一種具備疏密結構的細菌纖維素皮膚修復材料及其制備方法

專利名稱：一種具備疏密結構的細菌纖維素皮膚修復材料及其制備方法
技術領域：
本發明涉及一種具備疏密結構的細菌纖維素皮膚修復材料及其制備方法，特別是涉及一種具有梯度疏密結構的細菌纖維素皮膚修復材料及其制備方法，具體地說是一種通過調節培養液上方空氣整體氣壓以及氧氣分壓來實現細菌纖維素薄膜的上密下疏的雙層結構而制得細菌纖維素皮膚修復材料及其制備方法。
背景技術：
皮膚被覆蓋于人體全身表面，與外界環境直接接觸，是解剖學和生理學上的重要邊界器官。皮膚不僅能使人體不受到污染物或細菌的侵襲，也能保持人體水分不流失。由于皮膚對人體的重要保護作用，因此一旦皮膚發生大面積損傷或缺失時，便會對人體造成致命的傷害。皮膚不具備自修復的功能，為了修復、代替缺損的皮膚組織，各國的科學家都在致力于開發具有良好治療效果的人造皮膚。從結構上來說人體皮膚由表皮層和真皮層組成。表皮層在皮膚的最外層，表皮細胞彼此聯接緊密，主要起到抵抗外界刺激以及防御的功能，因此是皮膚結構中最致密的一層。真皮層主要由膠原纖維和彈性纖維組成，主要起到保持皮膚彈性和張力的作用。由于真皮層中還富含血管、淋巴管以及毛發、皮脂腺、汗腺和肌肉，因此真皮層相較于表皮層結構更為疏松。因此，從表皮層到真皮層，人體的皮膚在結構上是具備一定梯度性的。

早期的人造皮膚主要有網狀編織類人造皮膚，聚氨酯人造皮膚以及有機硅膜人造皮膚。這些早期人造皮膚無梯度變化，為均一結構，因此應用于臨床治療時不利于細胞的附著生長，造成新生皮膚生長緩慢從而延長了傷口愈合時間和治療周期。具有梯度結構的人造皮膚從結構上來看更接近真實的皮膚，因此可以有效誘導缺損組織處細胞的遷移、增殖和分化。利用具有梯度結構的人造皮膚原位誘導缺損皮膚再生，可以大大的縮短傷口愈合周期。此外，還可以增強創面愈合后的皮膚彈性、柔韌性和機械耐磨性以及減少瘢痕增生。因此，在設計人造皮膚材料時，通常應模擬皮膚的表皮和真皮雙層結構的特點，設計具有模擬表皮層和真皮層的雙層結構人造皮膚。近幾年來，關于具有梯度結構的人造皮膚的研究已經取得了不少的成果。CN101716375公開了一種由純天然原料制備的具有梯度孔結構和性能的人工皮膚，這種人工皮膚由表皮層和真皮層構成，其中表皮層是由纖維蛋白或絲素蛋白等蛋白與殼聚糖等多糖構成的薄膜結構，真皮層的主要成分是膠原蛋白。CN 101716376A公開了一種生長因子緩釋型雙層人工皮膚，這種人工皮膚的表皮層是具有防水、透氣、保護功能的聚氨酯或硅橡膠或聚乙二醇微孔薄膜，真皮層是由絲素蛋白和殼聚糖構成的生物大分子薄膜。CN 102526810A公開了一種人工皮膚替代材料及制備方法，這種替代材料具有雙層結構，其中基層為聚氨酯材料，在基層表面覆蓋一層聚氨酯與聚N-異丙基丙烯酰胺經接枝共聚改性形成的結構層。這種替代物具有與真實皮膚相近的良好力學性能。CN 102526808A公開了一種人工皮膚及制備方法，該人工皮膚包括微孔膜狀表皮層以及天然高分子仿生真皮層。表皮層的主要成分為聚偏氟乙烯和/或其共聚物聚偏氟乙烯-三氟乙烯，真皮層是膠原膜。CN 1785444A公開了一種膠原-殼聚糖和硅橡膠雙層皮膚再生支架及其制備方法，該皮膚再生支架由膠原/殼聚糖多孔支架通過生物相容性良好的膠黏劑粘合而成。目前已經公開的具有雙層結構的人工皮膚制備技術主要通過涂膜、膠粘、噴淋成膜、熱壓成膜等復合方式人為地將人造表皮層與人造真皮層結合。其中涂膜與噴淋成膜是將表皮膠液噴涂到成型的人造真皮層表面，形成表面化學鍵合后得到人造皮膚；膠粘與熱壓成膜是指利用粘合劑通過分子間氫鍵與范德華力將已經成型的表皮層與真皮層結合。現有技術的人造皮膚在表皮層與真皮層結合界面存在結構上的突變，在各層內部不存在結構的梯度變化，只是簡單的上密下疏結構。這樣的構造不僅使皮膚組織細胞在材料疏密層結合界面處生長緩慢，還會破壞新生皮膚真皮層與表皮層結構的連續性，從而延長了治療周期并且會使傷口處形成明顯的疤痕。此外，膠粘與涂膜的制備工藝會在較大程度上影響表皮層與真皮層之間連通性最終影響人造皮膚材料的透氣性能。現有技術中涉及的人造皮膚真皮層材料通常選用生物相容性良好的膠原蛋白，絲束蛋白，表皮層材料通常選用可降解材料(聚乳酸，聚乙二醇)或者惰性材料(硅橡膠，聚偏氟乙烯，聚氨酯)，使其制備成本十分高昂，同時表皮層與真皮層由兩種不同材料構成也增加了人為復合保證兩種材料結合緊密的難度。細菌纖維素(Bacterial Cellulose，也稱微生物纖維素)是一種納米纖維材料。其以細菌細胞內部作為生物合成反應器，將葡萄糖小分子在酶催化作用下經過一系列復雜的變構過程最終通過β -1, 4-糖苷鍵結合形成β -1, 4-葡萄糖鏈由細菌系細胞側面的催化位點擠出。β -1, 4-葡萄糖鏈彼此之間通過分子內與分子間氫鍵作用，逐步、分層地形成脂多糖層、類晶團聚體、纖維素微纖并最終形成纖維素。這一系列的細胞外(Extracellular)成形過程被稱為“纖維素的自組裝”。正是這個獨特的微生物參與的過程賦予了細菌纖維素良好的理化性能:超細三維網狀結構；良好的吸濕、保濕以及透氣性能；超高的持水性與濕態強度；高抗張強度與彈性模量等等。大量研究表明細菌纖維素材料具有良好的體內、體外生物相容性，加上其優異的形狀可調控性與形狀維持性使 其在構建體內、體外組織工程支架材料具有得天獨厚的優勢。

發明內容
本發明專利通過控制BC的培養條件能夠快速，簡便地制備出一種具有類似人體皮膚“上密下疏”的生物結構的人造皮膚。與現有技術中層狀復合相比，本發明是使用細菌纖維素作為皮膚修復材料的基材。細菌纖維素具有良好的生物相容性以及細胞活性，是一種應用廣泛的組織工程支架材料。本發明通過控制菌種培養過程中的培養條件，使β -1, 4-葡萄糖鏈構成的纖維素微纖絲在通過分子內與分子間氫鍵結合并結晶成型的過程中，自發、有序地形成疏松到致密漸變的結構。結合程度更深，不僅局限于材料表面。與現有技術相比人為構造表皮層與真皮層相比，本發明制備得到的具有疏密結構的細菌纖維素皮膚修復材料無明顯物理分層，結構連續性十分良好，不存在現有技術人造皮膚產品在兩層界面處結構不連續的缺點；其次，疏松層與致密層內也存在結構的梯度變化，使得材料在最大程度上模仿了人體皮膚上密下疏的漸變梯度結構，能夠明顯縮短傷口愈合周期，并有效減少愈合后瘢痕的增生；此外，由于成型過程連續，本發明制備得到的具有疏密結構的細菌纖維素皮膚修復材料保持了細菌纖維素材料良好的透氣性與持水性，能夠長時間地使病患的創面維持一個濕態的環境，更有利于創面的愈合。具有疏密結構的細菌纖維素皮膚修復材料的成型過程簡單，培養周期短，制備過程綠色環保、簡便快速、制備成本低廉，是一種理想的皮膚修復材料。本發明的一種具備疏密結構的細菌纖維素皮膚修復材料，是由兩層結合緊密的細菌纖維素膜構成，所述的兩層結合緊密的細菌纖維素膜為致密層與疏松層；所述的結合緊密是指所述致密層的纖維素微纖絲與所述疏松層的纖維素微纖絲通過β -1, 4-葡萄糖鏈中的分子內與分子間氫鍵結合，形成分子層，層與層之間也通過分子內與分子間氫鍵結合，無明顯物理分層；組成細菌纖維素的基本單元并非單根β_1，4-葡萄糖鏈，而是預微纖絲(premicrofibril),其由β _1，4-葡萄糖鏈組成,每9根β _1，4-葡萄糖鏈相互平行,通過分子內與分子間氫鍵結合，呈左手三螺旋狀，是組成微纖絲(miCTofibril)的基本單位，直徑為1.5nm。微纖絲(microfibril)直徑為3.5nm,微纖與微纖之間通過分子內與分子間氫鍵結合，β_1，4-葡萄糖鏈呈平行排布，形成纖維素I型結晶結構。其中所述致密層中的纖維素含量0.7Χ 10_2 1.0X 10_2g/cm3，所述疏松層中的纖維素含量 0.2X 1(Γ2 0.5Χ l(T2g/cm3。作為優選的技術方案:如上所述的一種具備疏密結構的細菌纖維素皮膚修復材料，所述的細菌纖維素膜是由菌種在靜置培養條件下，消耗糖源，與細胞內合成β-1，4-葡萄糖鏈并擠出細胞體外。3 4條β -1，4-葡萄糖鏈通過分子內與`分子間氫鍵作用形成脂多糖層，4 5個脂多糖層通過分子內與分子間氫鍵形成直徑在1.5nm左右的類晶團聚體，3 5個類晶團聚體通過分子內與分子間氫鍵形成直徑在3.5nm左右的纖維素微纖絲，多條微纖絲通過分子內與分子間氫鍵作用形成纖維素絲束，多條絲束通過分子內與分子間氫鍵作用形成纖維素絲帶。菌種細胞在培養液表面無序運動，即使細胞發生分裂也不會影響纖維素絲帶發生斷裂。由β -1, 4-葡萄糖鏈通過分子內與分子間氫鍵形成的纖維素微纖絲相互交織，彼此通過分子內與分子間氫鍵相互作用，最終在液面形成類似與無紡布結構的細菌纖維素膜。如上所述的一種具備疏密結構的細菌纖維素皮膚修復材料，所述的具備疏密結構的細菌纖維素皮膚修復材料的厚度為8 IOmm,其中所述疏松層的厚度為3 5mm。本發明還提供了一種具備疏密結構的細菌纖維素皮膚修復材料的制備方法，包括以下步驟:I)發酵培養液的調配；發酵培養液組分，以質量百分數計，單位為wt%:葡萄糖、果糖、蔗糖或甘露醇2 5，蛋白胨0.05 0.5，酵母膏0.05 0.5，檸檬酸0.01 0.1，磷酸氫二鈉0.02 0.2，磷酸二氫鉀0.01 0.1,余量為水；發酵培養液的pH為4.0 6.0 ;將上述組分混合后經高壓蒸汽滅菌后紫外輻照并冷卻至室溫，通純氧，即得發酵培養液；2)菌種擴培；將所述的發酵培養液接入菌液和擴培；擴培程度:菌種細胞數目在2X IO5 2X IO7 個/ml。3)靜置培養；將擴培后的菌液轉移至裝有發酵培養液的培養容器中，放置于恒溫培養箱中，28 32 °C靜置培養；通過分步調節培養液上方空氣整體氣壓以及氧氣分壓來實現細菌纖維素薄膜的上密下疏的雙層結構；a.細菌纖維素生長誘導期I 2天:控制與發酵培養液液面相接觸的空氣壓カ為I個標準大氣壓，直至細菌將培養液中溶解的氧氣消耗殆盡后浮上液面，液面出現ー層半透明的細菌纖維素薄膜；b.細菌纖維素快速生長期2 3天:控制與細菌纖維素膜上表面空氣壓カ為I個標準大氣壓，同時保持氧氣濃度在10 15%范圍內；至細菌纖維素薄膜厚度達到0.5
1.0mm ；c.細菌纖維素平穩生長期3 4天:平穩生長期分兩個階段:疏松層形成階段，維持與細菌纖維素膜上表面相接觸的空氣壓カ為I個標準大氣壓，同時維持氧氣濃度為10 15%，直至細菌纖維素薄膜厚度增長至3 5mm ;致密層形成階段，加壓使與細菌纖維素膜上表面相接觸的空氣壓カ在1.1 1.5個標準大氣壓范圍內，同時提高氧氣濃度至50 100%范圍內；當細菌纖維素膜厚度達到8 IOmm時，將其取出，即得 到具備疏密結構的細菌纖維素薄膜；如上所述的平穩生長期中疏松層形成過程與致密層形成過程改變先后順序，也能夠得到同樣具備疏密結構的細菌纖維素薄膜。4)后處理；靜置培養結束后，將上述的具備疏密結構的細菌纖維素薄膜浸泡至濃度為I 10wt%的氫氧化鈉溶液中，煮沸保持2 10小時，用純凈水清洗至pH為7.0，材料內毒素〈0.5EU/ml，再將處理后的細菌纖維素薄膜高壓滅菌并包裝低溫封存，即為具備疏密結構的細菌纖維素皮膚修復材料。如上所述的ー種具備疏密結構的細菌纖維素皮膚修復材料的制備方法，其特征在于，所述的高壓蒸汽滅菌后紫外輻照是指將上述發酵培養液置于高壓滅菌鍋內i2rc滅菌處理30分鐘后取出置于紫外燈下輻照冷卻至室溫。如上所述的ー種具備疏密結構的多孔細菌纖維素皮膚修復材料，其特征在于，所述的菌種是指能夠生物合成纖維素的微生物，包括:木醋桿菌、產醋桿菌、醋化桿菌、巴氏醋桿菌、葡萄糖桿菌、農桿菌、根瘤菌、八疊球菌、洋蔥假單胞菌、椰毒假單胞菌或空腸彎曲菌中的ー種或幾種。如上所述的ー種具備疏密結構的細菌纖維素皮膚修復材料的制備方法，所述的通純氧是指將醫用氧以lL/min的速度通入上述的培養液中，并維持30分鐘；所述的接種是指用滅菌后的接種環鉤取適量保存于4°C下試管中的菌種，并轉移至上述的發酵培養液中；所述的擴培是指將接入菌種后的發酵培養液于28 32°C下搖床培養8 24小吋。如上所述的ー種具備疏密結構的細菌纖維素皮膚修復材料的制備方法，所述的加壓為連續增壓或階段性增壓。
如上所述的ー種具備疏密結構的細菌纖維素皮膚修復材料的制備方法，其特征在于，所述的連續增壓是指每分鐘向容器內充入壓力百分數1.32X10_2 5.63X10_2%的空氣，基數是I個標準大氣壓，直至容器內空氣壓カ為1.1 1.5個標準大氣壓時不再增加壓力；所述的階段性增壓是指每小時向容器內充入壓力百分數為0.797^3.437%的空氣，基數是I個標準大氣壓，直至容器內空氣壓カ為1.1 1.5個標準大氣壓時不再增加壓力；如上所述的ー種具備疏密結構的細菌纖維素皮膚修復材料的制備方法，所述的提高氧氣濃度為連續増加或階段性増加；所述的連續增加是指:在上述連續增壓的過程中，使氧氣濃度每分鐘増加0.05 0.06%，直至氧氣濃度達到50%時不再増加；所述的階段性增加是指:在上述連續增壓或階段性增壓過程中，使氧氣濃度每小時増加2.92 3.33%，直至氧氣濃度達到50%時不再增加。如上所述的ー種具備疏密結構的細菌纖維素皮膚修復材料的制備方法，其特征在于，所述的高壓滅菌是指將所述后處理后的具備疏密結構的細菌纖維素薄膜浸泡在純凈水中置于高壓滅菌鍋內121°C滅菌處理30分鐘后取出冷卻至室溫；所述的低溫封存是指將高壓滅菌后的具有疏密結構的細菌纖維素皮膚修復材料于4°C下保存。本發明的一種具備疏密結構的細菌纖維素皮膚修復材料，所述具有疏密結構的細菌纖維素皮膚修復材料與細胞生長因子、活性多肽以及抗菌物質通過物理吸附的方式進行復合；分別配置濃度為5 10wt%的細胞生長因子、活性多肽、抗菌物質的溶液，將材料在27 35°C的條件下分別在上述溶液中浸泡5 10天，隨后經過清洗、滅菌，即可得到復合了細胞生長因子、活性多肽以及抗菌物質的皮膚修復材料。細菌纖維素作為ー種新型的天然水凝膠具有其獨特的物理、化學和機械性質:超細網狀結構；高抗張強度和彈性模量；高親水性，良好的透氣、吸水、透水性能，并有非凡的持水性和高濕強度。細菌纖維素的微纖絲束直徑為3 4nm，而由微纖維束連接成的纖維絲帶寬度為70 80nm,長度為I 9 y m,是目前最細的天然纖維。細菌纖維素水凝膠的納米三維網狀結構為細胞、組織的重建提供了必要的三維空間和力學支持，起到模擬細胞外基質(Extra cellular matrix, ECM)的作用。具有良好的組織相容性；適合的孔徑和孔隙率，利于細胞的増殖和黏附，以及營養物質的滲入和細胞代謝產物的排出；生物可降解性和適合的降解率。其中生物材料對于結構和功能的仿生是組織工程支架最重要的性能要求。大量研究表明細菌纖維素具有良好的體內、體外生物相容性。極好的形狀維持性能和原位成型性。可以任意裁剪與皮膚有極好的伏貼性；獨特的三維網狀結構使得其能夠在很長一段時間里保持濕潤的狀態，濕潤的環境易于組織再生、還可以有效地減輕患者的疼痛，特殊的納米結構促進細胞的相互作用、促進組織再生及減少疤痕組織生成；同時，還有利于材料在傷ロ處安全、方便地釋放負載的藥物，進ー步促進傷ロ愈合。本專利發明的ー種具有疏密結構的細菌纖維素皮膚修復材料能夠根據患者病情的實際情況培養得到與患者傷ロ皮膚相似上密下疏的生物結構，可以在很大程度上縮短患者傷ロ愈合的周期，并且明顯減少愈合后疤痕的產生。有益效果:與現有技術先比，本發 明的有益效果是:(I) ー種具有疏密結構的細菌纖維素皮膚修復材料成型過程連續，疏松層與致密層之間由納米微纖絲通過分子內與分子間氫鍵結合。使￠-1, 4-葡萄糖鏈構成的纖維素微纖絲在通過分子內與分子間氫鍵結合并結晶成型的過程中，自發、有序地形成疏松到致密漸變的結構。結合程度更深，不僅局限于材料表面。(2) ー種具有疏密結構的細菌纖維素皮膚修復材料無明顯物理分層，結構連續性十分良好，不存在現有技術人造皮膚產品在兩層界面處結構不連續的缺點；其次，疏松層與致密層內也存在結構的梯度變化，使得材料在最大程度上模仿了人體皮膚上密下疏的漸變梯度結構，能夠明顯縮短傷ロ愈合周期，并有效減少愈合后瘢痕的增生。(3) ー種具有疏密結構的細菌纖維素皮膚修復材料在現有技術基礎上，通過增加培養過程中與細菌纖維素薄膜相接觸的空氣壓力，使得細菌纖維素薄膜內部有氧區面積增加；同時精確控制壓力，不使細菌纖維素薄膜下沉。改善了現有技術中只依靠提高氧氣分壓來構造疏密結構的単一エ藝，同時也解決了氧氣分壓過高所導致纖維素增長速度變緩的缺陷。(4) ー種具有疏密結構的細菌纖維素皮膚修復材料保持了細菌纖維素材料良好的透氣性與持水性，能夠長時間地使病患的創面維持ー個濕態的環境，更有利于創面的愈合。(5)—種具有疏密結構的細菌纖維素皮膚修復材料成型過程簡單，培養周期短，制備過程綠色環保、簡便快速、制備成本低廉，是ー種理想的皮膚修復材料。
具體實施例方式下面結合具體實施 方式，進ー步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。此外應理解，在閱讀了本發明講授的內容之后，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。本發明的一種具備疏密結構的細菌纖維素皮膚修復材料，是由兩層結合緊密的細菌纖維素膜構成，所述的兩層結合緊密的細菌纖維素膜為致密層與疏松層；所述的結合緊密是指所述致密層的纖維素微纖絲與所述疏松層的纖維素微纖絲通過3 -1, 4-葡萄糖鏈中的分子內與分子間氫鍵結合，形成分子層，層與層之間也通過分子內與分子間氫鍵結合，無明顯物理分層；組成細菌纖維素的基本単元并非單根￠-1, 4-葡萄糖鏈，而是預微纖絲(premicrofibril),其由P-1, 4-葡萄糖鏈組成,姆9根P-1, 4-葡萄糖鏈相互平行,通過分子內與分子間氫鍵結合，呈左手三螺旋狀，是組成微纖絲(miCTofibril)的基本単位，直徑為1.5nm。微纖絲(microfibril)直徑為3.5nm,微纖與微纖之間通過分子內與分子間氫鍵結合，P -1, 4-葡萄糖鏈呈平行排布，形成纖維素I型結晶結構。其中所述致密層中的纖維素含量0.7X 10_2 1.0X 10_2g/cm3，所述疏松層中的纖維素含量 0.2 X KT2 0.5X l(T2g/cm3。所述的細菌纖維素膜是由菌種消耗糖源，分泌纖維素微纖絲通過分子內與分子間氫鍵結合形成。所述的具備疏密結構的細菌纖維素皮膚修復材料的厚度為8 10mm，其中所述疏松層的厚度為3 5mm。低溫封存，即為具備疏密結構的細菌纖維素皮膚修復材料。實施例1
I)發酵培養液的調配；發酵培養液組分，以質量百分數計，単位為wt%:葡萄糖、果糖、蔗糖或甘露醇2，蛋白胨0.05，酵母膏0.05，檸檬酸0.01，磷酸氫ニ鈉0.02，磷酸ニ氫鉀0.01，余量為水；發酵培養液的pH為4.0 ;將上述組分混合后經高壓蒸汽滅菌后紫外輻照并冷卻至室溫，通純氧，即得發酵培養液；2)菌種擴培；將所述的發酵培養液接種和擴培；擴培程度:菌種細胞數目在2X105個/mL。3)靜置培養； 將擴培后的菌液轉移至裝有發酵培養液的培養容器中，放置于恒溫培養箱中，28 °C靜置培養；通過分步調節培養液上方空氣整體氣壓以及氧氣分壓來實現細菌纖維素薄膜的上密下疏的雙層結構；a.細菌纖維素生長誘導期I天:控制與發酵培養液液面相接觸的空氣壓カ為I個標準大氣壓，直至細菌將培養液中溶解的氧氣消耗殆盡后浮上液面，液面出現ー層半透明的細菌纖維素薄膜；b.細菌纖維素快速生長期2天:控制與細菌纖維素膜上表面空氣壓カ為I個標準大氣壓，同時保持氧氣濃度在10% ;至細菌纖維素薄膜厚度達到0.5mm ；c.細菌纖維素平穩生長期3天:平穩生長期分兩個階段:疏松層形成階段，維持與細菌纖維素膜上表面相接觸的空氣壓カ為I個標準大氣壓，同時維持氧氣濃度為10%，直至細菌纖維素薄膜厚度增長至3mm ；致密層形成階段，加壓使與細菌纖維素膜上表面相接觸的空氣壓カ在1.1個標準大氣壓范圍內，同時提高氧氣濃度至50% ;當細菌纖維素膜厚度達到8_時，將其取出，即得到具備疏密結構的細菌纖維素薄膜；4)后處理；靜置培養結束后，將上述的具備疏密結構的細菌纖維素薄膜浸泡至濃度為lwt%的氫氧化鈉溶液中，煮沸保持10小時，用純凈水清洗至pH為7.0，材料內毒素〈0.5EU/ml,再將處理后的細菌纖維素薄膜高壓滅菌并包裝低溫封存，即為具備疏密結構的細菌纖維素皮膚修復材料。實施例2I)發酵培養液的調配；發酵培養液組分，以質量百分數計，単位為wt%:葡萄糖、果糖、蔗糖或甘露醇5，蛋白胨0.5，酵母膏0.5，檸檬酸0.1，磷酸氫ニ鈉0.2，磷酸ニ氫鉀0.1，余量為水；發酵培養液的pH為6.0 ;將上述組分混合后經高壓蒸汽滅菌后紫外輻照并冷卻至室溫，通純氧，即得發酵培養液；2)菌種擴培；將所述的發酵培養液接種和擴培；擴培程度:菌種細胞數目在2X107個/mL。
3)靜置培養；將擴培后的菌液轉移至裝有發酵培養液的培養容器中，放置于恒溫培養箱中，32 °C靜置培養；通過分步調節培養液上方空氣整體氣壓以及氧氣分壓來實現細菌纖維素薄膜的上密下疏的雙層結構；a.細菌纖維素生長誘導期2天:控制與發酵培養液液面相接觸的空氣壓カ為I個標準大氣壓，直至細菌將培養液中溶解的氧氣消耗殆盡后浮上液面，液面出現ー層半透明的細菌纖維素薄膜；b.細菌纖維素快速生長期3天:控制與細菌纖維素膜上表面空氣壓カ為I個標準大氣壓，同時保持氧氣濃度在15% ;至細菌纖維素薄膜厚度達到0.5mm ；c.細菌纖維素平穩生長期4天:平穩生長期分兩個階段:疏松層形成階段，維持與細菌纖維素膜上表面相接觸的空氣壓カ為I個標準大氣壓，同時維持氧氣濃度為15%，直至細菌纖維素薄膜厚度增長至3mm ；致密層形成階段，加壓使與細菌纖維素膜上表面相接觸的空氣壓カ在1.5個標準大氣壓范圍內，同時提高氧氣濃度至50% ;當細菌纖維素膜厚度達到8_時，將其取出，即得到具備疏密結構的細菌纖維素薄膜；4)后處理；靜置培養結束后，將上述的具備疏密結構的細菌纖維素薄膜浸泡至濃度為10wt%的氫氧化鈉溶液中，煮沸保持 2小時，用純凈水清洗至pH為7.0，材料內毒素〈0.5EU/ml，再將處理后的細菌纖維素薄膜高壓滅菌并包裝低溫封存，即為具備疏密結構的細菌纖維素皮膚修復材料。實施例3I)發酵培養液的調配；發酵培養液組分，以質量百分數計，単位為wt%:葡萄糖、果糖、蔗糖或甘露醇3，蛋白胨0.3，酵母膏0.3，檸檬酸0.05，磷酸氫ニ鈉0.1，磷酸ニ氫鉀0.05，余量為水；發酵培養液的pH為5.0 ;將上述組分混合后經高壓蒸汽滅菌后紫外輻照并冷卻至室溫，通純氧，即得發酵培養液；2)菌種擴培；將所述的發酵培養液接種和擴培；擴培程度:菌種細胞數目在2X107個/mL。3)靜置培養；將擴培后的菌液轉移至裝有發酵培養液的培養容器中，放置于恒溫培養箱中，30°C靜置培養；通過分步調節培養液上方空氣整體氣壓以及氧氣分壓來實現細菌纖維素薄膜的上密下疏的雙層結構；a.細菌纖維素生長誘導期2天:控制與發酵培養液液面相接觸的空氣壓カ為I個標準大氣壓，直至細菌將培養液中溶解的氧氣消耗殆盡后浮上液面，液面出現ー層半透明的細菌纖維素薄膜；
b.細菌纖維素快速生長期3天:控制與細菌纖維素膜上表面空氣壓カ為I個標準大氣壓，同時保持氧氣濃度在12.5% ;至細菌纖維素薄膜厚度達到0.5mm ；c.細菌纖維素平穩生長期4天:平穩生長期分兩個階段:疏松層形成階段，維持與細菌纖維素膜上表面相接觸的空氣壓カ為I個標準大氣壓，同時維持氧氣濃度為12.5%，直至細菌纖維素薄膜厚度增長至3mm ；致密層形成階段，加壓使與細菌纖維素膜上表面相接觸的空氣壓カ在1.5個標準大氣壓范圍內，同時提高氧氣濃度至50% ;當細菌纖維素膜厚度達到8_時，將其取出，即得到具備疏密結構的細菌纖維素薄膜；4)后處理；靜置培養結束后，將上述的具備疏密結構的細菌纖維素薄膜浸泡至濃度為2wt%的氫氧化鈉溶液中，煮沸保持4小時，用純凈水清洗至pH為7.0，材料內毒素〈0.5EU/ml，再將處理后的細菌纖維素薄膜高壓滅菌并包裝低溫封存，即為具備疏密結構的細菌纖維素皮膚修復材料。實施例4I)發酵培養液的調配；發酵培養液組分，以質量百分數計，単位為wt%:葡萄糖、果糖、蔗糖或甘露醇5，蛋白胨0.5，酵母膏0.5，檸檬酸0.1，磷酸氫ニ鈉0.2，磷酸ニ氫鉀0.1，余量為水；發酵培養液的pH為5.0 ;將上述組分混合后經高壓蒸汽滅菌后紫外輻照并冷卻至室溫，通純氧，即得發酵培養液；2)菌種擴培；將所述的發酵培養液接種和擴培；擴培程度:菌種細胞數目在2X107個/mL。3)靜置培養；將擴培后的菌液轉移至裝有發酵培養液的培養容器中，放置于恒溫培養箱中，28 °C靜置培養；通過分步調節培養液上方空氣整體氣壓以及氧氣分壓來實現細菌纖維素薄膜的上密下疏的雙層結構；a.細菌纖維素生長誘導期I天:控制與發酵培養液液面相接觸的空氣壓カ為I個標準大氣壓，直至細菌將培養液中溶解的氧氣消耗殆盡后浮上液面，液面出現ー層半透明的細菌纖維素薄膜；b.細菌纖維素快速生長期2天:控制與細菌纖維素膜上表面空氣壓カ為I個標準大氣壓，同時保持氧氣濃度在10% ;至細菌纖維素薄膜厚度達到0.5mm ；c.細菌纖維素平穩生長期4天:平穩生長期分兩個階段:疏松層形成階段，維持與細菌纖維素膜上表面相接觸的空氣壓カ為I個標準大氣壓，同時維持氧氣濃度為10% ，直至細菌纖維素薄膜厚度增長至3mm ；致密層形成階段，采用連續增壓，毎分鐘向容器內充入壓力百分數1.32X10_2%的空氣，基數是ー個標準大氣壓，直至容器內空氣壓カ為1.1個標準大氣壓時不再增加壓力。使與細菌纖維素膜上表面相接觸的空氣壓カ在1.1個標準大氣壓，同時采用連續增加氧氣濃度的方式，使氧氣濃度每分鐘増加0.05%，直至氧氣濃度達到50%時不再増加；當細菌纖維素膜厚度達到8mm時，將其取出，即得到具備疏密結構的細菌纖維素薄膜；4)后處理；靜置培養結束后，將上述的具備疏密結構的細菌纖維素薄膜浸泡至濃度為lwt%的氫氧化鈉溶液中，煮沸保持2小時，用純凈水清洗至pH為7.0，材料內毒素〈0.5EU/ml，再將處理后的細菌纖維素薄膜高壓滅菌并包裝低溫封存，即為具備疏密結構的細菌纖維素皮膚修復材料。實施例5I)發酵培養液的調配；發酵培養液組分，以質量百分數計，単位為wt%:葡萄糖、果糖、蔗糖或甘露醇5，蛋白胨0.5，酵母膏0.5，檸檬酸0.1，磷酸氫ニ鈉0.2，磷酸ニ氫鉀0.1，余量為水；發酵培養液的pH為5.0 ;將上述組分混合后經高壓蒸汽滅菌后紫外輻照并冷卻至室溫，通純氧，即得發酵培養液；2)菌種擴培；將所述的發酵培養液接種和擴培；擴培程度:菌種細胞數目在2X107個/mL。3)浄置培養；

將擴培后的菌液轉移至裝有發酵培養液的培養容器中，放置于恒溫培養箱中，28 °C靜置培養；通過分步調節培養液上方空氣整體氣壓以及氧氣分壓來實現細菌纖維素薄膜的上密下疏的雙層結構；a.細菌纖維素生長誘導期I天:控制與發酵培養液液面相接觸的空氣壓カ為I個標準大氣壓，直至細菌將培養液中溶解的氧氣消耗殆盡后浮上液面，液面出現ー層半透明的細菌纖維素薄膜；b.細菌纖維素快速生長期2天:控制與細菌纖維素膜上表面空氣壓カ為I個標準大氣壓，同時保持氧氣濃度在10% ;至細菌纖維素薄膜厚度達到0.5mm ；c.細菌纖維素平穩生長期4天:平穩生長期分兩個階段:疏松層形成階段，維持與細菌纖維素膜上表面相接觸的空氣壓カ為I個標準大氣壓，同時維持氧氣濃度為10%，直至細菌纖維素薄膜厚度增長至3mm ；致密層形成階段，采用連續增壓，毎分鐘向容器內充入壓力百分數5.63X10_2%的空氣，基數是ー個標準大氣壓，直至容器內空氣壓カ為1.5個標準大氣壓時不再增加壓力。使與細菌纖維素膜上表面相接觸的空氣壓カ在1.5個標準大氣壓，同時采用連續增加氧氣濃度的方式，使氧氣濃度每分鐘増加0.06%，直至氧氣濃度達到50%時不再増加；當細菌纖維素膜厚度達到8mm時，將其取出，即得到具備疏密結構的細菌纖維素薄膜；4)后處理；靜置培養結束后，將上述的具備疏密結構的細菌纖維素薄膜浸泡至濃度為lwt%的氫氧化鈉溶液中，煮沸保持2小時，用純凈水清洗至pH為7.0，材料內毒素〈0.5EU/ml，再將處理后的細菌纖維素薄膜高壓滅菌并包裝低溫封存，即為具備疏密結構的細菌纖維素皮膚修復材料。實施例6I)發酵培養液的調配；發酵培養液組分，以質量百分數計，単位為wt%:葡萄糖、果糖、蔗糖或甘露醇5，蛋白胨0.5，酵母膏0.5，檸檬酸0.1，磷酸氫ニ鈉0.2，磷酸ニ氫鉀0.1，余量為水；發酵培養液的pH為5.0 ;將上述組分混合后經高壓蒸汽滅菌后紫外輻照并冷卻至室溫，通純氧，即得發酵培養液；2)菌種擴培；將所述的發酵培養液接種和擴培；擴培程度:菌種細胞數目在2X107個/mL。3)靜置培養；將擴培后的菌液轉移至裝有發酵培養液的培養容器中，放置于恒溫培養箱中，28 °C靜置培養；通過分步調節培養液上方空氣整體氣壓以及氧氣分壓來實現細菌纖維素薄膜的上密下疏的雙層結構；
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a.細菌纖維素生長誘導期I天:控制與發酵培養液液面相接觸的空氣壓カ為I個標準大氣壓，直至細菌將培養液中溶解的氧氣消耗殆盡后浮上液面，液面出現ー層半透明的細菌纖維素薄膜；b.細菌纖維素快速生長期2天:控制與細菌纖維素膜上表面空氣壓カ為I個標準大氣壓，同時保持氧氣濃度在10% ;至細菌纖維素薄膜厚度達到0.5mm ；c.細菌纖維素平穩生長期4天:平穩生長期分兩個階段:疏松層形成階段，維持與細菌纖維素膜上表面相接觸的空氣壓カ為I個標準大氣壓，同時維持氧氣濃度為10%，直至細菌纖維素薄膜厚度增長至3mm ；致密層形成階段，采用階段性增壓，每小時向容器內充入壓力百分數0.797%的空氣，基數是ー個標準大氣壓，直至容器內空氣壓カ為1.1個標準大氣壓時不再增加壓力。使與細菌纖維素膜上表面相接觸的空氣壓カ在1.1個標準大氣壓，同時采用階段性增加氧氣濃度的方式，使氧氣濃度每小時増加2.92%，直至氧氣濃度達到50%時不再増加；當細菌纖維素膜厚度達到8mm時，將其取出，即得到具備疏密結構的細菌纖維素薄膜；4)后處理；靜置培養結束后，將上述的具備疏密結構的細菌纖維素薄膜浸泡至濃度為lwt%的氫氧化鈉溶液中，煮沸保持2小時，用純凈水清洗至pH為7.0，材料內毒素〈0.5EU/ml，再將處理后的細菌纖維素薄膜高壓滅菌并包裝低溫封存，即為具備疏密結構的細菌纖維素皮膚修復材料。實施例7I)發酵培養液的調配；發酵培養液組分，以質量百分數計，単位為wt%:葡萄糖、果糖、蔗糖或甘露醇5，蛋白胨0.5，酵母膏0.5，檸檬酸0.1，磷酸氫ニ鈉0.2，磷酸ニ氫鉀0.1，余量為水；
發酵培養液的pH為5.0 ;將上述組分混合后經高壓蒸汽滅菌后紫外輻照并冷卻至室溫，通純氧，即得發酵培養液；2)菌種擴培；將所述的發酵培養液接種和擴培；擴培程度:菌種細胞數目在2X105個/mL。3)靜置培養；將擴培后的菌液轉移至裝有發酵培養液的培養容器中，放置于恒溫培養箱中，28 °C靜置培養；通過分步調節培養液上方空氣整體氣壓以及氧氣分壓來實現細菌纖維素薄膜的上密下疏的雙層結構；a.細菌纖維素生長誘導期I天:控制與發酵培養液液面相接觸的空氣壓カ為I個標準大氣壓，直至細菌將培養液中溶解的氧氣消耗殆盡后浮上液面，液面出現ー層半透明的細菌纖維素薄膜；b.細菌纖維素快速生長期2天:控制與細菌纖維素膜上表面空氣壓カ為I個標準大氣壓，同時保持氧氣濃度在10% ;至細菌纖維素薄膜厚度達到0.5mm ；c.細菌纖維素平穩生長期4天:平穩生長期分兩個階段:疏松層形成階段，維持與細菌纖維素膜上表面相接觸的空氣壓カ為I個標準大氣壓，同時維持氧氣濃度為10%，直至細菌纖維素薄膜厚度增長至3mm ；致密層形成階段，采用階段性增壓，每小時向容器內充入壓力百分數3.437%的空氣，基數是ー個標準大氣壓，直至容器內空氣壓カ為1.5個標準大氣壓時不再增加壓力。使與細菌纖維素膜上表面相接觸的空氣壓カ在1.5個標準大氣壓，同時采用階段性增加氧氣濃度的方式，使氧氣濃度每小時増加3.33%，直至氧氣濃度達到50%時不再増加；當細菌纖維素膜厚度達到8mm時，將其取出，即得到具備疏密結構的細菌纖維素薄膜；4)后處理；靜置培養結束后，將上述的具備疏密結構的細菌纖維素薄膜浸泡至濃度為lwt%的氫氧化鈉溶液中，煮沸保持2小時，用純凈水清洗至pH為7.0，材料內毒素〈0.5EU/ml，再將處理后的細菌纖維素薄膜高壓滅菌并包裝低溫封存，即為具備疏密結構的細菌纖維素皮膚修復材料。實施例8I)發酵培養液的調配；發酵培養液組分，以質量百分數計，単位為wt%:葡萄糖、果糖、蔗糖或甘露醇5，蛋白胨0.5，酵母膏0.5，檸檬酸0.1，磷酸氫ニ鈉0.2，磷酸ニ氫鉀0.1，余量為水；發酵培養液的pH為5.0 ;將上述組分混合后經高壓蒸汽滅菌后紫外輻照并冷卻至室溫，通純氧，即得發酵培養液；2)菌種擴培；將所述的發酵培養液接種和擴培； 擴培程度:菌種細胞數目在2X107個/mL。3)靜置培養；
將擴培后的菌液轉移至裝有發酵培養液的培養容器中，放置于恒溫培養箱中，28 °C靜置培養；通過分步調節培養液上方空氣整體氣壓以及氧氣分壓來實現細菌纖維素薄膜的上密下疏的雙層結構；a.細菌纖維素生長誘導期I天:控制與發酵培養液液面相接觸的空氣壓カ為I個標準大氣壓，直至細菌將培養液中溶解的氧氣消耗殆盡后浮上液面，液面出現ー層半透明的細菌纖維素薄膜；b.細菌纖維素快速生長期2天:控制與細菌纖維素膜上表面空氣壓カ為I個標準大氣壓，同時保持氧氣濃度在10% ;至細菌纖維素薄膜厚度達到0.5mm ；c.細菌纖維素平穩生長期4天:平穩生長期分兩個階段:疏松層形成階段，維持與細菌纖維素膜上表面相接觸的空氣壓カ為I個標準大氣壓，同時維持氧氣濃度為10%，直至細菌纖維素薄膜厚度增長至3mm ；致密層形成階段，采用連續增壓，毎分鐘向容器內充入壓力百分數3.0OX 10_2%的空氣，基數是ー個標準大氣壓，直至容器內空氣壓カ為1.3個標準大氣壓時不再增加壓力。使與細菌纖維素膜上表面相接觸的空氣壓カ在1.3個標準大氣壓，同時采用連續增加氧氣濃度的方式，使氧氣濃度每分鐘増加0.55%，直至氧氣濃度達到50%時不再増加；當細菌纖維素膜厚度達到8mm時，將其取出，即得到具備疏密結構的細菌纖維素薄膜；4)后處理；靜置培養結束后，將上述的具備疏密結構的細菌纖維素薄膜浸泡至濃度為lwt%的氫氧化鈉溶液中，煮沸保持2小時，用純凈水清洗至pH為7.0，材料內毒素〈0.5EU/ml，再將處理后的細菌纖維素薄膜高壓滅菌并包裝低溫封存，即為具備疏密結構的細菌纖維素皮膚修復材料。實施例91)發酵培養液的調配；發酵培養液組分，以質量百分數計，単位為wt%:葡萄糖、果糖、蔗糖或甘露醇5，蛋白胨0.5，酵母膏0.5，檸檬酸0.1，磷酸氫ニ鈉0.2，磷酸ニ氫鉀0.1，余量為水；發酵培養液的pH為5.0 ;將上述組分混合后經高壓蒸汽滅菌后紫外輻照并冷卻至室溫，通純氧，即得發酵培養液；2)菌種擴培；將所述的發酵培養液接種和擴培；擴培程度:菌種細胞數目在2X107個/mL。3)靜置培養；將擴培后的菌液轉移至裝有發酵培養液的培養容器中，放置于恒溫培養箱中，28 °C靜置培養；通過分步調節培養液上方空氣整體氣壓以及氧氣分壓來實現細菌纖維素薄膜的上密下疏的雙層結構；a.細菌纖維素生長誘導期I天:控制與發酵培養液液面相接觸的空氣壓カ為I個標準大氣壓，直至細菌將培養液中溶解的氧氣消耗殆盡后浮上液面，液面出現ー層半透明的細菌纖維素薄膜；b.細菌纖維素快速生長期2天:控制與細菌纖維素膜上表面空氣壓カ為I個標準大氣壓，同時保持氧氣濃度在10% ;至細菌纖維素薄膜厚度達到0.5mm ；c.細菌纖維素平穩生長期4天:平穩生長期分兩個階段:疏松層形成階段，維持與細菌纖維素膜上表面相接觸的空氣壓カ為I個標準大氣壓，同時維持氧氣濃度為10%，直至細菌纖維素薄膜厚度增長至3mm ；致密層形成階段，采用階段性增壓，每小時向容器內充入壓力百分數1.50%的空氣，基數是ー個標準大氣壓，直至容器內空氣壓カ為1.3個標準大氣壓時不再增加壓力。使與細菌纖維素膜上表面相接觸的空氣壓カ在1.3個標準大氣壓，同時采用階段性增加氧氣濃度的方式，使氧氣濃度每小時増加3.00%，直至氧氣濃度達到50%時不再増加；當細菌纖維素膜厚度達到8mm時，將其取出，即得到具備疏密結構的細菌纖維素薄膜；4)后處理；靜置培養結束后，將上述的具備疏密結構的細菌纖維素薄膜浸泡至濃度為lwt%的氫氧化鈉溶液中，煮沸保持2小時，用純凈水清洗至pH為7.0，材料內毒素〈0.5EU/ml，再將處理后的細菌纖維素薄膜高壓滅菌并包裝低溫封存，即為具備疏密結構的細菌纖維素皮膚修復材料。實施例10I)發酵培養液的調配；發酵培養液組分，以質量百分數計，単位為wt%:葡萄糖、果糖、蔗糖或甘露醇2，蛋白胨0.05，酵母膏0.05，檸檬酸0.01，磷酸氫ニ鈉0.02，磷酸ニ氫鉀0.01，余量為水；發酵培養液的pH為4.0 ;將上述組分混合后經高壓蒸汽滅菌后紫外輻照并冷卻至室溫，通純氧，即得發酵培養液；2)菌種擴培；將所述的發酵培養液接種和擴培；擴培程度:菌種細胞數目在2X105個/mL。3)靜置培養；將擴培后的菌液轉移至裝有發酵培養液的培養容器中，放置于恒溫培養箱中，28 °C靜置培養；通過分步調節培養液上方空氣整體氣壓以及氧氣分壓來實現細菌纖維素薄膜的上密下疏的雙層結構；a.細菌纖維素生長誘導期I天:控制與發酵培養液液面相接觸的空氣壓カ為I個標準大氣壓，直至細菌將培養液中溶解的氧氣消耗殆盡后浮上液面，液面出現ー層半透明的細菌纖維素薄膜；b.細菌纖維素快速生長期2天:控制與細菌纖維素膜上表面空氣壓カ為I個標準大氣壓，同時保持氧氣濃度在 10% ;至細菌纖維素薄膜厚度達到0.5mm ；c.細菌纖維素平穩生長期3天:平穩生長期分兩個階段:致密層形成階段，加壓使與細菌纖維素膜上表面相接觸的空氣壓カ在1.1個標準大氣壓范圍內，同時提高氧氣濃度至50% ;直至細菌纖維素膜厚度達到8mm ；疏松層形成階段，降壓空氣壓力，使與細菌纖維素膜上表面相接觸的空氣壓カ為I個標準大氣壓，同時降低氧氣濃度至10%，直至細菌纖維素薄膜厚度增長至3mm時，將其取出，即得到具備疏密結構的細菌纖維素薄膜；4)后處理；靜置培養結束后，將上述的具備疏密結構的細菌纖維素薄膜浸泡至濃度為lwt%的氫氧化鈉溶液中，煮沸保持2小時，用純凈水清洗至pH為7.0，材料內毒素〈0.5EU/ml，再將處理后的細菌纖維素薄膜高壓滅菌并包裝低溫封存，即為具備疏密結構的細菌纖維素皮膚修復材料 。
權利要求
1.一種具備疏密結構的細菌纖維素皮膚修復材料，其特征是:所述的具備疏密結構的細菌纖維素皮膚修復材料是由兩層結合緊密的細菌纖維素膜構成，所述的兩層結合緊密的細菌纖維素膜為致密層與疏松層；所述的結合緊密是指所述致密層的纖維素微纖絲與所述疏松層的纖維素微纖絲通過β -1, 4-葡萄糖鏈中的分子內與分子間氫鍵結合，形成分子層，層與層之間也通過分子內與分子間氫鍵結合，無明顯物理分層； 其中所述致密層中的纖維素含量0.7Χ 10_2 1.0X 10_2g/cm3，所述疏松層中的纖維素含量 0.2 X I(T2 0.5 X l(T2g/cm3。
2.根據權利要求1所述的一種具備疏密結構的細菌纖維素皮膚修復材料，其特征在于，所述的細菌纖維素膜是由菌種消耗糖源，分泌纖維素微纖絲通過分子內與分子間氫鍵結合形成；所述的菌種是指能夠生物合成纖維素的微生物，包括:木醋桿菌、產醋桿菌、醋化桿菌、巴氏醋桿菌、葡萄糖桿菌、農桿菌、根瘤菌、八疊球菌、洋蔥假單胞菌、椰毒假單胞菌或空腸彎曲菌中的一種或幾種。
3.根據權利要求1所述的一種具備疏密結構的細菌纖維素皮膚修復材料，其特征在于，所述的具備疏密結構的細菌纖維素皮膚修復材料的厚度為8 10mm，其中所述疏松層的厚度為3 5mm。
4.按權利要求1所述的一種具備疏密結構的細菌纖維素皮膚修復材料的制備方法，其特征是包括以下步驟: 1)發酵培養液的調配； 發酵培養液組 分，以質量百分數計，單位為wt%:葡萄糖、果糖、蔗糖或甘露醇2 5，蛋白胨0.05、.5，酵母膏 0.05^0.5，檸檬酸0.θΓθ.1，磷酸氫二鈉0.02、.2，磷酸二氫鉀ο.οΓο.1，余量為水； 發酵培養液的pH為4.0 6.0 ; 將上述組分混合后經高壓蒸汽滅菌后紫外輻照并冷卻至室溫，通純氧，即得發酵培養液； 2)菌種擴培； 將所述的發酵培養液接種和擴培；擴培程度:菌種細胞數目在2 X IO5 2 X IO7個/ml ; 3)靜置培養； 將擴培后的菌液轉移至裝有發酵培養液的培養容器中，放置于恒溫培養箱中，28 .32 °C靜置培養； 通過分步調節培養液上方空氣整體氣壓以及氧氣分壓來實現細菌纖維素薄膜的上密下疏的雙層結構； a.細菌纖維素生長誘導期I 2天:控制與發酵培養液液面相接觸的空氣壓力為I個標準大氣壓，直至細菌將培養液中溶解的氧氣消耗殆盡后浮上液面，液面出現一層半透明的細菌纖維素薄膜； b.細菌纖維素快速生長期2 3天:控制與細菌纖維素膜上表面空氣壓力為I個標準大氣壓，同時保持氧氣體積濃度在10 15%范圍內；至細菌纖維素薄膜厚度達到0.5 .1.5mm ； C.細菌纖維素平穩生長期3 4天: 平穩生長期分兩個階段:疏松層形成階段，維持與細菌纖維素膜上表面相接觸的空氣壓力為I個標準大氣壓，同時維持氧氣濃度為10 15%，直至細菌纖維素薄膜厚度增長至3 5mm ; 致密層形成階段，加壓使與細菌纖維素膜上表面相接觸的空氣壓力在1.1 1.5個標準大氣壓范圍內，同時提高氧氣濃度至50 100%范圍內；當細菌纖維素膜厚度達到8 IOmm時，將其取出，即得到具備疏密結構的細菌纖維素薄膜； 4)后處理； 靜置培養結束后，將上述的具備疏密結構的細菌纖維素薄膜浸泡至濃度為I 10wt%的氫氧化鈉溶液中，煮沸保持2 10小時，用純凈水清洗至pH為7.0，材料內毒素〈0.5EU/ml，再將處理后的細菌纖維素薄膜高壓滅菌并包裝低溫封存，即為具備疏密結構的細菌纖維素皮膚修復材料。
5.根據權利要求4所述的一種具備疏密結構的細菌纖維素皮膚修復材料的制備方法，其特征在于，所述的高壓蒸 汽滅菌后紫外輻照是指將所述發酵培養液置于高壓滅菌鍋內121°C滅菌處理30分鐘后取出置于紫外燈下輻照冷卻至室溫。
6.根據權利要求4所述的一種具備疏密結構的細菌纖維素皮膚修復材料的制備方法，其特征在于，所述的通純氧是指將醫用氧以lL/min的速度通入上述的培養液中，并維持30分鐘；所述的接種是指用滅菌后的接種環鉤取適量保存于4°C下試管中的菌種，并轉移至上述的發酵培養液中；所述的擴培是指將接入菌種后的發酵培養液于28 32°C下搖床培養8 24小時。
7.根據權利要求4所述的一種具備疏密結構的細菌纖維素皮膚修復材料的制備方法，其特征在于，所述的加壓為連續增壓或階段性增壓。
8.根據權利要求7所述的一種具備疏密結構的細菌纖維素皮膚修復材料的制備方法，其特征在于，所述的連續增壓是指每分鐘向容器內充入壓力百分數為1.32X10—2 5.63X10_2%的空氣，基數是I個標準大氣壓，直至容器內空氣壓力為1.1 1.5個標準大氣壓時不再增加壓力；所述的階段性增壓是指每小時向容器內充入壓力百分數為0.797^3.437%的空氣，基數同樣是I個標準大氣壓，直至容器內空氣壓力為1.1 1.5個標準大氣壓時不再增加壓力。
9.根據權利要求4所述的一種具備疏密結構的細菌纖維素皮膚修復材料的制備方法，其特征在于，所述的提高氧氣濃度為連續增加或階段性增加；所述的連續增加是指:氧氣濃度每分鐘增加0.05 0.06%，直至氧氣濃度達到50%時不再增加；所述的階段性增加是指:在上述連續增壓或階段性增壓過程中，使氧氣濃度每小時增加2.92 3.33%，直至氧氣濃度達到50%時不再增加。
10.根據權利要求4所述的一種具備疏密結構的細菌纖維素皮膚修復材料的制備方法，其特征在于，所述的高壓滅菌是指將所述后處理后的具備疏密結構的細菌纖維素薄膜浸泡在純凈水中置于高壓滅菌鍋內121°C滅菌處理30分鐘后取出冷卻至室溫；所述的低溫封存是指將高壓滅菌后的具有疏密結構的細菌纖維素皮膚修復材料于4°C下保存。
全文摘要
本發明涉及一種具備疏密結構的細菌纖維素皮膚修復材料及其制備方法。通過控制細菌纖維素的培養條件制備出一種具有類似人體皮膚“上密下疏”的生物結構的人造皮膚生物相容性以及細胞活性良好。疏松層與致密層結合程度更深，不僅局限于材料表面。無明顯物理分層，結構連續性良好，疏松層與致密層內存在結構的梯度變化，最大程度模仿了人體皮膚上密下疏的漸變梯度結構，能夠明顯縮短傷口愈合周期并有效減少愈合后瘢痕的增生；同時保持了細菌纖維素良好的透氣性與持水性，能夠長時間地使創面維持一個濕態的環境，更利于創面的愈合。成型過程簡單，培養周期短，制備過程綠色環保、簡便快速、制備成本低廉。
文檔編號A61L27/60GK103083112SQ20121057550
公開日2013年5月8日 申請日期2012年12月26日 優先權日2012年12月26日
發明者李喆, 楊敬軒, 張云, 鄭羿, 王利群, 王華平, 陳仕艷, 洪楓 申請人:東華大學