專利名稱：一種防治水產動物寄生蟲的中藥制劑及制備方法和應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于水產動物疾病防治(漁藥)技術領域，更具體涉及一種防治水產動物體外寄生蟲的中藥制劑，同時還涉及一種防治水產動物體外寄生蟲的中藥溶液劑的制備方法，還涉及一種防治水產動物寄生蟲的中藥制劑的應用。
背景技術：
魚類寄生蟲是水產養殖中的常見病、多發病，魚體被寄生蟲感染發病后，輕者體質消瘦，餌料系數上升，重者攝食、行動困難，甚至引起大面積死亡，給漁業生產造成重大損失，近年來，隨著養殖密度的增加，養殖水環境的惡化，魚類寄生蟲也呈多發、頻發、多樣及不易根治的趨勢。由于魚類寄生蟲疾病的危害日趨嚴重，化學合成藥物的大量應用，造成抗藥性、安全性、特種水產養殖動物的藥敏性以及對養殖生態環境條件的破壞等問題日益突出，而使得應用植物源殺蟲劑的呼聲越來越高。目前，作為經驗性的配方，利用天然植物防治魚類寄生蟲疾病，在水產養殖生產實踐中已得到一定程度的應用，如利用苦楝防治魚類棘頭蟲病；利用苦楝、毛莨合劑防治魚類指環蟲病；利用檳榔、貫眾防治魚類吸蟲、線蟲病等。但長期以來，植物源殺蟲劑在水產上的應用更多體現在口頭流傳和水產養殖習慣用法上，實際生產中由于對寄生蟲的生活史了解不夠，導致許多錯誤配方長期使用；同時由于對殺蟲植物的了解不夠，許多經驗性配方尚未真正發揮其優勢，因此，需尋找新的對環境無污染易降解的天然植物殺蟲藥以及從天然植物中分離殺蟲活性成分，進而進行仿生合成，更符合人類對健康的要求。同時，也有利于植物資源的合理利用和開發。經過多年研究發現，狼毒素對指環蟲等魚類寄生蟲具有很好的殺滅作用。狼毒大戟又名“東北狼毒”、“貓眼花根”、“狼毒”，為大戟科植物，主要分布于黑龍江、內蒙古、吉林、遼寧、河北等地，其全株有毒，用藥部分主要為根。狼毒大戟為多年生草本，高達40cm，有白色乳液。其昧辛，性平，有毒。入肺、肝、脾，具有逐水祛痰、散結殺蟲的功效。最新研究還發現，其具抗腫瘤、抗病毒、調節免疫等活作用。徐德昌等研究表明，O. 3%狼毒大戟水劑對甘監夜盜進行室內殺蟲實驗,殺蟲率達100%，用O. 3%狼毒大戟水劑500-650倍防治蔬菜桃蚜，效果為90%_97%，利用大戟狼毒浸提殘渣對蠐螬進行室內喂養殺蟲實驗，殺蟲率為100%。王彬等探討了植物狼毒大戟對釘螺及血吸蟲毛蝴的影響，狼毒大戟狼毒大戟根水煮液在濃度為2. 5g/L時經過24h，48h，72h浸殺釘螺的死亡率分別為36. 7%, 66. 7%, 93. 3%。而以70%乙醇提取液經過相同時間浸殺釘螺的死亡率分別為43. 3%, 86. 7%, 96. 7%。同時被狼毒大戟水煮液浸殺的釘螺體內糖原含量明顯下降，減少幅度從9. 61%到33. 60%，表明狼毒大戟通過影響釘螺的能量代謝而抑制其生長。
發明內容
本發明的目的在于提供一種防治水產動物體外寄生蟲的中藥制劑，性價比高，效果顯著，為植物源性藥物，能夠減少耐藥性發生幾率，解決化學殺蟲藥容易引起高耐藥性的問題，避免因高耐藥性而不斷增加藥物用量，降低對環境的污染。
本發明的另一目的是在于提供一種防治水產動物體外寄生蟲的中藥制劑的制備方法，該方法將狼毒大戟殺蟲活性成分分離出來，提高療效，且該方法易行，操作方便，尤其適用于當前水產養殖的集約化、規模化生產的需要。本發明還有一個目的是在于提供了一種防治水產動物寄生蟲的中藥制劑的應用。狼毒大戟提取物對鯽魚和草魚的安全濃度分別為2. 6Ippm和2. 38ppm,高于最佳有效濃度2倍多，說明該狼毒大戟提取物對魚類是比較安全的，可以應用于水產養殖生產中指環蟲的防治。為了達到上述目的，本發明采用以下技術措施一種防治水產動物體外寄生蟲的中藥溶液制劑，由下列組分按比例構成(g/ml)狼毒大戟乙酸乙酯分步提取物3-10g，乳化劑(0P-10或656-A)5-10g，穩定劑(丙二醇)l_3g,丙酮定容至100ml,所述試劑均為工業純。
一種防治水產動物體外寄生蟲病的中藥制劑，由下列組分按比例構成(最佳配比):狼毒大戟乙酸乙酯提取物5g，乳化劑(0P-10或656_A)5g，穩定劑(丙二醇)lg，溶齊U (丙酮)定容至IOOml。一種防治水產動物體外寄生蟲中藥溶液劑的制備方法，其步驟是1、稱取50g干燥的狼毒大戟(中藥飲片)粉碎至20目，用80%乙醇(v/v)進行索氏提取，收集提取液，回收乙醇，得到濃縮原液IOOml ；2、濃縮原液用石油醚萃取四次，每次200ml，分離石油醚層，留水相；3、水相用乙酸乙酯萃取五次，每次300ml，合并萃取液，于旋轉蒸發儀上蒸發乙酸乙酯，得到固體殘渣；4、步驟3)中的固體殘渣用少量80%乙醇(v/v)洗脫，于水浴鍋上揮發溶劑，得到褐色固形物，即狼毒大戟乙酸乙酯提取物；5、稱取3-10g提取物,用60ml丙酮完全溶解后,加5_10g的乳化劑和l_2g的穩定齊U，最后用丙酮定容到100ml。一種狼毒大戟提取物在制備防治水產動物體外寄生蟲病的中藥制劑的應用，實驗證明狼毒大戟提取物在O. 25ppm沒有殺蟲效果，在O. 5ppm顯示殺蟲效果；當濃度達到Ippm時,其殺蟲率可達到90%以上；當達到2ppm時,殺蟲率達到100%。甲苯咪唑在O. lppm、
O.2ppm、0. 4ppm時均未見明顯殺蟲效果，當濃度為O. 8ppm時,顯示有一定殺蟲效果但殺蟲率只有50%左右，且在第5天開始出現草魚、鯽魚死亡；甲苯咪唑1. 6ppm組，顯示有效果，但殺蟲率也不高，且隨著時間延長實驗魚死亡嚴重，未到第6d已全部死亡。從狼毒大戟和甲苯咪唑作用時間與效果看，二者在96h時殺蟲效果要好于48h時的殺蟲效果，說明，延長藥物作用時間可提高其殺蟲效果，但對于二者作用時間達到96h后，再延長時間，效果提高不明顯。狼毒大戟提取物對鯽魚和草魚的安全濃度分別為2. 6Ippm和2. 38ppm,高于最佳有效濃度2倍多，說明該狼毒大戟提取物對魚類是比較安全的，可以應用于水產養殖生產中指環蟲的防治。本發明與現有技術相比，具有以下優點和效果
A、首次將狼毒大戟應用于水產動物寄生蟲的防治中；B、采用分步提取法，將狼毒大戟中殺蟲有效成分分離出來，使效果更加顯著；C、為植物源性殺蟲劑，能夠解決化學殺蟲藥造成高耐藥性的問題；D、避免了化學藥物因耐藥性不斷增加用量的問題，從而減少對水域環境的污染。
具體實施例方式本發明所述試劑或原料，如未特別說明，市售均可使用。實施例1:
一種防治水產動物體外寄生蟲病的中藥制劑，其組成如下狼毒大戟乙酸乙酯提取物5g，乳化劑(0P-10或656-A) 5g，穩定劑(丙二醇)Ig,丙酮定容至100ml。其制備方法如下I)稱取50g狼毒大戟粉碎至20目，用80%乙醇(v/v)進行索氏提取(中華人民共和國藥典委員會.中華人民共和國藥典一部[S].北京化學工業出版社，2005.)，收集提取液，回收乙醇，得到濃縮原液約IOOml ；2)用石油醚萃取四次，每次200ml，分離石油醚層，留水相；3)水相用乙酸乙酯萃取五次，每次300ml，合并萃取液，于旋轉蒸發儀上回收乙酸乙酯得到固體殘渣；4)步驟3)中的固體殘渣用80%v/v乙醇洗脫，于水浴鍋上揮發溶劑，得到褐色固形物，即狼毒大戟乙酸乙酯提取物；6)先將5g的狼毒大戟乙酸乙酯提取物，用60ml丙酮完全溶解；7)溶解之后加入5g的乳化劑和Ig的穩定劑；8)混勻后用丙酮定容至100ml，混合均勻，最終制得防治水產動物寄生蟲中藥溶液劑。實施例2 一種防治水產動物體外寄生蟲病的中藥制劑，其組成如下狼毒大戟乙酸乙酯提取物3g，乳化劑^56_A)5g，穩定劑(丙二醇)lg，丙酮定容至IOOmlo其制備方法除原料重量不同外，同實施例1。實施例3 一種防治水產動物體外寄生蟲病的中藥制劑，其組成如下狼毒大戟乙酸乙酯提取物10g，乳化劑(0P-10) 10g，穩定劑(丙二醇)3g，丙酮定容至 IOOml ο其制備方法除原料重量不同外，同實施例1。實施例4 一種防治水產動物體外寄生蟲病的中藥制劑，其組成如下狼毒大戟乙酸乙酯提取物6. 5g,乳化劑(0P-10) 7. 5g,穩定劑(丙二醇)2g,丙酮定容至100ml。其制備方法除原料重量不同外，同實施例1。
實施例5 狼毒大戟乙酸乙酯提取物對魚類指環蟲的殺滅效果實驗I材料與方法1.1實驗藥物狼毒大戟乙酸乙酯提取物，見實施例1。1. 2實驗魚實驗用草魚、鯽魚均購自武漢市水產科學研究所漢南養殖基地，規格均一、健壯，草魚平均25g左右，鯽魚平均體重15g左右。按照指環蟲模型建立方法(王高學，徐鈺，王建華等.29種天然植物提取物對指環蟲殺滅作用的研究.淡水漁業，2006，36 (3) :3_8.)感染 本地中型指環蟲，當實驗魚鰓部中型指環蟲感染數量平均20 40個/尾時進行藥效實驗。1. 3濃度設定及殺蟲活性測定使用體積為50cmX40cmX40cm玻璃水族缸，盛人充分曝氣自來水，pH6. 5 7. 2，控制水溫(20±1) °C，分別投放感染有中型指環蟲的實驗魚40尾。根據狼毒大戟提取物預試結果,從O. 25ppm濃度開始按等倍關系設置5個濃度梯度(分別為0. 25ppm、0. 5ppm、lppm、2ppm、4ppm),甲苯咪唑從O.1ppm濃度開始按等倍關系設置5個濃度梯度(O. lppm、
0.2ppm、0. 4ppm、0. 8ppm>1. 6ppm)分別加入并攪拌均勻，然后在48h、96h、144h分別在每個實驗組及空白對照組隨機抽檢10尾實驗魚全鰓制片、鏡檢，觀察樣品在各實驗濃度及實驗時間下對指環蟲的殺滅效果，并統計計算殺蟲率，以及96h最低有效濃度、最佳有效濃度、最聞殺蟲率等。實驗重復3次,并設對照組。殺蟲率(％)=(對照組的指環蟲平均存活數量-實驗組的指環蟲平均存活數量)/對照組的指環蟲平均存活數量X100%殺蟲率在20% 30%的藥物濃度表示為最低有效濃度；殺蟲率在20%以下藥物濃度的表不為無效濃度；達到最聞殺蟲率且魚不中毒時為最佳殺蟲濃度，藥物濃度引起實驗魚側游無力以及死亡的濃度為藥物對魚的中毒濃度。1. 4殺蟲活性評價在設定殺蟲時間點取供試魚全鰓制片、鏡檢觀察并統計指環蟲從鰓部脫落情況，如果沒有脫落，觀察是否死亡，蟲體頭腺周圍口器在I 2min不發生收縮者，示為死亡，若鰓部無蟲或蟲已死亡均確定殺蟲率為100 ;如果部分脫落，統計每尾魚鰓部存活寄生蟲數量，計算平均值，并與對照組進行對比，計算殺滅率，以此來評價殺蟲效果。2結果與分析從表I表2可以看出狼毒大戟提取物在O. 25ppm沒有殺蟲效果，在O. 5ppm顯示殺蟲效果；當濃度達到Ippm時,其殺蟲率可達到90%以上；當達到2ppm時，殺蟲率達到100%ο甲苯咪唑在O. lppm、0. 2ppm、0. 4ppm時均未見明顯殺蟲效果，當濃度為O. 8ppm時,顯示有一定殺蟲效果但殺蟲率只有50%左右，且在第5天開始出現草魚、鯽魚死亡；甲苯咪唑
1.6ppm組，顯示有效果，但殺蟲率也不高，且隨著時間延長實驗魚死亡嚴重，未到第6d已全部死亡。從狼毒大戟和甲苯咪唑作用時間與效果看，二者在96h時殺蟲效果要好于48h時的殺蟲效果，說明，延長藥物作用時間可提高其殺蟲效果，但對于二者作用時間達到96h后，再延長時間，效果提高不明顯。表I狼毒大戟提取物對草魚指環蟲的殺滅效果實驗
權利要求
1.一種防治水產動物體外寄生蟲病的中藥制劑，由下列組分按比例構成狼毒大戟乙酸乙酯提取物3-10 g，乳化劑5-10 g，穩定劑1-3 g，丙酮定容至100 ml ；所述的乳化劑為=OP-1O或656-A ；所述的穩定劑為丙二醇；所述的一種防治水產動物體外寄生蟲病的中藥制劑，其制備過程是1)稱取50g干燥的狼毒大戟粉碎至20目，用80%乙醇v/v進行索氏提取，收集提取液，回收乙醇，得到濃縮原液100 ml ；2)用石油醚萃取四次，每次200ml，分離石油醚層，留水相；3)水相用乙酸乙酯萃取五次，每次300ml，合并萃取液，于旋轉蒸發儀上回收乙酸乙酯，得到固體殘渣；4)步驟3)中的固體殘渣用80%乙醇v/v洗脫，于水浴鍋上揮發溶劑，得到褐色固形物， 即狼毒大戟乙酸乙酯提取物；5)稱取3-10g步驟4)中得到的提取物，用60 ml丙酮完全溶解后，加5_10 g的乳化劑和1-2 g的穩定劑,最后用丙酮定容到100 ml ο
2.根據權利要求1所述的一種防治水產動物體外寄生蟲病的中藥制劑，由下列組分按比例構成狼毒大戟乙酸乙酯提取物5g,乳化劑5 g,穩定劑lg，丙酮定容至100 ml ο
3.權利要求1所述的一種防治水產動物體外寄生蟲病的中藥制劑，其狼毒大戟乙酸乙酯提取物在制備防治水產動物寄生蟲藥物中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種防治水產動物寄生蟲的中藥制劑及制備方法和應用，一種防治水產動物體外寄生蟲病的中藥制劑，其制備步驟是1)狼毒大戟用80%乙醇進行索氏提取，收集提取液；2)用石油醚萃取；3)用乙酸乙酯萃取，得固體殘渣；4)固體殘渣用乙醇洗脫，揮發溶劑得到狼毒大戟乙酸乙酯提取物；5)稱取3-10g步驟4)中得到的提取物，用丙酮完全溶解后，加5-10g的乳化劑和1-2g的穩定劑，丙酮定容100ml。該方法將狼毒大戟殺蟲活性成分分離出來，方法易行，操作方便，狼毒大戟提取物對鯽魚和草魚的安全濃度分別為2.61ppm和2.38ppm，對魚類是比較安全的，可以應用于水產養殖生產中水產動物體外寄生蟲病，適用于集約化、規模化水產養殖的需要。
文檔編號A61K36/47GK102988462SQ20121055451
公開日2013年3月27日 申請日期2012年12月19日 優先權日2012年12月19日
發明者艾桃山, 喻運珍, 高強林, 余姣龍, 余少梅 申請人:武漢中博水產生物技術有限公司