專利名稱：一種靈活產生形態各異性細胞模塊的方法及應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于微流控技術、材料化學、組織工程、再生醫學等領域，具體涉及一種靈活產生形態各異性細胞模塊的方法及應用。
背景技術：
組織工程及再生醫學是現在醫學、生物領域最為關注的熱點之一，而在體外模擬再生人體的功能組織在解決病人組織損傷、器官移植等問題中具有較大的潛力。近年來，在體外模擬再生人體的功能組織主要有兩種思路1、通過定向誘導克隆的方法使干細胞直接分化為特定組織器官；2、按照原始組織器官內細胞的空間分布，直接將細胞排列成相應組織的形狀。而細胞模塊(cell block)概念的出現，為第二種思路通過了一個有效可行的技術平臺。細胞模塊是指具有特定形狀三維支架并且在其內部或表面附著有細胞，將這些細胞模塊拼裝在一起，便可以體外模擬組織器官。現在產生細胞模塊的方法主要有兩種水凝膠定點曝光法及模具法。水凝膠定點曝光法是指將水凝膠類聚合物通過定點曝光的方法使其固化，形成特定形狀的模塊，再用于細胞培養(Yanan Du、Edward Lo elt. PNAS2008vol. 105no. 289522-9527)。但該方法的缺陷在于支架使用的材料有限，并且水凝膠類聚合物的生物相容性及可降解性與蛋白類材料相比較差。模具法即是指利用特定形狀的模具通過鑄模的方法得到相應形狀的模塊，但此方法的缺陷在于細胞模塊中常使用的材料機械強度較軟，其在模具中固化成型后難以完整的釋放出來。所以實際應用中，模具法產生的模塊形狀都比較簡單，如果要產生復雜模塊，則常常要選擇機械強度高但生物相容性略差的聚合物材料(Wonjae Lee and Jon ParkAdv. Mater. 2012vol. 24No. 395339-5344)。本發明涉及以一種可以主動釋放模具中細胞模塊的方法，用于廣泛材料的、形態復雜的細胞模塊的產生。
發明內容
本發明的目的是提供一種靈活產生形態各異性細胞模塊的方法及應用，該方法解決了現有模具法細胞模塊生成過程中材料可選擇范圍小、模塊完整性保持及釋放困難等問題；并且在體外組織重建及臨床組織修復中具有應用潛力。本發明提供了一種靈活產生形態各異性細胞模塊的方法，該方法的具體步驟如下——利用常規軟光刻的方法，產生具有特定通道結構的PDMS塊并且在通道結構的中間打孔，同時，將一塊彈性薄膜(10-100微米厚)與上述帶有結構的PDMS塊不可逆封接，作為模具的下層；—將一塊無結構的PDMS塊兩端打孔為加樣液池，作為模具上層，并通過PDMS聚合物間靜電力與下層模具可逆封接，形成完整模具；——在模具上層的加樣液池中加入膠體溶液；——在模具下層的氣孔中施加0. 02-0. 04MPa負壓，使夾在中間的PDMS薄膜產生形變，從而在模具上下兩層之間形成了而形成了空腔并產生負壓，負壓將兩端液池中的膠體溶液吸到通道中并注滿整個模具；
—模具空腔內的膠體溶液通過紫外曝光(用于水凝膠)、37度加熱(用于膠原)、 真空干燥(用于明膠)等方式固化，形成特定形狀的膠體模塊；
—將上層PDMS模具揭開，并且將下層模具氣路內的負壓變為O.03MPa正壓，使 PDMS薄膜向上凸起，將已固化的膠體模塊從通道中釋放出來；
——將膠體模塊作為細胞支架進行細胞培養，生成細胞模塊。
本發明提供的靈活產生形態各異性細胞模塊的方法，所述模具材料為PDMS，模具中的氣控薄膜材料為PDMS膜，保鮮膜、醋酸纖維素膜等彈性薄膜。其中，PDMS膜可以通過甩膠操作(1000-5000轉/分鐘，30秒)獲得；保鮮膜、醋酸纖維素膜可以從公司購買。PDMS 模具上的微結構由常規軟光刻方法制成；模具上微結構的樣子與尺寸決定了細胞模塊的形狀及尺寸。
本發明提供的靈活產生形態各異性細胞模塊的方法，所述的膠體溶液可以為明膠、膠原、聚乙二醇等生物相容性好并且可以在光照、加熱等特定條件下由液態轉變為固態的膠類聚合物。
本發明提供的靈活產生形態各異性細胞模塊的方法，所述制作過程可以實現膠體溶液的自動灌注與固化后膠體模塊的主動釋放。上述操作是通過控制模具間的一層PDMS 膜形變實現的。模具制作完成后，及結構分為上中下三層上層為帶有液池的PDMS蓋片； 中間層為PDMS薄膜；下層為帶有灌注通道及氣孔的PDMS底座。其中，中間的PDMS薄膜與上層PDMS蓋片間為可逆封接，且沒有縫隙；而PDMS薄膜與下層PDMS底座為不可逆封接， 且該薄膜在灌注通道處懸空，即留有空間。鑄模操作過程如下1、將膠體溶液加在上層蓋片的液池中，此時上層蓋片與中間的PDMS膜密封，液體不流動；2、在下層底座的氣孔中施加O. 02-0. 04MPa的負壓，是中間PDMS膜發生形變并貼附在下層灌注通道上，此時，在中間 PDMS膜與上層蓋片間出現了一個新的灌注通道且通道中為負壓；3、膠體溶液在負壓作用下流入灌注通道；4、在特定條件下使聚合物溶液固化；5、揭掉上層蓋片；6、將底座氣孔中的負壓改為O. 02-0. 04MPa的正壓，使PDMS膜向上凸起 ，釋放出模塊。從而完成了膠體溶液的自動灌注與固化后膠體模塊的主動釋放。
本發明提供的靈活產生形態各異性細胞模塊的方法，所述模塊可以在組織修復， 體外組織模擬中得到應用。在膠體模塊中，可以有兩種施加細胞的方法I、模塊生成后再接種細胞，形成細胞生長在外部的細胞模塊；2、在灌注模塊時直接灌注細胞膠體懸液，形成細胞生長在內部的細胞模塊。得到特定形狀的細胞模塊后，通過拼裝、組和、共培養等方法可以進行組織修復，體外組織模擬等研究。
本發明提供的靈活產生形態各異性細胞模塊的方法，其優點在于1、操作簡單快速；2、無需昂貴的儀器設備；3、模具可以重復使用，降低成本；4、產生模塊的形狀靈活可控；5、模塊主動釋放有利于保持其完整性；6、模塊可使用的材料廣泛；7、產生的模塊可以靈活的拼裝。
圖I.制作膠體模塊流程示意圖，其中，I灌注模具；2膠體固化；3、主動釋放；
圖2.聚乙二醇為材料制成模塊的實物圖，其中，a、齒輪結構；b、六角星結構；C、兩個齒輪結構進行拼裝；
圖3.明膠為材料制成模塊的實物圖，其中，a、熒光標記模塊實物表征圖；b、電鏡表征圖4.明膠模塊為支架外部進行細胞培養，其中，a、培養時間一天；b_c、培養時間5 天;
圖5.膠原材料內部生長細胞的細胞模塊，其中，a、40倍放大視野；b、100倍放大視
圖6.以明膠為材料的細胞模塊模擬拼裝人體內臟結構，其中，a、明場照片；b、熒光照片；c_d、腦、胃局部放大照片。
具體實施方式
下面的實施例將對本發明予以進一步的說明，但并不因此而限制本發明。
實施例I :
靈活產生形態各異性細胞模塊的方法，如圖I所示，其具體步驟如下
——利用常規軟光刻的方法，產生具有特定通道結構的PDMS塊并且在通道結構的中間打孔，同時，將一塊彈性薄膜(10-100微米厚)與上述帶有結構的PDMS塊不可逆封接， 作為模具的下層；
—將一塊無結構的PDMS塊兩端打孔為加樣液池，作為模具上層，并通過PDMS聚合物間靜電力與下層模具可逆封接，形成完整模具；
——在模具上層的加樣液池中加入膠體溶液；
——在模具下層的氣孔中施加O. 02-0. 04MPa負壓，使夾在中間的PDMS薄膜產生形變，從而在模具上下兩層之間形成了而形成了空腔并產生負壓，負壓將兩端液池中的膠體溶液吸到通道中并注滿整個模具；
——模具空腔內的膠體溶液通過紫外曝光(用于水凝膠)、37度加熱(用于膠原)、 真空干燥(用于明膠)等方式固化，形成特定形狀的膠體模塊；
—將上層PDMS模具揭開，并且將下層模具氣路內的負壓變為O.03MPa正壓，使 PDMS薄膜向上凸起，將已固化的膠體模塊從通道中釋放出來；
——將膠體模塊作為細胞支架進行細胞培養，生成細胞模塊。
實施例2
利用本發明方法進行聚乙二醇模塊的制作。按照實施例I中操作流程，通過紫外曝光的方法使10%的聚乙二醇溶液固化(10-100%都可以實現)，并釋放出來形成聚乙二醇模塊。如圖2所示，本方法產生的聚乙二醇模塊結構完整、邊緣整齊、并且可以用于制作較為復雜的微齒輪結構(600-1000微米)。另外制成的齒輪結構可以在顯微鏡下(20倍視野) 進行拼裝(圖2，C)。
實施例3
利用本發明方法進行明膠模塊的制作。按照實施例I中操作流程，通過真空干燥溶劑揮發的方法使30%的明膠溶液固化(20-100%都可以實現)，并釋放出來形成明膠模塊。 如圖3所示，本方法產生的明膠模塊結構完整、邊緣整齊、并且可以靈活制作各種形狀的明膠模塊(模塊直徑800微米，環形邊寬100微米)。進一步顯示出了本發明的優勢及可行性。實施例4 支架外部生長細胞的細胞模塊。如圖4所示，本發明制成的明膠模塊后可以用于細胞培養形成細胞模塊。在接種第I天時，細胞粘附在模塊表面并開始生長(圖4、a) ；5天后細胞大量增殖，在模塊外圍形成了一圈上百微米厚的細胞實體膜(圖4、b)，顯示出了明膠模塊優秀的生物相容性。另外，從圖4、c中可以發現，5天后，細胞向模塊空心圓環處生長，并且有將其填滿的趨勢，顯示出了該模塊在組織損傷修復研究中的潛力。實施例5 支架內部生長細胞的細胞模塊。本發明在制作膠原模塊時，在無菌條件下，直接將細胞的膠原懸液加入到模具內，37度半小時膠原固化后形成了內部生長有細胞的細胞模塊。如圖5所示，膠原模塊內部的細胞生長狀態良好，并且表現出了典型的三維培養形態。 實施例6 體外細胞模塊組裝。如圖6所示，以明膠為材料的細胞模塊模擬拼裝出人體內臟結構。利用本發明方法得到各種內臟形狀的明膠模塊，并用于細胞培養形成細胞模塊。在顯微鏡下(20倍視野)將其組裝成人體內臟的結構，顯示出了本方法在組織體外組裝重建中的潛力。
權利要求
1.一種靈活產生形態各異性細胞模塊的方法，其特征在于該方法的具體步驟如下 ——利用常規軟光刻的方法，產生具有特定通道結構的PDMS塊并且在通道結構的中間打孔，同時，將一塊彈性薄膜與上述帶有結構的PDMS塊不可逆封接，作為模具的下層； ——將一塊無結構的PDMS塊兩端打孔為加樣液池，作為模具上層，并通過PDMS聚合物間靜電力與下層模具可逆封接，形成完整模具； ——在模具上層的加樣液池中加入膠體溶液； ——在模具下層的氣孔中施加O. 02-0. 04MPa負壓，使夾在中間的PDMS薄膜產生形變，從而在模具上下兩層之間形成了而形成了空腔并產生負壓，負壓將兩端液池中的膠體溶液吸到通道中并注滿整個模具； ——模具空腔內的膠體溶液通過固化，形成特定形狀的膠體模塊； ——將上層PDMS模具揭開，并且將下層模具氣路內的負壓變為O. 03MPa正壓，使PDMS薄膜向上凸起，將已固化的膠體模塊從通道中釋放出來； ——將膠體模塊作為細胞支架進行細胞培養，生成細胞模塊。
2.按照權利要求I所述靈活產生形態各異性細胞模塊的方法，其特征在于所述特定通道結構的PDMS塊中通道的形狀根據不同實驗的需要自行設計加工。
3.按照權利要求I所述靈活產生形態各異性細胞模塊的方法，其特征在于所述彈性薄膜為PDMS膜、保鮮膜、醋酸纖維素膜中的至少一種。
4.按照權利要求I或2所述靈活產生形態各異性細胞模塊的方法，其特征在于所述彈性薄膜的厚度為10-100微米。
5.按照權利要求I所述靈活產生形態各異性細胞模塊的方法，其特征在于所述彈性薄膜與帶有結構的PDMS塊不可逆封接的方法有等離子體處理或PDMS膠水粘貼方式。
6.按照權利要求I所述靈活產生形態各異性細胞模塊的方法，其特征在于所述的膠體為明膠、膠原或聚乙二醇水凝膠一些生物相容性好并且在特定條件由液態轉變為固態的膠類聚合物。
7.按照權利要求I所述靈活產生形態各異性細胞模塊的方法，其特征在于所述膠體溶液固化的方式有紫外曝光、加熱或真空干燥。
8.權利要求I所述方法產生的細胞模塊的應用，其特征在于每個細胞模塊都能生長不同種類的細胞并且進行組裝，在組織工程及再生醫學領域得到應用。
全文摘要
一種靈活產生形態各異性細胞模塊的方法及應用，本發明以聚二甲基硅氧烷(PDMS)芯片上的微通道為模具，通過灌注、固化的方法產生明膠、膠原、聚乙二醇等具有生物相容性膠類聚合物的模塊，并且將該模塊作為細胞生長的支架應用于組織的體外組裝及修復；同時，本發明在微模具內引入了氣壓可控的PDMS薄膜結構，可以將其內部產生的模塊進行主動釋放。本發明可以簡單、快速、靈活的產生各種形態的可固化膠類聚合物模塊，并且使其從模具中主動釋放，有利于保持這些模塊結構的完整性；期望提供一種靈活可控的細胞支架生成方法，并且在組織工程及再生醫學中得到應用。
文檔編號A61L27/38GK102978151SQ201210439689
公開日2013年3月20日 申請日期2012年11月6日 優先權日2012年11月6日
發明者秦建華, 張旭, 孟昭旭, 馬靜云 申請人:中國科學院大連化學物理研究所