專利名稱：一種復合人工膽管及其制備方法
技術領域：
本發明涉及一種復合人工膽管及其制備方法。
背景技術：
肝外膽管是膽汁下行的唯一通道，在臨床上，膽管腫瘤、膽管損傷、膽管先天畸形等疾病以及肝臟移植治療中，通常采用膽腸吻合手術。該手術能疏通膽道，但手術改變了膽道的正常生理途徑，會使Oddi括約肌功能喪失，術后易發生逆行感染、吻合口狹窄等并發癥。因此，可用于臨床治療的人工膽管的開發和研究具有非常重要的現實意義。目前，用于制作人工膽管的材料種類甚多，根據材料的降解性，可分為非降解性材料和可降解性材料兩大類。較為常見的非降解材料均為人工合成的無生物活性的材料，有硅橡膠、聚氨酯、氟橡膠、聚四氟乙烯等。申請號200810033513. 7，發明名稱“插入式內外壁雙重結構聚四氟乙烯人工膽管及其制備”的專利申請公開了一種插入式外壁雙重結構聚四氟乙烯人工膽管的制備方法，該人工膽管采用兩層高分子材料復合而成，內層為聚四氟乙烯軟管，外層為化學纖維以針織工藝編織而成。申請號200710170515. 6，發明名稱“一種聚四氟乙烯/氟橡膠復合人工膽管及其制備方法”的專利申請公開了一種人工膽管，該人工膽管是一種復合柔性管狀物，由內向外依次為聚四氟乙烯薄膜內膽基層，萘-鈉-四氫呋喃溶液處理層和氟橡膠澆鑄層。非降解材料不可降解且力學性能與正常組織有較大差異，無法支持細胞生長和組織重建，只能作為短期的膽管替代物使用，不能長時間用于體內。生物可降解材料可在組織修復的同時降解，生成無生物毒性的小分子物質，并隨細胞代謝排出體外，為人工膽管的研發開辟了一條新的途徑。常見的降解材料有人工合成的高分子聚合物材料，如，聚己內酯，也有天然材料，如甲殼素、殼聚糖和天然脫細胞基質。人工合成的可降解材料具有良好的降解性，但無法支持細胞生長和組織重建，體內修復效果不夠好。天然脫細胞基質材料具有良好的可降解性和生物相容性，并含有可促進細胞生長和組織修復的細胞因子，其在組織工程中應用的研究受到了廣泛的關注。Rosen 等人，“Rosen M, Ponsky J, Petras R, et al. Novel bile ductrepairfOrbleed ing biliary anastomatic varices: case report and literaturereview”, JGastrointest Surg, 2005, 9(2) : 832應用常用的脫細胞基質材料-小腸粘膜下層(Small intestinal submucosa, SIS)修復夠膽道獲得成功。SIS植入5個月后完全降解，為再生的膽管組織所取代，再生的膽管組織周圍纖維組織增生反應極輕微。但是Gomez等，uComez NA, Zapafier JA, Vargas ΡΕ· Re :“Smallintestinal submucosa as a bioscafoldfor biliary tract regeneration”，Surgery, 2004，135 (4) :460對其研究結果提出質疑，認為SIS用于修復膽管缺損，會產生膽汁滲漏引起組織粘連，強烈的免疫反應引發的炎癥，以及其他復雜的問題。根據申請人研究，單獨使用膽管脫細胞基質修復膽道缺損，也會產生膽汁滲漏引起組織粘連，出現膽道狹窄，且有強烈的免疫反應引發的炎癥，最終引起實驗動物死亡。
發明內容
為了解決上述問題，本發明提供了一種由人工合成材料和天然材料形成的新的復合人工膽管及其制備方法。本發明復合人工膽管，它是內外表面涂覆有可降解高分子聚合物材料的管狀脫細胞基質，其中，脫細胞基質內表面上每平方厘米均勻分布疒20mg可降解高分子聚合物材料，外表面上每平方厘米均勻分布(T20mg可降解高分子聚合物材料。所述管狀脫細胞基質，是指形狀為管狀的脫細胞基質，如豬，猴等哺乳動物的膽管、尿道或血管的脫細胞基質。優選地，脫細胞基質外表面上每平方厘米均勻分布2 20mg可降解高分子聚合物材料。其中，所述人工膽管各處的直徑相同，為ri3mm。·優選地，所述人工膽管為圓柱形，直徑為ri3mm;或者為圓臺形，小底面直徑為4"!3mm,大底面直徑最多比小底面直徑大2mm。其中，所述人工膽管長10 150mm,管壁厚度為O. 5 2mm。優選地，所述可降解高分子聚合物材料為聚氨酯或者聚乙醇酸。優選地，所述聚氨酯的分子量為2飛萬g/mol，所述聚乙醇酸的分子量為3飛萬g/mol ο本發明聚氨酯是可降解性聚氨酯，可以按照專利號ZL 200610022715. 2，發明名稱“水性無毒可降解聚氨酯彈性體的制備方法”的專利記載的方法制備。本發明人工膽管的制備方法，它包括如下步驟(I)取前述配比的管狀脫細胞基質和可降解高分子聚合物材料；(2)將管狀脫細胞基質，套入不沾模具上，冷凍干燥；所述不沾磨具為圓柱形，直徑與脫細胞基質直徑相同；或者為圓臺形，小底面直徑與脫細胞基質直徑相同，大底面直徑最多比小底面直徑大2mm ；(3)取可降解高分子聚合物材料，制成濃度為5 20wt%的乳液，涂覆步驟(2)處理后的管狀脫細胞基質，3(T37°C干燥，滅菌，即可。不沾模具，是指與脫細胞基質不粘連的模具。其中，步驟(I)所述可降解高分子聚合物材料為聚氨酯或者聚乙醇酸。其中，所述聚氨酯的分子量為2-5萬g/mol，所述聚乙醇酸的分子量為3_5萬g/mol ο其中，步驟(2)所述不沾模具采用四氟乙烯材料制備而成。其中，所述步驟(3)中，聚氨酯溶液的濃度為15wt%。其中，所述步驟(3)中，干燥時的溫度為37°C。本發明復合人工膽管的免疫原性低，體內修復效果優良，可克服傳統人工膽管的缺陷，具有良好的臨床應用前景。顯然，根據本發明的上述內容，按照本領域的普通技術知識和慣用手段，在不脫離本發明上述基本技術思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更。以下通過實施例形式的具體實施方式
，對本發明的上述內容再作進一步的詳細說明。但不應將此理解為本發明上述主題的范圍僅限于以下的實例。凡基于本發明上述內容所實現的技術均屬于本發明的范圍。
圖I復合人工膽管支架橫截面示意圖；
圖2復合人工膽管支架縱截面示意圖；圖3在45° C烘箱烘烤6小時后復合人工膽管的結構；圖4在20° C烘箱烘烤6小時后復合人工膽管的結構；圖5在37° C烘箱烘烤6小時后本發明復合人工膽管的結構；圖6復合人工膽管支架肌肉埋置試驗中的免疫原性檢測。A為脫細胞基質支架；B為聚氨酯；C為本發明人工膽管；圖7對照組修復膽道缺損的解剖圖；圖8本發明復合人工膽管移植入成年豬體內試驗結果。(A)正常膽管組織HE染色；(B)復合人工膽管修復90天后HE染色。
具體實施例方式實驗材料聚氨酯，按照專利號ZL 200610022715. 2，發明名稱“水性無毒可降解聚氨酯彈性體的制備方法”的專利記載的方法制備。聚乙醇酸，購自Aldrich。實施例I制備本發明復合人工膽管I、管狀脫細胞基質的制備取一根成年豬膽管，剔除膽管管腔組織周圍的脂肪和結締組織，剪切成長度為30mm長的管道,直徑4mm,厚1_ ;管道在PBS液中攪拌清洗2小時，在1%SDS溶液中浸泡攪拌24小時；取出PBS清洗2小時后在l%Triton_100溶液中浸泡攪拌24小時；脫細胞后的支架在PBS中清洗2小時，固定在大端直徑為6mm、小端直徑為4mm的聚四氟乙烯棒上，冷凍干燥后得到干燥的脫細胞基質支架。2、在干燥的脫細胞支架內表面涂覆濃度為5wt%的聚氨酯水乳液，控制管壁厚度為0.5mm，3(TC干燥72h，密封包裝，、射線滅菌，即得到本發明復合人工膽管，可用于修復直徑較小的病變膽管。實施例2制備本發明復合人工膽管I、管狀脫細胞基質的制備取一根成年豬膽管，剔除膽管管腔組織周圍的脂肪和結締組織，剪切成長度為IOmm長的管道,直徑6mm,厚2_ ；管道在PBS液中攪拌清洗2小時，在1%SDS溶液中浸泡攪拌24小時；取出PBS清洗2小時后在l%Triton_100溶液中浸泡攪拌24小時；脫細胞后的支架在PBS中清洗2小時，固定在大端直徑為8mm、小端直徑為6mm的聚四氟乙烯棒上，冷凍干燥后得到干燥的脫細胞基質支架。
2、在干燥的脫細胞支架內表面涂覆濃度為15wt%的聚氨酯水乳液，控制管壁厚度為lmm，37°C干燥24h，密封包裝，Y射線滅菌，即得到本發明復合人工膽管，可用于替代中等直徑的病變膽管。實施例3制備本發明復合人工膽管I、管狀脫細胞基質的制備取一根成年豬膽管，剔除膽管管腔組織周圍的脂肪和結締組織，剪切成長度為IOmm長的管道,直徑6mm,厚2_ ；管道在PBS液中攪拌清洗2小時，在1%SDS溶液中浸泡攪拌24小時；取出PBS清洗2小時后在l%Triton_100溶液中浸泡攪拌24小時；
脫細胞后的支架在PBS中清洗2小時，固定在直徑為6mm的圓柱形聚四氟乙烯棒上，冷凍干燥后得到干燥的脫細胞基質支架。2、在干燥的脫細胞支架內表面涂覆濃度為15wt%的聚氨酯水乳液，控制管壁厚度為lmm，37°C干燥24h，密封包裝，Y射線滅菌，即得到本發明復合人工膽管，可用于替代中等直徑的病變膽管。實施例4制備本發明復合人工膽管I、管狀脫細胞基質的制備取一根成年豬膽管，剔除膽管管腔組織周圍的脂肪和結締組織，剪切成長度為150毫米長的管道,直徑13mm,厚2mm ；管道在PBS液中攪拌清洗2小時，在1%SDS溶液中浸泡攪拌24小時；取出PBS清洗2小時后在l%Triton_100溶液中浸泡攪拌24小時；脫細胞后的支架在PBS中清洗2小時，固定在大端直徑為15mm、小端直徑為13mm的聚四氟乙烯棒上，冷凍干燥后得到干燥的脫細胞基質支架。2、在干燥的脫細胞支架內表面涂覆濃度為20wt%的聚乙醇酸水乳液，控制管壁厚度為2mm，35°C干燥48h，密封包裝，、射線滅菌，即得到本發明復合人工膽管，可用于替代較大直徑的病變膽管。實施例5制備本發明復合人工膽管I、管狀脫細胞基質的制備取一根成年豬膽管，剔除膽管管腔組織周圍的脂肪和結締組織，剪切成長度為100毫米長的管道,直徑8mm,厚2mm ；管道在PBS液中攪拌清洗2小時，在1%SDS溶液中浸泡攪拌24小時；取出PBS清洗2小時后在l%Triton_100溶液中浸泡攪拌24小時；脫細胞后的支架在PBS中清洗2小時，固定在大端直徑為10mm、小端直徑為8mm的聚四氟乙烯棒上，冷凍干燥后得到干燥的脫細胞基質支架。2、在干燥的脫細胞支架內表面和外表面涂覆濃度為12wt%的聚氨酯水乳液，控制管壁厚度為2mm，37°C干燥24h，密封包裝，Y射線滅菌，即得到本發明復合人工膽管，可用于替代中等直徑的病變膽管。實施例6溫度篩選實驗I、實驗方法(I)管狀脫細胞基質的制備
取一根成年豬膽管，剔除膽管管腔組織周圍的脂肪和結締組織，剪切成長度為100毫米長的管道,直徑6mm,厚I. 5mm ；管道在PBS液中攪拌清洗2小時，在1%SDS溶液中浸泡攪拌24小時；取出PBS清洗2小時后在l%Triton_100溶液中浸泡攪拌24小時；脫細胞后的支架在PBS中清洗2小時，固定在大端直徑為8mm、小端直徑為6mm的聚四氟乙烯棒上，冷凍干燥后得到干燥的脫細胞基質支架。(2)在干燥的脫細胞支架內表面涂覆濃度為12wt%的聚氨酯水乳液，控制管壁厚度為1mm，分別在20°C、37°C和45°C干燥48h，密封包裝，Y射線滅菌，即得到復合人工膽管。2、實驗結果
結果如圖3 圖5所示，溫度為45°C時，溫度過高，支架結構被破壞；溫度為20°C時，溫度過低，局部較厚，聚氨酯在多孔支架表面涂層不均勻；溫度為37°C時，溫度合適，聚氨酯在管腔內壁形成均勻涂層，且支架結構完整。實驗說明，溫度過高或者過低均不能獲得涂覆了均勻可降解高分子聚合物材料的脫細胞基質，多次實驗發現，只有在溫度3(T37°C的范圍內，才可以獲得本發明人工膽管——涂覆了均勻可降解高分子聚合物材料的脫細胞基質。以下以實驗例的方式說明本發明的有益效果實驗例I本發明復合人工膽管的免疫原性檢測I、實驗方法將本發明實施例2制備的直徑8mm，厚2mm脫細胞基質支架和人工膽管，以及聚氨酯支架材料包埋于體重約2. 5kg的成年兔背部脊柱兩側背闊肌內。手術開始前，每只實驗動物注射40萬單位青霉素，動物背部手術部位備皮后腹腔注射3ml/kg的水合氯醛進行麻醉。在動物背部切開8-lOcm縱切口，在脊柱兩側切開肌肉包膜后露出背部肌肉，在包埋材料位置剪開Icm小口，將支架材料平整的置入其中。然后，5-0可吸收縫線間斷縫合，待動物蘇醒后置入飼養箱中飼養，并密切觀察動物狀態。材料植入后第一、二、三天給每只兔子注射40萬單位青霉素。于術后第7天，對實驗動物腹腔注射戊巴比妥鈉注射液(100mg/kg)處死。解剖取出移植標本及周邊組織，石蠟包埋切片進行HE染色，觀察移植標本與兔正常組織接觸部位炎癥細胞聚集狀況。2、實驗結果實驗結果如圖6所示，脫細胞基質材料與肌肉組織接觸部位有大量炎癥細胞聚集；聚氨酯支架材料上只能觀察到極少量的炎癥細胞；本發明復合人工膽管支架上也有炎癥細胞的聚集，但細胞數量較少。實驗結果說明本發明人工膽管的免疫原性低，與聚氨酯多孔支架相當，顯著低于脫細胞基質。實驗例2本發明復合人工膽管體內修復實驗I、實驗方法選用本地封閉群的內江豬，術前2. 5%戊巴比妥鈉(lml/kg)靜脈麻醉。游離膽總管，距十二指腸上緣Icm左右處切取約Icm膽總管，置入本發明實施例2制備的復合人工膽管，5-0可吸收縫線間斷縫合，針距I. 5mm，邊距I. 5mm。檢查吻合口有無膽汁滲漏，術中輸注O. 9%生理鹽水500ml加慶大霉素16萬U。術后當天動物禁食，靜脈補充10%葡萄糖液體和5%糖鹽水，術后第二天開始進食流汁或半流飲食，并逐漸過渡到正常飲食。移植后于90天對實驗動物實施腹腔內戊巴比妥鈉麻醉，解剖取出移植標本及周邊組織，用10%甲醛固定，進行HE染色。對照組游離膽總管，距十二指腸上緣Icm左右處切取約Icm膽總管，置入已消毒的實施例2制備的脫細胞基質支架，5-0可吸收縫線間斷縫合，針距I. 5mm，邊距I. 5mm。檢查吻合口有無膽汁滲漏，術中輸注O. 9%生理鹽水500ml加慶大霉素16萬U。術后當天動物禁食，靜脈補充10%葡萄糖液體和5%糖鹽水，術后第二天開始進食流汁或半流飲食，并逐漸過渡到正常飲食。2、實驗結果如圖7所示，對照組出現膽汁滲漏，造成周圍組織粘連，出現膽道狹窄，7天后死 亡。實驗組動物逐步恢復正常，實驗后未發生膽漏，未出現膽道狹窄，損傷處膽管逐步修復。移植后于90天HE染色的實驗結果如圖8所示，與正常膽管組織對照可知，本發明人工膽管修復膽道缺損以后，人工膽管支架已經發生降解，膽管細胞外基質已經形成，修復仍在繼續。實驗結果說明，本發明人工膽管修復膽管缺損的效果優良，不會出現膽汁滲漏導致的組織粘連以及膽道狹窄等副作用。本發明復合人工膽管免疫原性低，用于膽道缺損不會出現膽汁滲漏和膽道狹窄等副作用，體內修復膽道缺損的效果優良，臨床應用前景優良。
權利要求
1.一種復合人工膽管，其特征在于它是內外表面涂覆有可降解高分子聚合物材料的管狀脫細胞基質，其中，脫細胞基質內表面上每平方厘米均勻分布2 20mg可降解高分子聚合物材料，外表面上每平方厘米均勻分布(T20mg可降解高分子聚合物材料。
2.根據權利要求I所述的人工膽管，其特征在于脫細胞基質外表面上每平方厘米均勻分布2 20mg可降解高分子聚合物材料。
3.根據權利要求I或者2所述的人工膽管，其特征在于所述人工膽管為圓柱形，直徑為4 13mm ;或者為圓臺形,小底面直徑為4 13mm，大底面直徑最多比小底面直徑大2mm。
4.根據權利要求Γ3任意一項所述的人工膽管，其特征在于所述人工膽管長10 150mm,管壁厚度為O. 5 2mm。
5.根據權利要求I所述的人工膽管，其特征在于所述可降解高分子聚合物材料為聚氨酯或者聚乙醇酸。
6.根據權利要求5所述的人工膽管，其特征在于所述聚氨酯的分子量為2飛萬g/mol，所述聚乙醇酸的分子量為3飛萬g/mol。
7.一種制備權利要求f 6任意一項所述人工膽管的方法，其特征在于它包括如下步驟 (1)按照權利要求I或者2所述配比取管狀脫細胞基質和可降解高分子聚合物材料； (2)將管狀脫細胞基質，套入不沾模具上，冷凍干燥； 所述不沾磨具為圓柱形，直徑與脫細胞基質直徑相同；或者為圓臺形，小底面直徑與脫細胞基質直徑相同，大底面直徑最多比小底面直徑大2mm ； (3)取可降解高分子聚合物材料，制成濃度為5 20wt%的乳液，涂覆步驟(2)處理后的管狀脫細胞基質，3(T37°C干燥，滅菌，即可。
8.根據權利要求7所述的方法，其特征在于步驟(I)所述可降解高分子聚合物材料為聚氨酯或者聚乙醇酸。
9.根據權利要求8所述的方法，其特征在于所述聚氨酯的分子量為2-5萬g/mol，所述聚乙醇酸的分子量為3-5萬g/mol。
10.根據權利要求7所述的方法，其特征在于步驟(2)所述不沾模具采用四氟乙烯材料制備而成。
11.根據權利要求7所述的方法，其特征在于所述步驟(3)中，乳液的濃度為15wt%。
12.根據權利要求7所述的方法，其特征在于所述步驟(3)中，干燥時的溫度為37°C。
全文摘要
本發明公開了一種復合人工膽管，它是內外表面涂覆有可降解高分子聚合物材料的管狀脫細胞基質，其中，脫細胞基質內表面上每平方厘米均勻分布2~20mg可降解高分子聚合物材料，外表面上每平方厘米均勻分布0~20mg可降解高分子聚合物材料。本發明人工膽管免疫原性低，體內修復效果好，具有良好的臨床應用前景。
文檔編號A61L27/34GK102895702SQ20121044761
公開日2013年1月30日 申請日期2012年11月9日 優先權日2012年11月9日
發明者程南生, 蔣霞, 張 杰, 熊先澤, 林圯昕, 李富宇, 許瑞華, 陸燕蓉, 程驚秋 申請人:四川大學華西醫院