此每個區域40至50個視野的平均值可提供跨壁毛細血管與纖維數目的比率。
為了確定改善的區域性功能和血流是由轉基因表達引起的，使用PCR和RT-PCR檢測接受FGF-5基因轉移的動物心肌中的轉基因FGF-5DNA和mRNA。使用針對CMV啟動子的有義引物[GCAGAGCTCGTTTAGTGAAC](SEQ ID NO:1)和針對內部FGF-5序列的反義引物[GAAAATGGGTAGAGATATGCT](SEQ ID NO:2),PCR擴增預期的500bp片斷。使用針對FGF-5序列起始部分的有義引物[ATGAGCTTGTCCTTCCTCCTC](SEQ ID NO:3)和針對內部FGF-5序列的反義引物[GAAAATGGGTAGAGATATGCT](SEQ ID NO:2),RT-PCR擴增預期的400bp片斷。
最后，使用針對FGF-5的多克隆抗體(Kitaoka等，科學，35:3189,1994)，在FGF-5基因轉移48小時以及14±1天之后，闡明接受FGF-5基因轉移的動物的細胞和心肌中的FGF-5蛋白表達。
使用按實施例1構建的不依賴于輔助病毒的復制缺損的人腺病毒5系統制備含有轉基因的載體。所需基因是lacZ和FGF-5。體內注射的制劑是高度純化的，不含野生型(有復制能力的)腺病毒。因此，心臟中的腺病毒感染和炎癥浸潤被最小化了。通過用冠狀動脈導管將制劑直接注射至冠狀動脈腔中，可以有效地靶向基因。當以此方式傳遞時，在肝細胞中未見轉基因表達，在冠內注射之后任何時間的尿液中都未發現病毒RNA。
在左和右冠狀動脈(流向LCx床的側血流似乎來自這兩個血管)中注射2.0ml以進行構建體注射(4.0ml含有約1011個腺病毒顆粒)。麻醉動物，通過切開右頸動脈獲得動脈入口；放置5F Cordis鞘。使用5F多用(A2)冠狀動脈導管插入冠狀動脈。通過對比注射至左主冠狀動脈進一步證實LCx ameroid的閉塞。然后將導管頭置入動脈腔內1cm以使注射過程中最少的制劑流失至近側主動脈。對每只豬實施這一方法。
一旦進行基因轉移，可使用3個策略建立成功的基因摻入和表達，(1)一些構建體包括報道基因(lacZ)；(2)取相關血管床的心肌樣品，并進行免疫印跡以定量FGF-5的存在；和(3)使用PCR測定FGF-5 mRNA和DNA。
圖2中的區域性收縮功能數據表明基因轉移之前以及14±1天之后，接受lacZ的豬的缺血區域顯示出類似程度的起博誘導的功能異常。相反，接受FGF-5基因轉移的豬的缺血區域在起博過程中血管壁的厚度增加了2.6倍(p=0.0001)。這些數據表明根據本發明的FGF-5基因轉移與起博過程中缺血區域改善的收縮有關。起博過程中正常灌注區域(室間隔)的壁厚度是正常的，不受基因轉移的影響(％壁增厚LacZ組基因轉移前，56±11％，基因轉移后，51±9％；FGF-5組基因轉移前，63±7％，基因轉移后，58±5％；沒有差異，方差的雙向分析)。獨立測定的數據重復性很高(側壁增厚r2=0.90；p=0.005)。相同模型的心房起博過程中通過經胸廓超聲心動描記法測定的功能降低的百分比與通過聲波測微法(sonomicrometry)測定的百分比降低非常類似(Hammond等，J Clin Invest 92:2644,1993)，顯示出超聲心動描記法評價缺血功能異常的準確性。圖2中的柱表示平均值，誤差柱表示1 SE。圖4A-4C是對應于心肌對比超聲心動描記法的圖。圖4A闡明了正常豬的急性LCx閉塞，其中LCx床中未見血流(黑色)，而膈(IVS)中血流增強(白色)，這表明影像準確地鑒定了LCx床，減少的血流與降低的對比增強有關。圖4B闡明了用lacZ基因轉移后14天IVS和LCx床之間對比增強的差異，顯示出心房起博過程中(200bpm)兩個區域中不同的血流。圖4C闡明了用FGF-5基因轉移后14天IVS和LCx床的對比增強近乎相同，顯示出心房起博過程中兩個區域中有類似的血流。
圖3概述了對所有動物的兩個區域的視頻強度進行的計算機分析。在圖3中，數據被表示為缺血區域(LCx床)峰視頻強度(心肌血流的相關值)/室間隔(IVS，通過未閉塞的左前降冠狀動脈接受正常血流的區域)峰視頻強度的比率。兩個區域血流相等時，該比率為1.0。基因轉移之前，該比率平均為0.5，表明LCx床的血流比室間隔中的血流顯著較少。圖3表明接受lacZ基因轉移的動物的缺血區域總是血流缺乏，而接受FGF-5基因轉移的動物的兩個區域顯示出均一的對比增強，增加了2倍的心肌血流改善了缺血區域的血流(p=0.0018，方差雙向分析)。柱表示平均值，誤差柱表示1 SE。
圖5中的柱形圖概述了顯微分析數據，顯示出與接受lacZ基因轉移的動物心臟的缺血區域和非缺血區域相比，接受FGF-5基因轉移的動物的相同區域中毛細血管數目/纖維數目的比率增加。柱表示每組5至6只動物的平均值，誤差柱表示1 SE,p值得自基因作用的方差雙向分析。在對治療組一無所知的情況下進行分析。
PCR擴增產物的電泳圖證實了用FGF-5基因轉移后14天，3只豬的LAD和LCx床中JM17-CMV-FGF-5 DNA(預期為500bp片斷)的存在。RT-PCR擴增產物的電泳圖證實了用FGF-5基因轉移后14天的LAD和LCx床中有心臟FGF-5 mRNA(預期為400bp片斷)的存在，而用lacZ基因轉移后沒有。另外，基因轉移2周后，經組織學檢查，所有5只lacZ感染動物的心肌樣品顯示出顯著的β-半乳糖苷酶活性。
最后，使用抗FGF-5的多克隆抗體對經培養的成纖維細胞的培養基進行免疫印跡，證實了用FGF-5(n=4個培養板)基因轉移之后2天有蛋白質表達和細胞外分泌，而用lacZ基因轉移之后沒有。還證實了在用FGF-5基因轉移之后14±1天心肌樣品中有蛋白質表達，而用lacZ(n=4)基因轉移之后卻沒有。
如上所述，可以類似的方法使用本領域已知的腺伴隨病毒載體和其它基因傳遞載體。實施例5使用血管活性劑增強基因傳遞如上所述，在本發明的一個方面，通過在用血管活性劑，如組胺共灌注或預灌注的情況下將載體傳遞至血管中，即可增強使用載體，如病毒載體進行基因傳遞的效力。
在例舉的實施例中，我們檢查了組胺(血管活性劑的一個例子)對使用上述表達lacZ報道基因的腺病毒載體(實施例1)進行的基因傳遞的作用。我們發現用組胺灌注冠狀動脈可顯著增加基因轉移的效力。
簡單地說，麻醉豬，經由右頸動脈得到動脈入口。將5個French多用導管置入右冠狀動脈(RCA)，并插入口內2cm。3分鐘內傳遞約3ml鹽水，然后快速地在約1.5分鐘內灌注2ml含有3×1011個病毒顆粒(vp)的表達lacZ的腺病毒。然后從RCA中取出導管，置入左前降冠狀動脈(LAD)中，再將導管頭插入LAD腔內2cm。插入之后，在3分鐘內傳遞3ml濃度為25微克組胺/ml的組胺，然后快速地在約2.25分鐘內灌注3ml含有4.5×1011個vp的表達lacZ的腺病毒溶液。一般情況下，在傳遞載體之前的幾分鐘內進行組胺灌注。組胺灌注過程中或之后，全身血壓、心率或心律基本上不變。取出導管，縫合頸部，使動物蘇醒。應指出的是，盡管灌注至LAD床的病毒顆粒的總數約為RCA床中的1.5倍(因為豬心臟中這些床的相對大小所致)，但病毒顆粒總數的增加更傾向于被靶床的相對大小抵銷，因為LAD床比RCA床約大2至3倍。
5天后，殺死動物。用低聚甲醛灌注心臟，由RCA區域和LAD區域得到透壁切片，將樣品與X-gal溶液(β-半乳糖苷酶的底物)保溫。16小時之后包埋材料，切片，放在載玻片上，用伊紅進行染色。
顯微分析揭示出LAD床比RCA床的基因轉移效力要高得多。尤其是，在不用組胺處理的情況下，約30％心肌細胞在冠內灌注之后表達lacZ。與之形成對照的是，LAD區域的幾乎所有的肌細胞都表達轉基因lacZ，這表明相對于對照區域而言，用血管活性劑處理過的區域中基因轉移的效力增加了幾倍。實際上，如本文所述，血管活性劑的使用導致基因幾乎完全傳遞至靶組織。
權利要求
1．體內靶向基因表達的方法，所述方法包括通過動脈內直接注射至供給組織或器官的動脈以傳遞載體，其中載體含有編碼欲在該動脈供給的血管床中表達的蛋白質的轉基因，其中所述動脈內注射與用血管活性劑灌注動脈同時進行或在用血管活性劑灌注動脈之后進行。
2．權利要求1的方法，其中在注射所述載體之前至少約2分鐘將所述血管活性劑灌注至動脈中。
3．權利要求1的方法，其中血管活性劑是組胺或組胺激動劑或血管內皮生長因子(VEGF)蛋白。
4．權利要求1的方法，其中血管活性劑是組胺或組胺激動劑。
5．權利要求1的方法，其中所述載體是病毒載體。
6．權利要求5的方法，其中所述病毒載體是復制缺損的腺病毒載體。
7．權利要求5的方法，其中所述病毒載體是腺伴隨病毒載體。
8．權利要求6的方法，其中通過注射傳遞約107至1013個腺病毒載體顆粒。
9．權利要求8的方法，其中通過注射傳遞約1011個腺病毒載體顆粒。
10．權利要求1的方法，其中所述轉基因與組成型啟動子可操作相連。
11．權利要求1的方法，其中所述轉基因與組織特異性啟動子可操作相連。
12．權利要求1的方法，其中所述轉基因與心室肌細胞特異性啟動子可操作相連。
13．權利要求12的方法，其中所述心室肌細胞特異性啟動子具有心室肌球蛋白輕鏈-2的序列。
14．權利要求12的方法，其中所述心室肌細胞特異性啟動子具有肌球蛋白重鏈啟動子的序列。
15．權利要求1的方法，其中所述轉基因編碼血管生成蛋白或肽。
16．權利要求15的方法，其中所述血管生成蛋白或肽選自aFGF,bFGF,FGF-4,FGF-5和VEGF。
17．權利要求1的方法，其中所述轉基因編碼血管生成蛋白或肽，其中通過冠內直接注射至一個或兩個冠狀動脈將載體傳遞至患者的心肌中，籍此促進所述患者心肌中冠狀側血管的生成。
18．權利要求17的方法，其中所述血管生成蛋白或肽選自aFGF,bFGF,FGF-4,FGF-5和VEGF。
19．權利要求17的方法，其中血管活性劑是組胺或組胺激動劑或血管內皮生長因子蛋白。
20．權利要求17的方法，其中血管活性劑是組胺或組胺激動劑。
21．權利要求17的方法，其中所述載體是病毒載體。
22．權利要求17的方法，其中所述病毒載體是復制缺損的腺病毒載體或腺伴隨病毒載體。
23．權利要求17的方法，其中所述冠內注射深入至左和右冠狀動脈腔內至少約1cm。
24．權利要求17的方法，其中除了冠狀動脈外，所述冠內注射還深入至隱靜脈移植物或乳房內部動脈移植物腔內至少約1cm。
25．權利要求17的方法，其中所述方法包括三次注射，一次注射至左前降冠狀動脈(LAD)，一次注射至左旋(LCx)冠狀動脈，一次注射至右冠狀動脈。
26．權利要求1的方法，其中所述轉基因編碼β-腎上腺素能信號傳導蛋白，其中通過冠內直接注射至一個或兩個冠狀動脈將載體傳遞至患者的心肌中。
27．權利要求26的方法，其中所述β-腎上腺素能信號傳導蛋白選自β-腎上腺素能受體(β-AR)，G-蛋白受體激酶抑制劑(GRK抑制劑)和腺苷酸環化酶(AC)。
28．權利要求26的方法，其中血管活性劑是組胺或組胺激動劑或VEGF。
29．權利要求26的方法，其中血管活性劑是組胺或組胺激動劑。
30．權利要求26的方法，其中所述載體是病毒載體。
31．權利要求26的方法，其中所述病毒載體是復制缺損的腺病毒載體或腺伴隨病毒載體。
32．權利要求26的方法，其中所述冠內注射深入至左和右冠狀動脈腔內至少約1cm。
33．權利要求26的方法，其中除了冠狀動脈外，所述冠內注射還深入至隱靜脈移植物或乳房內部動脈移植物腔內至少約1cm。
34．權利要求26的方法，其中所述方法包括三次注射，一次注射至左前降冠狀動脈(LAD)，一次注射至左旋(LCx)冠狀動脈，一次注射至右冠狀動脈。
35．權利要求1的方法，其中通過直接進入一個或兩個股動脈的股動脈內注射將載體導入外周血管系統。
36．權利要求35的方法，其中所述載體含有編碼血管生成蛋白或肽的轉基因，并在外周血管系統表達轉基因，籍此促進外周血管系統位點的血管生成。
37．權利要求35的方法，其中所述血管生成蛋白或肽選自aFGF,bFGF,FGF-4,FGF-5和VEGF。
38．權利要求35的方法，其中血管活性劑是組胺或組胺激動劑或VEGF。
39．權利要求35的方法，其中血管活性劑是組胺或組胺激動劑。
40．權利要求35的方法，其中所述載體是病毒載體。
41．權利要求35的方法，其中所述病毒載體是復制缺損的腺病毒載體。
42．權利要求35的方法，其中所述病毒載體是復制缺損的腺伴隨病毒載體。
全文摘要
通過將插入了轉基因的載體直接注射到為所靶向組織供血的動脈內,優選結合應用在傳遞載體之前或同時將血管活性劑灌注到該動脈內,可以對外周血管病、心臟病和其它狀況進行有效的體內基因治療。
文檔編號A61K35/76GK1301181SQ9980494
公開日2001年6月27日 申請日期1999年2月9日 優先權日1998年2月11日
發明者H·K·哈蒙德 申請人:加利福尼亞大學董事會