專利名稱：水產動物體外寄生蟲防治劑及其制備方法
技術領域：
本發明屬于水產養殖業中的一種殺蟲、防蟲劑，涉及一種防治劑，特別涉及一種以蛇床子提取物制備的水產動物體外寄生蟲防治劑。
背景技術：
水產動物寄生蟲防治，是水產養殖業經濟效益的重要保障措施。水產動物寄生蟲病發生率高、流行廣泛，其中危害性最大的體外寄生蟲有原蟲類如車輪蟲、小瓜蟲；蠕蟲類如指環蟲、三代蟲；甲殼動物如貓頭鲺等。當前，敵敵畏、乙酰甲胺磷、孔雀石綠、硝酸亞汞等殺蟲劑由于安全性差、污染環境和對人類潛在性的危害在水產上已被禁止使用。目前國內外防治水產動物寄生蠕蟲類病多采用化學藥劑如甲苯咪唑、吡喹酮、別丁、阿維菌素、福爾馬林、敵百蟲、擬除蟲菊酯、染料亞甲基藍、氧化劑高錳酸鉀和重金屬鹽等物質。首先，這些藥物一般均有強烈的刺激性或腐蝕性，使用后對水產動物的進食、生長有很大的影響，直接影響生產性能；另外，長期使用寄生蟲已經產生抗藥性；再有，這些物質在環境中不易降解，容易造成水源污染，其中一些物質還會造成生物富集，直接危及人類的食品安全和身體健康。隨著水產養殖業的發展，養殖集約化程度越來越高，水產養殖中的病害發生呈嚴重趨勢，而對常用的殺蟲藥物已產生了很高的抗藥性，因此，開發出高效、對環境無污染的無公害植物質水產動物寄生蟲防治劑就迫在眉睫。
在我國，水產動物病害防治中有時使用中草藥，關于藥效、藥理、毒性以及制劑等方面的研究才剛起步。利用中草藥進行水產動物病害防治與化學藥劑相比，有不影響水產品質量、無殘留、無污染、對其不易產生抗藥性、不影響水產動物的進食和生長、對水產動物安全等優點。
發明內容
本發明的發明目的是提供一種以蛇床子提取物制備的水產動物體外寄生蟲防治劑。
本發明的另一發明目的是提供上述水產動物體外寄生蟲防治劑的制備方法。
本發明采取的技術方案是一種水產動物體外寄生蟲防治劑，其特征在于，該防治劑由下列重量比的原料構成蛇床子提取物20％～75％，表面活性劑3％～10％，其余為溶劑，上述原料的總和為100％。
所述的表面活性劑是二甲基亞砜和吐溫-80混合物，其比例為3∶2或5∶1。
所述的溶劑為乙醇或本領域技術人員熟知的其他溶劑。
實現上述水產動物體外寄生蟲防治劑的制備方法，其特征在于，按以下步驟進行A.將蛇床子果實粉碎，在60℃～70℃溫度下用甲醇回流提取，濃縮提取液并蒸干甲醇呈流浸膏，用無水工業酒精萃取，濃縮萃取液至蛇床子果實干重的15％-25％，得蛇床子果實提取物；B.將表面活性劑、蛇床子果實提取物、乙醇按權利要求1的重量百分比加入勻質機中混合，溫度控制在50℃～60℃，加工后冷卻至常溫，即得蛇床子提取物水產動物體外寄生蟲防治劑。
本發明的使用法與用量直接潑灑于池塘中，使用劑量為2ml/m3。
經試驗證實，利用植物質進行水產動物病害防治與化學藥劑相比，有不影響水產品質量、無殘留、無污染、對其不易產生抗藥性、不影響水產動物的進食和生長、對水產動物安全等優點。本發明研制出純植物源的水產動物體外寄生蟲防治劑，試驗表明，該藥物對寄生在水產動物體外寄生蟲特別是指環蟲、擬指環蟲、三代蟲等蠕蟲具有顯著的殺滅作用，對水產動物及環境都非常安全，并且還有使用劑量低、成本小、使用方便等特點，在生產上完全可以替代化學殺蟲劑，對環境無污染的無公害植物質水產動物寄生蟲防治劑，廣泛適用于對鱖魚、鱸魚、鯉、草魚、鰻魚、鯛、鲆等多種淡水、海水魚類的體外寄生蟲(原蟲、蠕蟲)的防治劑。具有較好的社會和經濟效益。
具體實施例方式
為了更清楚的理解本發明以及本發明藥劑的藥效，以下通過發明人給出的依本發明技術方案所完成的具體的實施例對本發明作進一步的詳細描述，這些僅是本發明較好的實施例，但不限于這些實施例。
實施例1水產動物體外寄生蟲防治劑采用蛇床子果實經提取加工制得蛇床子果實提取物，所述的制劑的配方按下述質量百分比蛇床子果實提取物20份、表面活性劑5份，其余為乙醇或其他本領域熟知的溶劑，構成100份；表面活性劑為二甲基亞砜和吐溫-80的混合物，其比例為3∶2。
其制備方法是，稱取粉碎的蛇床子果實，在60～70℃溫度下，用甲醇回流提取，濃縮提取液并蒸干甲醇，提取物呈流浸膏狀，用無水工業酒精萃取，濃縮萃取液，獲蛇床子果實濃縮液；取果實濃縮液20kg，表面活性劑二甲基亞砜和吐溫-80混合物5kg，余為乙醇溶劑，加入勻質機中，溫度控制在50℃～60℃，加工后冷卻至常溫，即得寄生蟲防治劑100kg。
實施例2水產動物體外寄生蟲防治劑采用蛇床子果實經提取加工制得蛇床子果實提取物，所述的制劑的配方按下述質量百分比蛇床子果實提取物50份、表面活性劑5份，其余為乙醇或其他本領域熟知的溶劑，構成100份；表面活性劑為二甲基亞砜和吐溫-80的混合物，其比例為5∶1。制備方法同實施例1。
實施例3
水產動物體外寄生蟲防治劑采用蛇床子果實經提取加工制得蛇床子果實提取物，所述的制劑的配方按下述質量百分比蛇床子果實提取物75份、表面活性劑10份，其余為乙醇或其他本領域熟知的溶劑，構成100份；表而活性劑為二甲基亞砜和吐溫-80的混合物，其比例為5∶1。制備方法同實施例1。
實施例4水產動物體外寄生蟲防治劑采用蛇床子果實經提取加工制得蛇床子果實提取物，所述的制劑的配方按下述質量百分比蛇床子果實提取物40份、表面活性劑8份，其余為乙醇或其他本領域熟知的溶劑，構成100份；表面活性劑為二甲基亞砜和吐溫-80的混合物，其比例為3∶2。制備方法同實施例1。
實施例5水產動物體外寄生蟲防治劑采用蛇床子果實經提取加工制得蛇床子果實提取物，所述的制劑的配方按下述質量百分比蛇床子果實提取物60份、表面活性劑3份，其余為乙醇或其他本領域熟知的溶劑，構成100份；表面活性劑為二甲基亞砜和吐溫-80的混合物，其比例為3∶2。制備方法同實施例1。
上述實施例可以列舉很多，再此不一一列舉，從申請人所做的大量實驗得到的數據證明，只要是按照本發明的技術方案的參數范圍內選擇，即可制備出達到本發明目的的水產動物寄生蟲防治劑。
上述防治劑可直接潑灑于池塘中，使用劑量為2ml/m3，以下是本發明的藥效的具體試驗實例。
試驗實施例11.1材料預試驗健康金魚苗購于咸陽某漁場，體重在0.8～2g/尾；鰻魚由福建省福清市某鰻場提供。試驗用蛇床子浸膏有西安鴻生生物技術有限公司提供，蛇床子素含量有西安交通大學藥學院測定，含量為15.3％，用藥濃度按蛇床子素(mg)/水體(L)計。
1.2方法1.2.1指環蟲的感染由漁場運回后的魚苗，首先用2mg/L鹽酸環丙沙星進行細菌性疾病預防，通過3～5d養殖正常后，在水族箱中，采用特殊的方法將保存有指環蟲的魚鰓上的指環蟲感染到健康魚鰓上，并控制水溫25℃左右，每天加一定量的新水，大約經過4～6d培養，對感染魚隨機抽樣撈取鏡檢，如果感染率為100％、在10×4倍下每個視野內有6條以上指環蟲時便進行藥效試驗。
1.2.2藥效試驗試驗條件預試驗在實驗室進行，采用直徑36cm、高11cm的白色搪瓷盆，試驗用水為充分暴氣的自來水5000ml、PH值為7.0-7.5，試驗期水溫變化為25±2℃。藥效試驗在福建某鰻場，用多個相同的水族箱加充分曝氣的自來水1L，控制水溫25±2℃，PH值為7.0～7.5，放養魚后，含氧需在5mg/L以上。
試驗藥物濃度的確定和試驗分組首先通過梯度遞增法進行預試驗，再在最小有效濃度、完全殺滅寄生蟲有效濃度和最高有效劑量濃度范圍附近按梯度遞增的原則設立試驗組，并設對照組。每個水族箱內，放養隨機撈取感染的魚20尾，在加藥后24、48、72、96h時抽樣解剖，取鰓制片，鏡下觀察寄生蟲消失情況，并記錄。各試驗組重復3次。魚中毒死亡率＝該時間段魚死亡總數÷10尾×100％。
1.2.3急性毒性試驗試驗魚的準備由于鰻魚對藥物比較敏感，所以試驗用健康鰻魚，體重在2.1-2.5g(小于5g)，首先在試驗條件下養殖7d左右，每天投喂1-2次，投入的飼料在10min內吃完為限。待適應實驗室環境條件后再進行毒性試驗。
試驗條件試驗所用為靜水式條件，水族箱內盛1L充分瀑氣的自來水，控制水溫為25±1℃，PH值為7.3，硬度65.6mg/L，堿度41.5mg/L，溶氧量為8.67mg/L，放養魚后，要求保持水中溶氧在5mg/L以上。為了保持恒定的藥物濃度，每隔24小時換藥液一次。
試驗藥物濃度的設定首先，進行預備試驗，確定試驗液濃度的大致范圍，然后，再根據梯度遞增稀釋法設立0.95、1.05、1.15、1.25mg/L不同濃度的試驗組，在以上試驗的基礎上，在致死濃度1.05～1.15mg/L的范圍內按對數等差值(0.01)插入三個濃度試驗組(1.074、1.099、1.125mg/L)再次試驗，以更準確的確定其致死濃度范圍和毒性大小。試驗中用隨機的方法撈取培養魚10尾按低濃度向高濃度遞增的順序放入，并設對照組。試驗期間連續觀察并記錄各組96h內試驗魚的死亡時間。
最低致死濃度范圍、半數致死濃度(TLm)及安全濃度計算2、4、8、24～96小時內，金魚致死的最低濃度和下一個濃度為最低致死濃度范圍，并計算致死率。利用概率單位目測法，求出半數致死濃度TLm，并根據Turbell公式計算安全濃度安全濃度＝(48h TLm×0.3)/(24h TLm/48h TLm)22.結果2.1.1藥效預試驗在多個白色搪瓷盆中，分別設立0.1、0.3、0.6、0.9、1.2、1.5mg/L(相當于mg蛇床子素/L水體)不同濃度，在24h時，寄生蟲在0.1mg/L無效果，0.6mg/L魚全部鰓上寄生蟲存活1～3條，0.9mg/L以上時寄生蟲全部消失，1.2mg/L魚中毒死亡率達60％，從1.5mg/L以上，24h內試驗金魚全部死亡，對剛死亡的魚鏡檢，寄生蟲全部死亡；在48h時，寄生蟲在0.3mg/L有10～30％消失，0.6mg/L魚全部鰓上寄生蟲存活1～3條，0.9mg/L時魚中毒死亡10％，1.2mg/L魚中毒死亡80％，對剛死亡的魚鏡檢，寄生蟲全部死亡；在72h，0.3mg/L時魚全部鰓上寄生蟲存活0～3條；在96小時，0.3mg/L時魚全部鰓上寄生蟲存活0～2條。對照組殺蟲無效，并且金魚壞鰓指環蟲數量有所增加。(結果見表1)表1.蛇床子提取液殺滅指環蟲預試驗
注-表示無效果；+表示魚鰓有10～30％寄生蟲減少；++表示寄生蟲消失了50～70％；+++表示魚全部鰓上寄生蟲存活1～3條；++++寄生蟲全部消失死亡。
2.1.2藥效試驗根據預試驗，按歐鰻的擬指環蟲與金魚壞鰓指環蟲設2個試驗組。
試驗組1試驗材料為歐鰻的擬指環蟲。在多個水族箱中，按倍數遞增的方法分別使用0.10、0.20、0.30、0.40、0.50、0.60、0.70、0.80、0.90、1.00、1.10mg/L(相當于mg蛇床子素/L水體)，在24h時，寄生蟲在0.2～0.5mg/L僅存活1～3條，0.6mg/L以上寄生蟲全部死亡，鰻魚從1.0mg/L開始出現中毒死亡，到1.10mg/L死亡率分別為20％、50％；48時，從0.5mg/L以上寄生蟲全部死亡，從0.9mg/L鰻魚有中毒死亡，到1.10mg/L死亡率分別為10、40、90％；72h，從0.9～1.10mg/L死亡率分別為20、50、100％；在96小時，藥效開始減弱，無中毒魚死亡(結果見表2)。所做的對照試驗，經鏡檢發現，感染擬指環蟲數量在24、48、72、96h后有所增加。
表2.蛇床子提取液對歐鰻擬指環蟲按梯度遞增濃度的效果試驗
注-表示無效果；+表示魚鰓有10～30％寄生蟲減少；++表示寄生蟲消失了50～70％；+++表示魚全部鰓上寄生蟲存活1～3條；++++寄生蟲全部消失死亡。
試驗組2試驗材料為金魚壞鰓指環蟲.在多個水族箱中，按倍數遞增的方法分別使用0.10、0.20、0.30、0.40、0.50、0.60、0.70、0.80、0.90、1.00、1.10mg/L(相當于mg蛇床子素/L水體)，在24h時，寄生蟲在0.2～0.5mg/L僅存活1～3條，0.6mg/L以上寄生蟲全部死亡，金魚從1.0mg/L開始出現中毒死亡，到1.10mg/L死亡率分別為10％、20％；48時，從0.5mg/L以上寄生蟲全部死亡，從0.9mg/L金魚有中毒死亡，到1.10mg/L死亡率分別為10、30、40％；72h，從0.9～1.10mg/L死亡率分別為20、50、60％；在96小時，藥效開始減弱，無中毒魚死亡(結果見表2)。所做的對照試驗，經鏡檢發現，感染指環蟲數量在24h、48h、72h、96h后有所增加。
表2.蛇床子提取液對金魚指環蟲按梯度遞增濃度的效果試驗
注-表示無效果；+表示魚鰓有10～30％寄生蟲減少；++表示寄生蟲消失了50～70％；+++表示魚全部鰓上寄生蟲存活1～3條；++++寄生蟲全部消失死亡。
2.2.急性毒性試驗2.2.1鰻魚中毒反應在高濃度(1.25mg/L)試驗液中鰻魚中毒反應非常明顯，用藥后1h左右出現異常表現，鰻魚將頭竄出水面，或側身在水底狂游，不久后開始出現麻痹，繼而失去平衡，腹部朝上而死。低濃度試驗液中(如0.95mg/L等濃度)，鰻魚安靜，無應激反應，活動正常。
2.2.2最低致死濃度范圍和致死率鰻魚在第2、4h最低致死濃度范圍分別1.15～1.25mg/L和1.05～1.074mg/L，從第8h后降為0.95～1.05mg/L，致死率分別為100％、10％、20％、20％，在第24h到第96h致死率和最低致死濃度范圍與第8小時相同。(見表4)。
表4.蛇床子提取液各濃度對鰻魚的毒性反應
2.2.3半數致死濃度TLm和安全濃度利用概率單位目測法求第8小時半數致死濃度TLm為1.0965mg/L，第24-96小時的半數致死濃度TLm為1.0789mg/L。
計算Lc50的95％可信限
X是概率單位5.0處對應的濃度對數，2s是概率單位4.0與6.0處相應兩個濃度對數的差，N為概率單位3.5～6.5范圍內各組動物的總數[3]。
第8h ＝1.0845～1.1086mg/L第24～96h ＝1.0620～1.0962mg/L蛇床子素對鰻魚安全濃度計算根據Turbell公式計算安全濃度安全濃度＝(48h TLm×0.3)/(24h TLm/48h TLm)2＝1.0789×0.3＝0.3237mg/L3結論3.1近年來，鰻用殺蟲劑局限在咪唑類藥物，開發面極其狹窄，開發的藥物趨同化也造成了病原對藥物的抗藥性的時間迅速提前，大大減弱了防治效果[4]。本次試驗通過從80多種植物提取物進行的殺滅指環蟲的藥效來看，天然植物蛇床子其有效提取成分蛇床子素有著顯著的殺蟲效果，而且用量低，有效使用濃度為0.2～0.6mg/L。同時，由于蛇床子素為植物提取物，抗藥性極低，藥用年限長。
3.2蛇床子素可以用來殺滅指環蟲，對水生動物安全性高。因而，今后進一步純化，或與其它藥物進行合理配伍，以增強藥效，降低毒性。為了提高我國水產品在世界上的競爭力，為了滿足人類對“綠色水產品”的要求，應加快綠色、環保、無公害漁藥的開發和研制。本試驗所采用的蛇床子素為純天然植物蛇床子提取物，它副作用小，無殘留，不污染環境，對人類健康無害，是一種新型的綠色、環保、無公害漁藥。
由于傳統漁藥自身存在的種種缺陷以及對人類健康的潛在威脅，一些國家已將魚病防治的重點逐步轉向新型無公害漁藥開發。我國傳統中藥近年來在魚病防治中的地位日見突起，其療效好，毒副作用低的特點引起魚病界的關注。因而，如何進一步提取植物中的有效成分，增強其防治效果，進行新型無公害漁藥開發將是今后的工作重點。
參考文獻1.農業部《漁藥手冊》編撰委員會.漁藥手冊.北京中國科技出版社，1998；2.邢華.漁藥發展概況 中國水產，1996，(1)24-25；3.國家環保局《水和廢水監測分析方法》編委會編.水和廢水監測分析方法.北京中國環境科學出版社；4.李學貴 凌偉專.幾種藥物對歐洲鰻鱺毒性及對擬指環蟲病治療效果的觀察.福建水產，1997，(3)25-32；5.醫學院衛生學教研室 衛生毒理實驗方法.人民出版社，1980；6.趙文 孫兆和.精養條件下歐洲鰻的病害及防治.國外水產，1995，(4)20-24湖南。
試驗實施例2蛇床子素制劑對魚類指環蟲擬指環蟲殺滅試驗1.1材料預試驗用健康金魚苗購于咸陽某漁場，體重在0.8～2g/尾；鰻魚由福建省福清市某鰻場提供。試驗用藥為實施例1中寄生蟲防治劑。
1.2方法1.2.1指環蟲的感染由漁場運回后的金魚苗，首先用2mg/L鹽酸環丙沙星進行細菌性疾病預防，通過3～5d養殖正常后，在水族箱中，采用一定的方法將保存有指環蟲的魚鰓上的指環蟲感染到健康魚鰓上，并控制水溫25℃左右，每天加一定量的新水，大約經過4～6d培養，對感染魚隨機抽樣撈取鏡檢，如果感染率為100％、在10×4倍下每個視野內有6條以上指環蟲時便進行藥效試驗。
鰻魚由福建省福清市某鰻場空運到試驗室，平均體重3.5g/尾，經檢查感染率為100％、在10×4倍下每個視野內有10條以上擬指環蟲。
1.2.2藥效試驗試驗條件預試驗在實驗室進行，采用直徑36cm、高11cm的白色搪瓷盆，試驗用水為充分曝氣的自來水5000ml、pH值為7.0-7.5，試驗期水溫變化為25±2℃。用多個相同的水族箱加充分曝氣的自來水1L，控制水溫25±2℃，pH值為7.0～7.5，放養魚后，含氧需在5mg/L以上。
試驗藥物濃度的確定和試驗分組首先通過梯度遞增法進行預試驗，再在最小有效濃度、完全殺滅寄生蟲有效濃度和最高有效劑量濃度范圍附近按梯度遞增的原則設立試驗組，并設對照組。每個水族箱內，放養隨機撈取感染的魚20尾，在加藥后24、48、72、96h時抽樣解剖，取鰓制片，鏡下觀察寄生蟲消失情況，并記錄。各試驗組重復3次。
1.3試驗結果1.3.1依照1.2.2的方法，進行藥效試驗，結果見表1。藥液濃度以制劑的濃度計。
表1 48h時殺蟲制劑防治水產動物寄生蟲藥效結果
本發明在篩選了大量植物的基礎上，研制出純植物源的水產動物體外寄生蟲防治劑，試驗表明，該藥物對寄生在水產動物體外寄生蟲特別是指環蟲、擬指環蟲、三代蟲等蠕蟲具有顯著的殺滅作用、對水產動物及環境安全，并且使用劑量低、成本小、使用方便等特點，在生產上完全可以替代化學殺蟲劑，來用于水產動物體外寄生蟲病的防治。
權利要求
1.一種水產動物體外寄生蟲防治劑，其特征在于，該防治劑由下列重量比的原料構成蛇床子提取物20％～75％，表面活性劑3％～10％，其余為溶劑，上述原料的總和為100％。
2.如權利要求1所述的水產動物體外寄生蟲防治劑，其特征在于，所述的表面活性劑是二甲基亞砜和吐溫-80混合物，其比例為3∶2或5∶1。
3.如權利要求1所述的水產動物體外寄生蟲防治劑，其特征在于，所述的溶劑為乙醇。
4.實現權利要求1所述的水產動物體外寄生蟲防治劑的制備方法，其特征在于，按以下步驟進行A.將蛇床子果實粉碎，在60℃～70℃溫度下用甲醇回流提取，濃縮提取液并蒸干甲醇呈流浸膏，用無水工業酒精萃取，濃縮萃取液至蛇床子果實干重的15％-25％，得蛇床子果實提取物；B.將表面活性劑、蛇床子果實提取物、乙醇按權利要求1的重量百分比加入勻質機中混合，溫度控制在50℃～60℃，加工后冷卻至常溫，即得蛇床子提取物水產動物體外寄生蟲防治劑。
全文摘要
本發明公開了一種蛇床子提取物水產動物體外寄生蟲防治劑及其制備方法。制劑是由蛇床子(Cnidium monnieri (L.)Cuss)果實提取物、乙醇等溶劑、表面活性劑組成。制備方法將粉碎的蛇床子果實在60～70℃溫度下，用甲醇回流提取，用甲醇回流提取，濃縮提取液，用無水工業酒精萃取，得濃縮萃取液。將表面活性劑、乙醇等溶劑、蛇床子果實提取物于勻質機中混合，溫度控制在50℃～60℃，加工后冷卻至常溫，得該制劑。對寄生在水產動物體外寄生蟲特別是指環蟲、擬指環蟲、三代蟲等蠕蟲具有顯著的殺滅作用，無污染、不易產生抗藥性、不影響水產動物進食和生長、使用劑量低、成本小、方便，替代化學殺蟲劑，用于多種淡、海水魚等水產動物寄生蟲的防治。具有較好的社會和經濟效益。
文檔編號A61P33/00GK1682893SQ20051004173
公開日2005年10月19日 申請日期2005年3月1日 優先權日2005年3月1日
發明者王高學, 趙云奎, 楊正偉, 莊益明, 馬秋麗, 程超 申請人:西北農林科技大學, 常州市武進動物藥品廠