專利名稱：美麗雞血藤est-ssr標記的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種分子標記技術，具體涉及一種美麗雞血藤EST-SSR遺傳標記，適用于美麗雞血藤的遺傳多樣性研究，種質鑒定和親緣關系分析。
背景技術：
微衛星序列(microsatellite DNA)又稱為簡單序列重復(simple sequencerepeats, SSR)，是指以1_6個核苷酸為基本重復單位的串聯重復序列，廣泛存在于各類真核生物基因組中。SSR具有豐富的多態性且均勻分布于整個基因組、以孟德爾方式遺傳、操作簡單、共顯性和重復性好，可進行自動化分析，并用于干燥樣本的分析等優點。微衛星位點可以提供具高分辨率的遺傳信息，這一特點使微衛星既適合于個體水平上的研究，又適合于種群水平上的研究。在個體水平上包括個體識別、交配系統和親本分析、基因流等研究；在種群水平上微衛星可用于遺傳結構、有效種群大小、種群的系統發育重建等研究。毋 庸置疑，SSR標記目前已成為居群遺傳學最流行的分子標記，但是，由于SSR標記具有種屬特異性，當所研究的目標物種缺乏前期研究基礎而無法獲得現成的SSR分子標記時，需要對其進行分子標記開發工作。采取實驗室手段開發SSR引物費時，耗力，成本高，試驗復雜，基于現有轉錄組數據庫信息進行SSR引物開發將是一種既經濟又有效的方法。從表達序列標簽(expressed sequence tag, EST)中開發SSR標記(EST-SSR)是近年來發展起來的新型分子標記，與基因組SSR相比，它反映了基因組的編碼區域，可以直接獲得基因表達的信息，有可能對決定重要表型性狀的等位基因進行直接鑒定；充分利用了現有測序數據，降低了開發成本；在不同物種間通用性好，具有較高的轉移性。自2000年起，已相繼水稻、小麥、馬鈴薯、葡萄、核桃、甜瓜等多種植物上開展了 EST-SSR標記開發，并廣泛用于遺傳圖譜構建、遺傳多樣性分析、功能基因定位、比較作圖等研究。美I 崖豆藤(Callerya speciosa Champ.),為豆科蝶形花亞科雞血藤屬多年生藤狀灌木植物，是一種分布于熱帶和亞熱帶地區的野生名貴南藥，具有悠久的藥用歷史，以根入藥(藥材名牛大力)，主治風濕性關節炎、腰肌勞損、慢性支氣管炎、慢性肝炎、遺精、白帶等，廣泛地應用于多種中成藥方劑的配制(《全國中草藥匯編》編寫組，1996)，此外，還可用于熬制靚湯，藥食兼用，具有極大的開發利用價值，是一種重要的經濟藥用植物資源。然而，我國美麗崖豆藤的人工馴化栽培才剛起步，其藥材原料主要依賴野生資源，隨著市場需求的與日俱增，長期的供不應求帶來的掠奪性開發和不合理采挖，已經造成美麗崖豆藤種質資源的極大破壞，廣西、廣東的野生資源已經瀕臨枯竭，海南尚有一定的野生資源，但其蘊藏量也十分有限，多呈斑塊狀零星分布。目前，國內需要的牛大力藥材多從越南進口，但產地國開始采取措施保護本國的生態環境和資源，限制了出口量，這將在很大程度上影響我國對牛大力的用藥需求。可見對美麗雞血藤野生資源的保護已迫在眉睫了，但要制定切實有效的保護計劃，就必須了解野生種群結構和遺傳多樣性等方面的信息。現有的通用型分子標記，如RAPD、ISSR等，存在重復性差的嚴重缺陷，為顯性標記且存在共遷移缺點；AFLP雖然具有多態性高，重復性好，穩定可靠和選擇中性等優點，但仍為顯性標記且操作難度大。相比而言，SSR操作簡單，客觀明確，選擇中性和呈共顯性的孟德爾式遺傳，能夠鑒別雜合體，對隱性性狀的選擇十分有利，它具有比其它分子標記(如等位酶、RFLP. RAPD等)更多的可檢測等位基因，能夠提供更細致的基因變化分析范圍。但美麗雞血藤的SSR標記尚未見報道。
發明內容
本發明的目的在于提供一種美麗雞血藤的EST-SSR分子標記，建立美麗雞血藤微衛星的技術體系并利用這套分子標記進行美麗雞血藤的遺傳多樣性研究和親權關系鑒定。為了實現上述目的，本發明的技術方案為提供一種美麗雞血藤EST-SSR標記，其特征在于所述的微衛星標記編號為Ndl—001、Ndl—002、Ndl—003、Ndl—004、Ndl—010、Ndl—011、Ndl—013、Ndl—015、Ndl—019、Ndl—020、Ndl—021、Ndl—022、Ndl—028、Ndl—031、Ndl—032、Ndl—033、Ndl—038、Ndl—042、Ndl—043、Ndl—047、Ndl—049、Ndl—050、Ndl—051、Ndl—053 ； 其核苷酸序列分別為Ndl—001 ctcactcgta gccgttccgc tatcctcagc ataagcatct cgacacattc gatctctaga60atcttcttat tatccttctt tatctttcta ctatggcttg ctccaccgtt gtgttgatgc120tagtcgctgc attgttggtg agctccaccg ttgctcaatc tctggcatcg tcgccggctt180cgtctcccac caactcgcct gtggccactc cgccgaagtc ttctcactct ccggcgccgg240tgatttctcc gtccgctagt tcaccggcgg catctcctcc tgctccggtg gagagcggtc300cctctccttc gcctgccgcc gtcaactctc cgccatctcc tcctccggct gcctctgcgt360cgccagctgg cactccttcg gtcactccct cttcgatctc cagtccgcca tctgaagcac420catcaccaag ccaaaacgac gccgctttga acagattcac cgtcgccgga tctgctgctg480ttgtggtttt cgctgcggct ttgctgatgt agagagagag agagagagag agagagacag540agttacttgg agtcaataat tttcttcctt ttttttaatt ctatattcac gaaattatat600ggatcgtgaa cccttgtacc tcatttttgg ttgctcttct cagtgtgacg attcattctt660tcgattattt tctgtattct atttattatt ctatga696Ndl—002 ggaagactcg gagtgattga tggaggcaat gctttcaatc aatttgttgg tgtagagttc60gatagttatg tcaatgggtg ggatccgaat tctgcacata ttggaatcga cgtcaactct120ttgatttcgt tgaagacagt gaaatggaac agggtgagtg ggtcattggt ccaagtgagc180ataatctatg actctctgtc taagacattg agtgttgctg tgactgacaa gaatggtcaa240atttctaccg ttgctcaagt cgttgatttg aaagctgtgc tcccggagaa ggtcaaggtt300ggtctatctg ctgccacatc ttcgggcggc cgtcaaagac acgacatcca ttcatggtct360ttcacttcaa acttggagac ggctacactc agcaccgcgg agaacgcaaa tattgcaagc420tatgcatgat tcctggtccg tcaaatgtgg cttgtgataa ctagtatttc taaataaagg480ccatatatct agtcaatata tatatatata tatatgtgtg tgtgtgtgtt tgagtccatg540catgttgctt aaattttggc tactcaactt atgcaaggtg ggtggttgaa aatggaatta600tgtttgtcct actcgaa617
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權利要求
1.美麗雞血藤EST-SSR標記，其特征在于所述的微衛星標記編號為Ndl—001、Ndl—002、Ndl—003、Ndl—004、Ndl—010、Ndl—011、Ndl—013、Ndl—015、Ndl—019、Ndl—020、Ndl—021、Ndl—022、Ndl—028、Ndl—031、Ndl—032、Ndl—033、Ndl—038、Ndl—042、Ndl—043、Ndl—047、Ndl—049、Ndl—050、Ndl—051、Ndl—053 ； 其核苷酸序列分別為Ndl—001 ctcactcgta gccgttccgc tatcctcagc ataagcatct cgacacattc gatctctaga60atcttcttat tatccttctt tatctttcta ctatggcttg ctccaccgtt gtgttgatgc120tagtcgctgc attgttggtg agctccaccg ttgctcaatc tctggcatcg tcgccggctt180cgtctcccac caactcgcct gtggccactc cgccgaagtc ttctcactct ccggcgccgg240tgatttctcc gtccgctagt tcaccggcgg catctcctcc tgctccggtg gagagcggtc300cctctccttc gcctgccgcc gtcaactctc cgccatctcc tcctccggct gcctctgcgt360cgccagctgg cactccttcg gtcactccct cttcgatctc cagtccgcca tctgaagcac420catcaccaag ccaaaacgac gccgctttga acagattcac cgtcgccgga tctgctgctg480ttgtggtttt cgctgcggct ttgctgatgt agagagagag agagagagag agagagacag540agttacttgg agtcaataat tttcttcctt ttttttaatt ctatattcac gaaattatat600ggatcgtgaa cccttgtacc tcatttttgg ttgctcttct cagtgtgacg attcattctt660 tcgattattt tctgtattct atttattatt ctatga696 Ndl—002 ggaagactcg gagtgattga tggaggcaat gctttcaatc aatttgttgg tgtagagttc60gatagttatg tcaatgggtg ggatccgaat tctgcacata ttggaatcga cgtcaactct120ttgatttcgt tgaagacagt gaaatggaac agggtgagtg ggtcattggt ccaagtgagc180ataatctatg actctctgtc taagacattg agtgttgctg tgactgacaa gaatggtcaa240atttctaccg ttgctcaagt cgttgatttg aaagctgtgc tcccggagaa ggtcaaggtt300ggtctatctg ctgccacatc ttcgggcggc cgtcaaagac acgacatcca ttcatggtct360ttcacttcaa acttggagac ggctacactc agcaccgcgg agaacgcaaa tattgcaagc420tatgcatgat tcctggtccg tcaaatgtgg cttgtgataa ctagtatttc taaataaagg480ccatatatct agtcaatata tatatatata tatatgtgtg tgtgtgtgtt tgagtccatg540catgttgctt aaattttggc tactcaactt atgcaaggtg ggtggttgaa aatggaatta600 tgtttgtcct actcgaa617 Ndl—003 gcacccccca ctcccttccc ctctctctcc tattatcgct tccgtacaac aaatcatgtg60agattactgc ttaccgtctc taatctctac cctctccttg cccagtattt ggtggtgtaa120tcatcgctag ccagctcttc cttcacaatc ctccaaaaaa cacccttccc acttcgacat180ctcttagcta gatttcaaca taaatgaaat tttacttatg cagctgaagg tgtcttccat240accataatat atatatatat atccattata tatcaaaata ttagttttta gggttttaag300ttgtgcacct ttctacgaat ttgaaataat taaaggatta tgctagtagt acctgttgat360tgaagaagct cttgttcagc tgggttagat atagttgagt gagagagttt tgatttctaa420gtggaaaaat taaatggagg aatacaccag taatcacatg agcgaaaaca caagtccaag480tccaagggca aatttgttct actccccggc cggtgattca agcgtaggaa accggcatca540tgactttccc atcaacaact ttcatcttca attgggtgga tcggatcact gctttcaatc600tgatcaagta ccacaccctt ccgtgaaaac cgagtccaac aactcgcagc tccaccctcc660tattttccac tatccgctga tgatgagagg aaatct696Ndl—004 gaatccggca cgaggctttc ccacactctg cagcaacgta actgcttctc ccaaattacc60aaaaaaacaa aagagaaata aatatttagt aagaattagt tacgtgacgt gttattatta120tggcgccgag ggataagacg ggtggcgtta aggtgaacgg caacggtaac ggcggcgtga180aggaggtgca ttttcgggga gtgaggaaga ggccgtgggg gagatacgcc gcggagatca240gagatcccgg caagaagagc cgcgtttggc tcggcacctt tgacacggcg gaagaggcgg300cgcgagccta cgacgccgcc gcacgcgagt tccgcggccc caaggccaaa accaacttcc360ccttcccttc cgacaatgtc aagatccaga gccccagcca gagcagcacc gtcgaatcct420ccagccgcga ccgcgacgcc gccgccgccg ccgccgattc ctccccgctc gacctcaact480tggcccccgc cgccgtcgcc gcccccgttc ggttcccctt ccagcatcag ttcccgccga540tgccgcccgc aaaccaggcg ttttacttcg acgccgtcct acgctccggc atgctgggtt600cccttccgtg ccagggcttc gggttcaatt ataaccaccc cgtggcggcg agtgagtttc660acgcgacggc gggagcgcaa agcgactcg689Ndl—010 cggcgacgcc gttactgcgg ggacccaagg agatgaaagc ggggcagcgg acgtagaggt60ggtaacggcc ggagatgaag gcgccaacct tccaacggac cctgccgtca atcttgacgg120tgacgaggac gttaccgttg gactggtcct gagtgaggcc cacgaagttg aagggggcga180cggggacgtc ggtgccgtag acaaacggcg accaaacgtc gacctctttg tggccttggt240aagagggagg gatggcggtg cggtaagtga cctgctggct ccggtaactg acgtaggtgt300cgagacggtc gtagtagact ccgatgtggt cgttggggtt gcgcgaggag agggtgactt360ggaagttgga ggttaagaag tttggtacgg tggcgttgaa ggcgtaaacg gtgacgtctt420ggaggatgaa ggatggcttg gagggtctta ggattgccca tatgagaagg attgctacga480ggacgatgaa gaggaatact atgattcccc agaatatgcg ccggaagatc ctcctcttcc540tccccttgtg gtgctcgcac tccttcaccg acatgattat gcgctcttct tcttcttctt600tattttttaa ggtgaagtga aagtgaagag tgggggcgag tgtgtttagc tgaaactatc660tatgaagaat aattaagata ttgattggga caagagcggg ggactagaag tctagaagtg720aggagcaacg gcagaggaaa ttatagaatg attttgtttg tgaggggaag gaattatggg780gaggtttcg789Ndl—Oil caatctagat tctaaaacca gcgaatgagg cccaagtcca actactatgt acaggaacaa60attaatccca actaactgaa aaaagaggga aaaaaaaaaa actacggagt aattaatttg120gatctgttga ttagtattgg gggattttat ttttggtgac tagtagtggg ggatttcaag180cttgggtatg gtgaaaagac ggggcttctt cgctggatga gggctggaga cctcgtcgtc240cacgaagaac ttgttggaaa agtccggaaa agccgggagg ttgagatcga agtcgcggtg300gtggctgtga gaggaaccaa ctccttccga ggcagtgacg gcgctgttgc cgccaccgcc360
2.根據權利要求I所述的美麗雞血藤EST-SSR標記，其特征在于所述的Ndl_001、 Ndl_002、Ndl_003、Ndl_004、Ndl_010、Ndl_011、Ndl_013、Ndl_015、Ndl_019、Ndl_020、 Ndl_021、Ndl_022、Ndl_028、Ndl_031、Ndl_032、Ndl_033、Ndl_038、Ndl_042、Ndl_043、 Ndl_047、Ndl_049、Ndl_050、Ndl_051、Ndl_053 24 個位點的引物序列分別為
全文摘要
本發明公開了一種美麗雞血藤EST-SSR分子標記，主要包括美麗雞血藤EST序列的獲得及預處理、EST序列中SSR位點的篩選、EST-SSR引物的設計、合成與引物篩選。從1573條EST序列中搜索到62條含不同簡單序列重復單元的、符合條件的序列；篩選得到24個多態性豐富的EST-SSR分子標記Ndl_001、Ndl_002、Ndl_003、Ndl_004、Ndl_010、Ndl_011、Ndl_013、Ndl_015、Ndl_019、Ndl_020、Ndl_021、Ndl_022、Ndl_028、Ndl_031、Ndl_032、 Ndl_033、Ndl_038、Ndl_042、Ndl_043、Ndl_047、Ndl_049、Ndl_050、Ndl_051、Ndl_053。本發明可應用于美麗雞血藤及近緣物種的遺傳多樣性評價，雞血藤屬植物種間和居群間的變異和進化關系的研究、種質鑒定和分子標記輔助育種，重復性好、可靠性高，是一種非常有效的分子標記。
文檔編號C12N15/11GK102807986SQ20121031896
公開日2012年12月5日 申請日期2012年9月3日 優先權日2012年9月3日
發明者李麗, 李志英, 徐立, 黃碧蘭, 李克烈 申請人:中國熱帶農業科學院熱帶作物品種資源研究所