Rspo結合劑和其應用的制作方法

Rspo結合劑和其應用的制作方法
【專利摘要】本發明涉及RSPO結合劑和使用該結合劑治療諸如癌等疾病的方法。本發明還提供特異性結合人RSPO蛋白并調節β連環素活性的抗體。本發明還提供使用調節RSPO蛋白的活性的試劑的方法，所述試劑例如為特異性結合RSPO1、RSPO2和/或RSPO3并抑制腫瘤生長的抗體。還描述了治療癌的方法，所述方法包括對具有腫瘤或癌的患者施用治療有效量的本發明的試劑或抗體。
【專利說明】RSPO結合劑和其應用
【背景技術】【技術領域】
[0001]本發明的領域大體上涉及結合包括RSPOl、RSP02和RSP03在內的R-反應蛋白(RSPO)(特別是人R-反應蛋白)的抗體和其他試劑，以及使用所述抗體或其他試劑來治療諸如癌等疾病的方法。
[0002]【背景技術】
[0003]蛋白質的R-反應蛋白(RSPO)家族在脊椎動物中是保守的，并且包括四個成員，RSPOl、RSP02、RSP03和RSP04。這些蛋白被以各種名稱相稱，包括頂板特異性反應蛋白、hPWTSR(hRSP03)、THS2D(RSP03)、Cristinl_4 和 Futrinl-4。RSPO 是小的分泌蛋白，其共享約40%至60%的序列同源性和結構域組織。所有的RSPO蛋白在N-末端含有兩個弗林蛋白酶(furin)樣富半胱氨酸結構域，其連著血小板反應蛋白結構域以及堿性帶電C末端尾部(Kim 等，2006，Cell Cycle, 5:23-26)。
[0004]研究已經顯示，RSPO蛋白在脊椎動物發育(Kamata等，2004，Biochim.BiophysActa, 1676:51-62)期間和在非洲爪蟾肌發生(Kazanskaya 等,2004, Dev.Cell, 7:525-534)中起作用。RSPOl還據顯示充當胃腸上皮細胞用的強效絲裂原(Kim等，2005，Science, 309:1256-1259)。已知RSPO蛋白激活與Wnt信號傳導相似的β連環素信號傳導，但是仍正在研究RSPO蛋白和Wnt信號傳導之間的關系。已經報道RSPO蛋白對Wnt配體擁有正向調節活性(Nam等，2006，JBC281:13247-57)。該研究報道了 RSPO蛋白能夠充當 Frizzled8和LRP6受體配體，并誘導β連環素信號傳導(Nam等，2006，JBC281:13247-57)。近期研究已經鑒定了 RSPO蛋白和諸如LGR5等LGR(富含亮氨酸重復的G蛋白偶聯受體)蛋白之間的相互作用(美國專利公開第2009/0074782和2009/0191205號)，這些數據提出了 β -連環素信號傳導的激活的替代途徑。
[0005]Wnt信號傳導途徑已被鑒定為癌治療的潛在靶標。Wnt信號傳導途徑是胚胎模式形成、胚胎后組織維持和干細胞生物學的數種關鍵調節因素之一。更具體而言，fct信號傳導在細胞極性的產生和細胞命運特化(包括干細胞群的自我更新)中起重要作用。不受調節的Wnt途徑的激活與許多人類癌癥有關，據信在所述癌癥中這樣的激活能夠改變細胞的發育命運。fct途徑的激活可以將腫瘤細胞保持在未分化狀態和/或導致不受控的增殖。因此癌變可以通過壓制控制正常發育和組織修復的體內平衡機制進行(在Reya&Clevers，2005，Nature, 434:843-50; Beachy 等，2004，Nature, 432:324-31 中綜述)。
[0006]Wnt信號傳導途徑首次在果蠅發育突變無翼體(wg)中闡明，并且來自鼠類原癌基因 int_l (現在的 Wntl) (Nusse&Varmus, 1982, Cell, 31:99-109; Van Ooyen&Nusse, 1984, Ce11，39:233-40;Cabrera等，1987，Cell, 50:659-63;Ri jsewi jk等，1987，Cell, 50:649-57)。Wnt基因編碼分泌的脂修飾的糖蛋白，所述糖蛋白在哺乳動物中已被鑒定出其中的19個。這些分泌的配體激活由Frizzled(FZD)受體家族成員和低密度脂蛋白(LDL)受體相關蛋白5或6(LRP5/6)組成的受體復合物。FZD受體是G蛋白偶聯受體(GPCR)超家族的7個跨膜結構域蛋白，并且含有具有10個保守性半胱氨酸的大的細胞外N末端配體結合結構域，該結構域被稱為富半胱氨酸結構域(CRD)或Fri結構域。存在10種人FZD受體，FZDU FZD2、FZD3、FZD4、FZD5、FZD6、FZD7、FZD8、FZD9 和 FZDlOo 不同的 FZD CRD 對特定的fct蛋白具有不同的結合親和性(Wu&Nusse, 2002, J.Biol.Chem.，277:41762-9)，因此將FZD受體分類為激活典型β連環素途徑的受體和激活非典型途徑的受體(Miller等，1999，Oncogene, 18:7860-72)。
[0007]在經附近注射鼠類病毒而轉化的乳腺瘤中將Wntl (最初稱為inti)鑒定為致癌基因后，首次揭示了 Wnt信號傳導在癌中的作用(Nusse&Varmus, 1982, Cell, 31:99-109)。近期還已經積累了 fct信號傳導在乳腺癌中的作用的額外證據。例如，乳腺中β-連環素的轉基因過表達導致增生和腺癌(Imbert等，2001，J.Cell Biol.，153:555-68;Michaelson&Leder, 2001, Oncogene, 20:5093-9)，而Wnt信號傳導的喪失干擾正常的乳腺發育(Tepera 等，2003，J.Cell Sc1.，116:1137_49;Hatsell 等，2003，J.Mammary GlandBiol.Neoplasia, 8:145-58)。在人乳腺癌中，β -連環素累積在超過50%的癌中涉及激活的fct信號傳導，雖然尚未鑒定出具體的突變，但是觀察到Frizzled受體表達的上調(Brennan&Brown, 2004, J.Mammary Gland Biol.Neoplasia, 9:119-31;Malovanovic等，2004，Int.J.0ncol.，25:1337-42)。
[0008]Wnt途徑的激活還與結直腸癌相關。所有結直腸癌中的約5%至10%遺傳有作為家族性腺瘤性息肉病(FAP)的主要形式之一，該疾病是一種常染色體顯性疾病，其中約80%的受影響個體含有腺瘤性結腸息肉病(APC)基因中的種系突變。還在包括Axin和β-連環素在內的其他fct途徑組分中鑒定出突變。個體的腺瘤是含有第二失活等位基因的上皮細胞的克隆外生長物，大量的FAP腺瘤必然通過致癌基因和/或腫瘤抑制基因的另外突變導致腺癌的發展。此外，fct信號傳導途徑的激活，包括APC中的功能喪失突變和β-連環素中的穩定化突變，能夠誘導小鼠模型中的增生性發育和腫瘤生長(Oshima等，1997，CancerRes.，57:1644-9; Hara da 等，1999，EMBO J.，18:5931-42)。
[0009]與乳腺癌和結腸癌相似，黑素瘤經常具有Wnt途徑的組成性激活，這可以通過β-連環素的細胞核累積表明。將fct/β-連環素途徑在一些黑素瘤和細胞系中的激活歸因于諸如APC、ICAT、LEF1和β -連環素等途徑組分的修飾(例如參見Larue等，2006，Frontiers Biosc1., 11:733-742)。但是，關于Wnt/ β -連環素信號傳導在黑素瘤中的確切作用在文獻中存在矛盾的報道。例如，一個研究從黑素瘤發現細胞核連環素的水平升高與存活率提高相關，并且發現激活的fct/ β -連環素信號傳導與細胞增殖減少相關(Chien 等，2009，PNAS, 106:1193-1198)。
[0010]癌藥物研究的焦點正在轉向以參與人癌的基因、蛋白質和途徑為目標的靶向治療。對于靶向信號傳導途徑的新型試劑和靶向能夠為癌患者提供治療益處的多種途徑的新型試劑組合存在需要。因此，干擾β-連環素信號傳導的生物分子(例如抗-RSPO抗體)是癌以及其他β-連環素相關疾病的新型治療劑的潛在來源。

【發明內容】

[0011]本發明提供諸如抗體等結合RSPO蛋白的結合劑，以及包含所述結合劑的組合物，例如藥物組合物。在一些實施方式中，RSPO-結合劑是諸如抗體、抗體片段等新型多肽以及涉及此類抗體的其他多肽。在一些實施方式中，所述結合劑是特異性結合人RSP01、RSP02和/或RSP03的抗體。本發明還提供通過對具有腫瘤的受試對象施用所述RSPO-結合劑而抑制腫瘤生長的方法。本發明還提供通過對有需要的受試對象施用所述RSPO-結合劑而治療癌的方法。在一些實施方式中，治療癌或抑制腫瘤生長的方法包括用所述RSPO-結合劑靶向癌干細胞。在一些實施方式中，所述方法包括減少腫瘤中癌干細胞的頻率、減少腫瘤中癌干細胞的數量、減少腫瘤的致瘤性(tumorigenicity)和/或通過減少腫瘤中癌干細胞的數量或頻率來減少腫瘤的致瘤性。
[0012]在一個方面，本發明提供諸如抗體等特異性結合人RSPOl的結合劑。在一些實施方式中，所述RSPOl-結合劑在人RSPOl的21~263位氨基酸內結合。在一些實施方式中，所述RSPOl-結合劑在人RSPOl的34~135位氨基酸內結合。在一些實施方式中，所述RSPOl-結合劑在人RSPOl的91~135位氨基酸內結合。在一些實施方式中，所述RSPOl-結合劑(例如抗體)特異性結合選自由RSP02、RSP03和RSP04組成的組中的至少一種其他人RSPO0在一些實施方式中，所述RSPOl-結合劑或抗體調節β-連環素活性，是β-連環素信號傳導的拮抗劑，抑制β_連環素信號傳導和/或抑制β_連環素的激活。在一些實施方式中，所述RSPOl-結合劑抑制RSPOl信號傳導。在一些實施方式中，所述RSPOl-結合劑抑制或干擾RSPOl與一種或多種LGR蛋白(例如LGR4、LGR5和/或LGR6)的結合。在一些實施方式中，所述RSPOl-結合劑抑制RSPOl與LGR5的結合。
[0013]在另一個方面，本發明提供諸如抗體等特異性結合人RSP02的結合劑。在一些實施方式中，所述RSP02-結合 劑在人RSP02的22~243位氨基酸內結合。在一些實施方式中，所述RSP02-結合劑在人RSP02的22~205位氨基酸內結合。在一些實施方式中，所述RSP02-結合劑在人RSP02的34~134位氨基酸內結合。在一些實施方式中，所述RSP02-結合劑在人RSP02的90~134位氨基酸內結合。在一些實施方式中，所述RSP02-結合劑(例如抗體)特異性結合選自由RSPOl、RSP03和RSP04組成的組中的至少一種其他人RSP0。在一些實施方式中，所述RSP02-結合劑或抗體調節β-連環素活性，是β_連環素信號傳導的拮抗劑，抑制β_連環素信號傳導和/或抑制β_連環素的激活。在一些實施方式中，所述RSP02-結合劑抑制RSP02信號傳導。在一些實施方式中，所述RSP02-結合劑抑制或干擾RSP02與一種或多種LGR蛋白(例如LGR4、LGR5和/或LGR6)的結合。在一些實施方式中，所述RSP02-結合劑抑制RSP02與LGR5的結合。
[0014]在各個上述方面和實施方式中的一些實施方式以及本文所述的其他方面和實施方式中，所述RSPO-結合劑是抗體。在一些實施方式中，所述抗體是單克隆抗體。在一些實施方式中，所述抗體是人源化抗體。在一些實施方式中，所述抗體結合人RSPOl。在一些實施方式中，所述抗體結合人RSPOl和小鼠RSPOl。在一些實施方式中，所述抗體以小于InM的Kd結合人RSPOl和以小于InM的Kd結合小鼠RSPOl。
[0015]在一些實施方式中，所述RSPOl-結合劑是抗體，所述抗體含有包含TGYTMH (SEQID NO: 12)的重鏈 CDRl、包含 GINPNNGGTTYNQNFKG(SEQ ID NO: 13)的重鏈 CDR2 和包含KEFSDGYYFFAY(SEQ ID NO: 14)的重鏈⑶R3。在一些實施方式中，所述抗體還含有包含KASQDVIFAVA (SEQ ID NO: 15)的輕鏈 CDR1、包含 WASTRHT (SEQ ID NO: 16)的輕鏈 CDR2 和包含QQHYSTPff (SEQ ID NO: 17)的輕鏈CDR3。在一些實施方式中，所述RSPOl-結合劑是抗體，所述抗體含有包含 KASQDVIFAVA (SEQ ID NO: 15)的輕鏈 CDRl、包含 WASTRHT (SEQ ID NO: 16)的輕鏈CDR2和包含QQHYSTPW(SEQ ID NO: 17)的輕鏈CDR3。在一些實施方式中，所述RSPOl-結合劑是抗體，所述抗體含有:(a)包含TGYTMH(SEQ ID NO: 12)的重鏈CDR1，或者包含1、2、3或4個氨基酸取代的其變體；(b)包含GINPNNGGTTYNQNFKG (SEQ ID NO: 13)的重鏈CDR2，或者其包含1、2、3或4個氨基酸取代的變體；(c)包含KEFSDGYYFFAY (SEQ ID NO: 14)的重鏈CDR3，或者其包含1、2、3或4個氨基酸取代的變體；(d)包含KASQDVIFAVA (SEQ ID NO: 15)的輕鏈CDRl，或者其包含1、2、3或4個氨基酸取代的變體；(e)包含WASTRHT (SEQ ID NO: 16)的輕鏈⑶R2，或者其包含1、2、3或4個氨基酸取代的變體；和(f)包含QQHYSTPW(SEQ IDNO: 17)的輕鏈⑶R3，或者其包含1、2、3或4個氨基酸取代的變體。在一些實施方式中，氨基酸取代是保守性氨基酸取代。
[0016]在一些實施方式中，所述RSPOl-結合劑是抗體，所述抗體包含:(a)與SEQ IDNO: 10具有至少80%序列同一性的重鏈可變區和/或(b)與SEQ ID NO: 11具有至少80%序列同一性的輕鏈可變區。在一些實施方式中，所述RSPOl-結合劑是抗體，所述抗體包含:(a)與SEQ ID NO: 10具有至少90%序列同一性的重鏈可變區；和/或(b)與SEQ ID NO: 11具有至少90%序列同一性的輕鏈可變區。
[0017]在一些實施方式中，所述RSPOl-結合劑是抗體，所述抗體包含:(a)與SEQ IDNO: 55具有至少80%序列同一性的重鏈可變區；和/或(b)與SEQ ID NO: 59具有至少80%序列同一性的輕鏈可變區。在一些實施方式中，所述RSPOl-結合劑是抗體，所述抗體包含:(a)與SEQ ID NO: 55具有至少90%序列同一性的重鏈可變區；和/或(b)與SEQ ID NO: 59具有至少90%序列同一性的輕鏈可變區。
[0018]在一些實施方式中，所述RSPOl-結合劑是單克隆抗體89M5，由在2011年6月30日保藏的ATCC保藏號為PTA-11970的雜交瘤細胞系89M5產生。在一些實施方式中，所述RSPOl-結合劑是抗體89M5的人源化形式。在一些實施方式中，所述RSPOl-結合劑是人源化單克隆抗體h89M5-H2L2。
[0019]在一些實施方式中，所述RSP02-結合劑是結合人RSP02的抗體。在一些實施方式中，所述抗體結合人RSP02和小鼠RSP02。在一些實施方式中，所述抗體含有包含SSYAMS(SEQ ID NO:29)的重鏈 CDR1、包含 SISSGGSTYYPDSVKG(SEQ ID NO:30)的重鏈 CDR2和包含RGGDPGVYNGDYEDAMDY (SEQ ID NO: 31)的重鏈CDR3。在一些實施方式中，所述抗體還含有包含 KASQDVSSAVA (SEQ ID NO:32)的輕鏈 CDRl、包含 WASTRHT (SEQ ID NO: 33)的輕鏈CDR2和包含QQHYSTP (SEQ ID NO: 34)的輕鏈CDR3。在一些實施方式中，所述RSP02-結合劑是抗體，所述抗體含有包含KASQDVSSAVA (SEQ ID NO:32)的輕鏈CDRl、包含WASTRHT (SEQ IDNO:33)的輕鏈CDR2和包含QQHYSTP (SEQ ID NO:34)的輕鏈CDR3。在一些實施方式中，所述RSP02-結合劑是抗體，所述抗體含有:(a)包含SSYAMS (SEQ ID NO: 29)的重鏈CDRl，或者其包含1、2、3或4個氨基酸取代的變體；(b)包含SISSGGSTYYPDSVKG(SEQ ID NO: 30)的重鏈CDR2，或者其包含 1、2、3或4個氨基酸取代的變體；(c)包含RGGDPGVYNGDYEDAMDY(SEQID N0:31)的重鏈⑶R3，或者其包含1、2、3或4個氨基酸取代的變體；(d)包含KASQDVSSAVA (SEQ ID NO:32)的輕鏈CDRl，或者包含1、2、3或4個氨基酸取代的其變體；(e)包含WASTRHT (SEQ ID NO:33)的輕鏈CDR2，或者其包含1、2、3或4個氨基酸取代的變體；和(f)包含QQHYSTP (SEQ ID NO: 34)的輕鏈CDR3，或者其包含1、2、3或4個氨基酸取代的變體。在一些實施方式中，氨基酸取代是保守性氨基酸取代。[0020]在一些實施方式中，所述RSP02-結合劑是抗體，所述抗體包含:(a)與SEQ IDNO: 27具有至少80%序列同一性的重鏈可變區；和/或(b)與SEQ ID NO: 28具有至少80%序列同一性的輕鏈可變區。在一些實施方式中，所述RSP02-結合劑是抗體，所述抗體包含:(a)與SEQ ID NO: 27具有至少90%序列同一性的重鏈可變區；和/或(b)與SEQ ID NO: 28具有至少90%序列同一性的輕鏈可變區。
[0021]在一些實施方式中，所述RSP02-結合劑是抗體，所述抗體包含:(a)與SEQ IDNO:63具有至少80%序列同一性的重鏈可變區；和/或(b)與SEQ ID NO:67具有至少80%序列同一性的輕鏈可變區。在一些實施方式中，所述RSP02-結合劑是抗體，所述抗體包含:(a)與SEQ ID NO:63具有至少90%序列同一性的重鏈可變區；和/或(b)與SEQ ID NO:67具有至少90%序列同一性的輕鏈可變區。
[0022]在一些實施方式中，所述RSP02-結合劑是抗體，所述抗體包含:(a)與SEQ IDNO:63具有至少80%序列同一性的重鏈可變區；和/或(b)與SEQ ID NO: 76具有至少80%序列同一性的輕鏈可變區。在一些實施方式中，所述RSP02-結合劑是抗體，所述抗體包含:(a)與SEQ ID NO:63具有至少90%序列同一性的重鏈可變區；和/或(b)與SEQ ID NO: 76具有至少90%序列同一性的輕鏈可變區。
[0023]在一些實施方式中，所述RSP02-結合劑是單克隆抗體130M23，由在2011年8月10日保藏的ATCC保藏號為PTA-12021的雜交瘤細胞系130M23產生。在一些實施方式中，所述RSP02-結合劑是抗體130M23的人源化形式。在一些實施方式中，所述RSP02-結合劑是人源化單克隆抗體hl30M23-HlL2。在一些實施方式中，所述RSP02-結合劑是人源化單克隆抗體 hl30M23-HlL6。
[0024]在另一方面，本發明提 供與本發明的抗體競爭與人RSPO蛋白的特異性結合的結合劑(例如抗體)。在一些實施方式中，所述結合劑(例如抗體)與含有包含SEQ ID NO: 10的重鏈可變區和包含SEQ ID NO: 11的輕鏈可變區的抗體競爭與人RSPOl的特異性結合。在一些實施方式中，所述結合劑(例如抗體)與含有包含SEQ ID NO:55的重鏈可變區和包含SEQ ID NO: 59的輕鏈可變區的抗體競爭與人RSPOl的特異性結合。在一些實施方式中，與所述RSPOl-結合劑競爭的抗體是89M5或h89M5_H2L2。在一些實施方式中，所述結合劑在體外競爭性結合檢驗中與本發明的抗體競爭與RSPOl的特異性結合。
[0025]在一些實施方式中，所述抗體與本發明的抗體(例如89M5)所結合的RSPOl上的表位相同或基本上相同。
[0026]在又一方面，所述結合劑是抗體，所述抗體結合的RSPOl上的表位與本發明的抗體(例如89M5)結合的RSPOl上的表位重疊。
[0027]在另一方面，本發明提供與本發明的抗體競爭與人RSP02的特異性結合的結合劑(例如抗體)。在一些實施方式中，所述結合劑(例如抗體)與含有包含SEQ ID NO: 27的重鏈可變區和包含SEQ ID NO: 28的輕鏈可變區的抗體競爭與人RSP02的特異性結合。在一些實施方式中，所述結合劑(例如抗體)與含有包含SEQ ID NO:63的重鏈可變區和包含SEQID NO:67的輕鏈可變區的抗體競爭與人RSP02的特異性結合。在一些實施方式中，所述結合劑(例如抗體)與含有包含SEQ ID NO:63的重鏈可變區和包含SEQ ID NO: 76的輕鏈可變區的抗體競爭與人RSP02的特異性結合。在一些實施方式中，與所述RSP02-結合劑競爭的抗體是130M23、hl30M23-HlL2或hl30M23-HlL6。在一些實施方式中，所述結合劑在體外競爭性結合檢驗中與本發明的抗體競爭與RSP02的特異性結合。
[0028]在一些實施方式中，所述抗體與本發明的抗體(例如89M5)所結合的RSP02上的表位相同或基本上相同。
[0029]在又一方面，所述結合劑是抗體，所述抗體結合的RSP02上的表位與本發明的抗體(例如130M23)結合的RSP02上的表位重疊。
[0030]在各個上述方面以及本文別處描述的其他方面和/或和實施方式中的一些實施方式中，RSPO-結合劑或抗體是分離的。
[0031]在另一方面，本發明提供包含SEQ ID NO: 10和/或SEQ ID NO: 11的多肽。在另一方面，本發明提供包含SEQ ID NO: 55和/或SEQ ID NO: 59的多肽。在另一方面，本發明提供包含SEQ IDN0:27和/或SEQ ID NO:28的多肽。在另一方面，本發明提供包含SEQ ID NO:63和/或SEQ ID NO:67的多肽。在另一方面，本發明提供包含SEQ ID NO:63和/或SEQ ID NO: 76的多肽。在一些實施方式中，結合RSPOl的多肽含有包含SEQ ID NO: 25和/或SEQ ID NO: 26的多肽。在一些實施方式中，結合RSPOl的多肽含有包含SEQ ID NO: 68和/或SEQ ID NO: 69的多肽。在一些實施方式中，結合RSP02的多肽含有包含SEQ ID NO: 41和/或SEQ ID NO: 42的多肽。在一些實施方式中，結合RSP02的多肽含有包含SEQ ID NO: 70和/或SEQ ID NO: 71的多肽。在一些實施方式中，結合RSP02的多肽含有包含SEQ ID NO: 70和/或SEQ ID NO: 74的多肽。在一些實施方式中，所述多肽是分離的。在一些實施方式中，所述多肽基本上是純的。在一些實施 方式中，所述多肽是抗體。
[0032]在另一方面，本發明提供分離的多核苷酸分子，所述多核苷酸分子包含編碼各個上述方面以及本文描述的其他方面和/或實施方式的抗體和/或多肽。在一些實施方式中，所述多核苷酸包含選自由 SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 23、SEQ ID NO: 24、SEQ IDNO:52、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:56和SEQ ID NO:58組成的組中的序列。在一些實施方式中，所述多核苷酸包含選自由 SEQ ID NO: 35、SEQ ID NO: 36、SEQ ID NO: 39、SEQ ID NO: 40、SEQID NO: 60、SEQ ID NO: 62、SEQ ID NO: 64、SEQ ID NO: 66、SEQ ID NO: 72 和 SEQ ID NO: 75 組成的組中的序列。本發明還提供包含所述多核苷酸的表達載體以及包含所述表達載體和/或多核苷酸的細胞。在一些實施方式中，所述細胞是雜交瘤細胞系。在一些實施方式中，所述細胞是ATCC保藏號為PTA-11970的雜交瘤細胞系。在一些實施方式中，所述細胞是ATCC保藏號為PTA-12021的雜交瘤細胞系。
[0033]在其他方面，本發明提供抑制腫瘤生長的方法，所述方法包括使所述腫瘤與有效量的RSPO-結合劑或抗體(包括本文描述的每種RSPO-結合劑或抗體)接觸。
[0034]在另一方面，本發明提供抑制受試對象中腫瘤生長的方法，所述方法包括對所述受試對象施用治療有效量的RSPO-結合劑或抗體(包括本文描述的每種RSPO-結合劑或抗體)。
[0035]在另一方面，本發明提供抑制細胞中β_連環素信號傳導的方法，所述方法包括使所述腫瘤與有效量的RSPO-結合劑或抗體(包括本文描述的每種RSPO-結合劑或抗體)接觸。在一些實施方式中，所述細胞是腫瘤細胞。在一些實施方式中，所述腫瘤是結直腸瘤。在一些實施方式中，所述腫瘤是卵巢瘤。在一些實施方式中，所述腫瘤是胰腺瘤。在一些實施方式中，所述腫瘤是肺瘤。在一些實施方式中，所述腫瘤表達的RSPO蛋白中的至少一種的水平升高。在一些實施方式中，所述腫瘤表達的RSPOl水平升高。在一些實施方式中，所述腫瘤表達的RSP02水平升高。在一些實施方式中，所述腫瘤表達的RSP03水平升高。在一些實施方式中，所述RSPO-結合劑例如通過減少腫瘤中癌干細胞的數量和/或頻率而抑制腫瘤生長。
[0036]在另一方面，本發明提供治療受試對象中的癌的方法。在一些實施方式中，所述方法包括對受試對象施用治療有效量的上述RSPO-結合劑或抗體以及本文別處描述的RSPO-結合劑或抗體中的任一種。在一些實施方式中，所述癌是胰腺癌。在一些實施方式中，所述癌是結直腸癌。在一些實施方式中，所述結直腸癌包含在腺瘤性結腸息肉病(APC)基因中的失活突變。在一些實施方式中，所述結直腸癌不包含所述APC基因中的失活突變。在一些實施方式中，所述結直腸癌包含野生型APC基因。在一些實施方式中，所述癌是卵巢癌。在一些實施方式中，所述癌是乳腺癌。在一些實施方式中，所述癌是肺癌。在一些實施方式中，所述癌表達的至少一種RSPO蛋白的水平升高。在一些實施方式中，所述癌是表達升高水平的RSPOl的卵巢癌。在一些實施方式中，所述癌是表達升高水平的RSP02的結腸癌。在一些實施方式中，所述癌是表達升高水平的RSP02的胰腺癌。在一些實施方式中，所述癌是表達升高水平的RSP02的乳腺癌。在一些實施方式中，所述癌是表達升高水平的RSP02的肺癌。
[0037]在另一方面，本發明提供治療受試對象中疾病的方法，其中所述疾病與連環素的激活和/或異常的β_連環素信號傳導相關，所述方法包括施用治療有效量的RSPO-結合劑或抗體(包括本文所述的每種RSPO-結合劑或抗體)。
[0038]在各個上述方面以及本文別處描述的其他方面和/或實施方式中的一些實施方式中，所述治療方法包括將RSPO-結合劑與至少一種另外的治療劑組合施用。在一些實施方式中，所述治療 方法包括將RSPOl-結合劑與諸如RSP02-結合劑、RSP03-結合劑和/或RSP04-結合劑等第二 RSPO-結合劑組合施用。在一些實施方式中，所述治療方法包括將RSP02-結合劑與諸如RSPOl-結合劑、RSP03-結合劑和/或RSP04-結合劑等第二 RSPO-結合劑組合施用。在一些實施方式中，所述治療方法包括將RSPOl-結合劑與RSP02-結合劑組合施用。在一些實施方式中，所述治療方法包括施用RSPOl-結合劑、RSP02-結合劑和化學治療劑的組合。
[0039]在各個上述方面以及本文別處描述的其他方面和/或實施方式中的一些實施方式中，所述治療方法還包括確定所述腫瘤或癌中至少一種RSPO蛋白的水平的步驟。
[0040]在另一方面，本發明提供鑒定人受試對象或選擇人受試對象以用RSPO-結合劑或抗體(包括但不限于本文描述的每種RSPO-結合劑或抗體)進行治療的方法。在一些實施方式中，所述方法包括確定所述受試對象是否具有腫瘤，所述腫瘤具有的特定RSPO(例如RSPOl或RSP02)的表達水平與正常組織中相同的RSPO蛋白的表達相比升高。在一些實施方式中，如果所述腫瘤具有升高的RSPO表達水平，則所述方法包括鑒定治療用受試對象或選擇治療用受試對象。在一些實施方式中，所述方法包括確定所述受試對象是否具有包含APC基因中的失活突變的腫瘤。在一些實施方式中，如果所述腫瘤具有APC基因中的失活突變，則所述方法包括鑒定治療的受試對象或選擇治療的受試對象。
[0041]還提供了包含本文所述的RSPO-結合劑或抗體以及藥學上可接受的載劑的藥物組合物，以及產生所述RSPO-結合劑的細胞系。還提供了治療受試對象(例如人)中的癌和/或抑制受試對象(例如人)中的腫瘤生長的方法，所述方法包括對所述受試對象施用有效量的包含所述RSPO-結合劑的組合物。
[0042]如果本發明的方面或實施方式根據馬庫什分組或其他替代分組進行描述，則本發明不僅涵蓋了作為整體列出的整個組，還單獨涵蓋了所述組的每個成員以及主要組的所有可能的亞組，還涵蓋了缺少一個或多個組成員的主要組。本發明還設想明確排除了在所要求保護的發明中的任意一個或多個組成員。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0043]圖1.腫瘤和正常組織中的RSPO表達。顯示了來自正常組織人樣品、良性組織人樣品和惡性組織人樣品的微陣列數據的總結。各個刻度標記(tick mark)表示RSPOmRNA的表達水平。A) RSP01B) RSP02C) RSP03
[0044]圖2.RSPO蛋白和LGR5的結合研究。表達LGR5的HEK-293細胞的FACS分析。將HEK-293細胞用編碼FLAG-LGR5-CD4TM-GFP的cDNA表達載體瞬時轉染，然后與可溶性RSPOl-Fc, RSP02-Fc、RSP03_Fc或RSP04_Fc融合蛋白混合。使用抗FLAG抗體作為陽性對照，使用可溶性FZD8-FC作為陰性對照。通過在各個FACS圖上的黑線框重疊區(dark linedbox overlay)內信號的存在表示特異性結合。
[0045]圖3.肺瘤細胞條件培養基中抑制活性的鑒定。使用6xTCF_熒光素酶報告基因檢驗來測定HEK-293細胞中的β -連環素信號傳導。在可溶性LGR5-FC的存在下使ΗΕΚ-293細胞暴露至含有Wnt3a L細胞條件培養基的對照培養基(DMEM培養基)或含有肺瘤細胞條件培養基和Wnt3a L細胞條件培養基的培養基。使用可溶性Jag-Fc和抗體LZl作為陰性對照。使用可溶性FZD8-FC和阻 斷Wnt3a的抗-FZD抗體作為陽性對照。以10 μ g/ml使用可溶性LGR5-Fc、Jag-Fc和FZD8_Fc融合蛋白。以40 μ g/ml使用抗-FZD抗體和LZl抗體。
[0046]圖4.β -連環素信號傳導的誘導的抑制。使用6xTCF_熒光素酶報告基因檢驗來測定ΗΕΚ-293細胞中的β -連環素信號傳導。在可溶性LGR5-FC在20 μ g/ml~0.02 μ g/ml的四倍稀釋液存在下，使HEK-293細胞暴露至含有10ng/ml RSP02和25%Wnt3a L細胞條件培養基的培養基(“RSP02”)或含有25%肺瘤細胞條件培養基和25%Wnt3a L細胞條件培養基的培養基(“LT”)；具有LGR5-FC的RSP02 (- □-)和具有LGR5_Fc (- -)的LT。具有RSP02 (_ Λ _)或LT (- ▲-)的20 μ g/ml的可溶性Jag-Fc用作陰性對照。具有RSP02 (- O _)或LT (-.-)的20 μ g/ml的阻斷Wnt3a的可溶性FZD8_Fc用作陽性對照。
[0047]圖5.結合RSPOl的抗體的鑒定。A)融合蛋白FLAG-RSP01弗林蛋白酶-⑶4TM-GFP的圖示。B)所產生的針對人RSPOl的抗體的FACS分析。y軸顯示相對抗體結合,x軸表示FLAG-RSP01弗林蛋白酶-⑶4TM-GFP融合蛋白的表達。通過在各個FACS圖上的黑線框重疊區內信號的存在表示陽性結合。使用抗-FLAG抗體作為陽性對照。使用抗-PE抗體作為陰性對照。
[0048]圖6.抑制由RSPOl誘導的β -連環素信號傳導的抗-RSPOl抗體的鑒定。在濃度漸增的抗-RSPOl 抗體(89Μ2、89Μ4、89Μ5、89Μ7、89Μ19 或 89Μ25)或無關對照抗體(254Μ14或254Μ26)的存在下，在將ΗΕΚ-293細胞暴露至Wnt3a(5ng/ml)和RSPOl (10ng/ml)的組合后，使用TOPflash熒光素酶報告基因檢驗來測定所述HEK-293細胞中的β -連環素信號傳導。抗體以10 μ g/ml~0.625 μ g/ml范圍內的2倍稀釋液使用。對照包括在不存在抗體時暴露至對照培養基(無fct3a和無RSP0)、單獨Wnt3a或者Wnt3a和RSPO的組合。[0049]圖7.阻斷RSP01/LGR5結合的抗-RSPOl抗體的鑒定。表達LGR5的HEK-293細胞的FACS分析。將HEK-293細胞用編碼FLAG-LGR5-⑶4TM-GFP的cDNA表達載體瞬時轉染，然后與組合有各種抗-RSPOl抗體的可溶性RSPO1-Fc融合蛋白混合。用綴合有PE的抗人Fe 二抗檢測結合。y軸顯示相對RSPOl-Fc結合，x軸表示FLAG-LGR5-CD4TM-GFP融合蛋白的表達。通過在各個FACS圖上的黑線框重疊區內信號的存在表示陽性結合。使用抗-PE抗體作為陰性對照。
[0050]圖8.用抗-RSPOl抗體抑制腫瘤生長。將0V19卵巢瘤細胞皮下注入N0D/SCID小
鼠中。用89M5 (-.-)、89M25 (-▼-)、紫杉醇(-?-)、抗體89M5和紫杉醇的組合(_〇_)、
抗體89M25和紫杉醇的組合(_ □-)或者對照抗體1B7.11 (- -)治療小鼠。數據顯示為治療后天數與腫瘤體積(mm3)。
[0051]圖9.抗-RSPOl抗體的表位作圖。A)含有RSPOl結構域的缺失系列的所構建的融合蛋白的圖。這些構建體都包含允許所述蛋白的細胞表面表達的CD4TM結構域。B)抗-RSPOl抗體與用所述融合蛋白轉染的細胞的結合的FACS分析。y軸顯示相對抗體結合，X軸表示所述融合蛋白的表達。使用抗-FLAG抗體作為陽性對照。使用抗-PE抗體作為陰性對照。
[0052]圖10.結合RSP02的抗體的鑒定。所產生的針對人RSP02的抗體的FACS分析。y軸顯示相對抗體結合，X軸表示FLAG-RSP02弗林蛋白酶-⑶4TM-GFP融合蛋白的表達。使用抗-FLAG抗體作為陽性對照。使用抗-PE抗體作為陰性對照。 [0053]圖11.抑制RSP02誘導β -連環素信號傳導的抗-RSP02抗體的鑒定。在針對RSP02 的抗體(mAbsl30M23、130M24、130M25、130M26、130M27 和 130M28)的存在下，在將HEK-293 細胞暴露至 Wnt3a(5ng/ml)和人 RSP02 (10ng/ml)的組合或 Wnt3a (5ng/ml)和人RSP03 (10ng/ml)的組合后，使用TOPflash熒光素酶報告基因檢驗來測定所述HEK-293細胞中的β_連環素信號傳導。對照包括在不存在抗體時暴露至對照培養基(不添加fct3a和沒有RSPO標記的“細胞”)、單獨Wnt3a (經標記的“W3A” )或者Wnt3a和RSPO的組合。
[0054]圖12.阻斷RSP02/LGR5結合的抗-RSP02抗體的鑒定。表達LGR5的HEK-293細胞的FACS分析。將HEK-293細胞用編碼FLAG-LGR5-CD4TM-GFP的cDNA表達載體瞬時轉染，然后與組合有各種抗-RSP02抗體的可溶性RSP02-FC融合蛋白混合。用綴合有PE的抗人Fe 二抗檢測結合。y軸顯示相對RSP02-FC結合，x軸表示FLAG-LGR5-CD4TM-GFP融合蛋白的表達。通過在各個FACS圖上的黑線框重疊區內信號的存在表示陽性結合。使用抗FLAG抗體作為陽性對照，使用抗-PE抗體作為陰性對照。
[0055]圖13.腫瘤細胞條件培養基中抑制活性的鑒定。在可溶性LGR5-Fc、FZD8-Fc或對照融合Fe蛋白的存在下，將STF-293細胞暴露至對照培養基(DMEM培養基)、含有Wnt3aL細胞條件培養基的培養基、含有腫瘤細胞條件培養基的培養基或含有腫瘤細胞條件培養基和Wnt3a L細胞條件培養基的培養基。以10 μ g/ml使用可溶性LGR5_Fc、FZD8_Fc和對照-Fe融合蛋白。從肺瘤LU2 (圖13A)、肺瘤LU25 (圖13B)和卵巢瘤0V38 (圖13C)制備腫瘤細胞條件培養基。
[0056]圖14.β -連環素信號傳導的誘導的抑制。使STF-293與LU2細胞和25%的肺瘤細胞條件培養基以及25%Wnt3a-L細胞條件培養基一起溫育。將抗體130M23(- -)和可溶性LGR5-FC (-.-)以50 μ g/ml~0.0006 μ g/ml范圍內的5倍連續稀釋液添加至所述細胞。使用經過類似稀釋的無關單克隆抗體(-□-)和對照Fe融合蛋白(-Δ -，50 μ g/ml)作為陰性對照。
[0057]圖15.用抗-RSPO抗體抑制腫瘤生長。將PN31胰腺瘤細胞皮下注入N0D/SCID小鼠中。用抗-RSPOl 抗體 89M5(- □-)、抗-RSP02 抗體 130M23(- ▲ _)、吉西他濱(二_)、
抗體89M5和吉西他濱的組合'(-▼-)、抗體130M23和吉西他濱的組合(_ O _)或對照抗體
1B7.11 (-O-)治療小鼠。數據顯示為植入后天數與腫瘤體積(mm3)。
[0058]圖16.用抗-RSPO抗體抑制腫瘤生長。將PN7胰腺瘤細胞皮下注入N0D/SCID小鼠中。用抗-RSP02 抗體 130M23 (-▼->、抗-FZD 抗體 18R5 (-▲-)、吉西他濱(_._)、130M23 和
18R5的組合(-〇-)、130M23和吉西他濱的組合(_□_)、18R5和吉西他濱的組合(_ Λ _)、130M23U8R5和吉西他濱的組合(_ O _)或對照抗體1Β7.11(- -)治療小鼠。數據顯示為治療后天數與腫瘤體積(mm3)(圖16A)。用Wnt途徑抑制劑FZD8_Fc和吉西他濱的組合(-Δ -)、130M23和吉西他濱的組合(_▼-)、130M23、FZD8-Fc和吉西他濱的組合(_?_)、吉西他濱(_.-)或對照抗體1B7.11 (_ _)治療小鼠。數據顯示為治療后天數的腫瘤體積(mm3)(圖16B)。將所得到的腫瘤處理成單細胞懸浮液，并連續移植到小鼠中。將獲自每個治療組的90個腫瘤細胞皮下注入N0D/SCID小鼠中。在不進行治療時使腫瘤生長。數據顯示為第40天的腫瘤體積(mm3)(圖16C)。
[0059]圖17.人源化RSPO抗體的FACS分析。A)人源化89M5抗體(h89M5_H2L2)和親本89M5抗體的FACS分析。測試每種抗體的5倍連續稀釋液。y軸顯示相對抗體結合，X軸表示FLAG-RSP01弗林蛋白酶-⑶4TM-GFP融合蛋白的表達。B)人源化130M23抗體(hl30M23-HlL2)和親本130M23抗體的FACS分析。測試每種抗體的5倍連續稀釋液。y軸顯示相對抗體結合，X軸表示FLAG-RSP02弗林蛋白酶-⑶4TM-GFP融合蛋白的表達。
[0060]圖18.用抗-RSPOl和抗-RSP02抗體抑制腫瘤生長。將B39三重陰性(triplenegative)乳腺癌腫瘤細胞皮下注入N0D/SCID小鼠中。用抗-RSPOl抗體89M5和
抗-RSP02抗體130M23的組合(-O _)、順鉬(-▼-)、89M5U30M23和順鉬的組合(-.-)或
對照抗體1B7.11(--)治療小鼠。數據顯示為治療后天數的腫瘤體積(_3)。
【具體實施方式】
[0061]本發明提供結合RSPO蛋白(例如人RSP01、RSP02和/或RSP03)的新型試劑，包括但不限于多肽，例如抗體。所述RSPO-結合劑包括β-連環素信號傳導的拮抗劑。還提供了相關多肽和多核苷酸、包含所述RSPO-結合劑的組合物以及制造所述RSPO-結合劑的方法。進一步提供了使用上述新型RSPO-結合劑的方法，例如抑制腫瘤生長的方法、治療癌的方法、減少癌干細胞在腫瘤中的頻率的方法、抑制β -連環素信號傳導的方法和/或鑒定和/或選擇治療用受試對象的方法。
[0062]已經鑒定出特異性結合人RSPOl的單克隆抗體:單克隆抗體89Μ2、89Μ4、89Μ5、89Μ7、89Μ19 和 89Μ25 (實施例 5、圖 5)。抗-RSPOl 抗體 89Μ2、89Μ4、89Μ5 和 89Μ25 抑制 β -連環素信號傳導(實施例6、圖6)。抗-RSPOl抗體89Μ2、89Μ4、89Μ5和89Μ25阻斷可溶性RSPOl與LGR5的結合(實施例7、圖7)。隨后，序列數據證明抗體89Μ2、89Μ4、89Μ5和89Μ25含有相同的重鏈和輕鏈可變區，并且據推斷這些抗體會包含相同的抗原結合位點。抗-RSPOl抗體89M4、89M5、89M7和89M25對人和小鼠RSPOl的結合親和性都小于0.1nM(實施例8)。產生了 89M5的人源化版本h89M5-H2L2 (實施例19)，其對人RSPOl的結合親和性小于0.1nM(實施例20)。已經發現抗-RSPOl抗體89M5和89M25在卵巢瘤異種移植物模型中作為單獨的試劑和與化學治療劑組合在體內抑制腫瘤細胞生長(實施例9、圖8)。抗-RSPOl抗體89M5顯示在胰腺瘤異種移植物模型中與化學治療劑組合在體內抑制腫瘤細胞生長(實施例17、圖15)。初步的表位作圖研究表明，抗-RSPOl抗體89M5的結合位點涉及RSPOl的弗林蛋白酶2結構域內的氨基酸(實施例10、圖9)。
[0063]此外，已經鑒定出特異性結合人RSP02的單克隆抗體:單克隆抗體130M23、130M24、130M25、130M26、130M27 和 130M28(實施例 11、圖 10)。抗-RSP02 抗體 130M23、130M24、130M25、130M26、130M27和130M28據顯示會減少或完全阻斷β-連環素信號傳導(實施例12、圖11)。抗-RSP02抗體130Μ23和130Μ24阻斷可溶性RSP02與LGR5的結合(實施例13、圖12)。抗-RSP02抗體130Μ23對人RSP02的結合親和性為0.14ηΜ，對小鼠RSP02的結合親和性為0.35ηΜ(實施例15)。產生了 130Μ23的人源化版本hl30M23_HlL2和hl30M23-HlL6 (實施例19)。抗-RSP02抗體hl30M23_HlL2對人RSP02的結合親和性為0.13nM, hl30M23-HlL6對人RSP02的結合親和性為0.15nM(實施例20)。抗-RSP02抗體130M23顯示在胰腺瘤異種移植物模型中作為單獨試劑和與另外的化學治療劑組合在體內抑制腫瘤細胞生長(實施例17和18、圖15和16)。
[0064]1.定義
[0065]為了便于理解本發明，將許多術語和短語如下定義。
[0066]本文所用的術語“拮抗劑”和“拮抗的”是指任何部分或完全阻斷、抑制、減少或中和靶標和/或信號傳導途徑(例如，β_連環素信號傳導)的分子。本文使用術語“拮抗劑”來包括任何部分或完全阻斷、抑制、減少或中和蛋白質的活性(例如，RSPO蛋白)的分子。合適的拮抗劑分子具體包括但不限于拮抗性抗體或抗體片段。
[0067]本文使用的術語“調節”和“調整”是指生物活性的改變或變化。調節包括但不限于刺激或抑制活性。調節可以是活性的增加或降低(例如RSPO信號傳導的降低、β-連環素信號傳導的降低)、結合特性的改變、或者與蛋白活性、途徑或其他所關注生物點有關的生物、功能或免疫性質上的任何其他改變。
[0068]本文使用的術語“抗體”是指免疫球蛋白分子，其通過免疫球蛋白分子的可變區內的至少一個抗原識別位點識別和特異性結合靶標，例如蛋白質、多肽、肽、碳水化合物、多核苷酸、脂質或者前述的組合。如本文所述，該術語涵蓋了完整的多克隆抗體、完整的單克隆抗體、抗體片段(例如Fab、Fab’、F (ab') 2和Fv片段)、單鏈Fv(scFv)抗體、多特異性抗體(例如由至少兩個完整抗體產生的雙特異性抗體)、單特異性抗體、單價抗體、嵌合抗體、人源化抗體、人抗體、包含抗體的抗原決定部分的融合蛋白和包含抗原識別位點的任何其他經修飾免疫球蛋白分子，只要該抗體展現所需的生物活性即可。基于分別稱為α、δ、ε、Y和μ的抗體的重鏈恒定結構域，抗體可以是免疫球蛋白的五個主要類別中的任一個:IgA、IgD、IgE、IgG 和 IgM，或者其亞類(同種型)(例如，IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl 和 IgA2)。不同類別的免疫球蛋 白具有不同且公知的亞基結構以及三維構型。抗體可以是裸露的，或綴合至其他分子，包括但不限于毒素和放射性同位素。
[0069]術語“抗體片段”是指完整抗體的一部分，并且是指完整抗體的抗原決定可變區。抗體片段的實例包括但不限于Fab、Fab’、F (ab’)2和Fv片段、線性抗體、單鏈抗體以及由抗體片段形成的多特異性抗體。本文使用的“抗體片段”包括抗原結合位點或表位結合位點。
[0070]術語抗體的“可變區”是指抗體輕鏈的可變區和/或抗體重鏈的可變區。重鏈和輕鏈的可變區各自由通過三個互補決定區(CDR)(也稱為“超變區”)連接的四個框架區(FR)組成。各鏈中的CDR通過框架區而保持得相互靠近，并與來自其他鏈的CDR —起促成抗體的抗原結合位點的形成。確定CDR的技術至少有兩種技術:(I)基于交叉物種序列可變性的方法(即，Kabat 等，1991，Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5 版，National Institutes of Health, Bethesda MD)和(2)基于抗原-抗體復合物的晶體研究的方法(Al-Lazikani等，1997，J.Mol.Biol.，273:927-948)。此外，本領域有時使用這兩種方法的組合來確定CDR。
[0071]本文使用的術語“單克隆抗體”是指參與高特異性識別和結合單一抗原決定簇或表位的均勻抗體群體。這與多克隆抗體相反，多克隆抗體通常包括針對不同抗原決定簇的不同抗體的混合物。術語“單克隆抗體”涵蓋了完整和全長單克隆抗體以及抗體片段(例如，Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv)、單鏈(scFv)抗體、包含抗體部分的融合蛋白和包含抗原識別位點(抗原結合位點)的任何其他經修飾免疫球蛋白分子。此外，“單克隆抗體”是指通過任意數量的技術制造的此類抗體，所述技術包括但不限于雜交瘤技術、噬菌體選擇、重組表達和轉基因動物。
[0072]本文使用的術語“人源化抗體”是指非人(例如鼠類)抗體的形式，其是特異性的免疫球蛋白鏈、嵌合免疫球蛋白或其含有最小非人序列的片段。通常，人源化抗體是其中CDR殘基被具有所需特異性、親和性和/或結合能力的非人物種(例如小鼠、大鼠、兔或倉鼠)的⑶R殘基替換的 人免疫球蛋白(Jones等，1986，Nature, 321:522-525; Riechmann等，1988，Nature, 332:323-327; Verhoeyen 等，1988，Science, 239:1534-1536)。在某些情況下，人免疫球蛋白的Fv框架區殘基被來自具有所需特異性、親和性和/或結合能力的非人物種的抗體中的相應殘基替換。人源化抗體可以通過Fv框架區中和/或所替換的非人殘基中的另外殘基的取代而被進一步修飾，從而改善和優化抗體特異性、親和性和/或結合能力。通常，人源化抗體會包含至少一個、通常2個或3個含有所有或基本上所有對應于非人免疫球蛋白的CDR的可變結構域，但所有或基本上所有的框架區是人免疫球蛋白共有序列的框架區。人源化抗體還可以包括免疫球蛋白恒定區或結構域(Fe)的至少一部分，通常是人免疫球蛋白恒定區或結構域(Fe)的至少一部分。用于生成人源化抗體的方法的實例描述于例如美國專利5，225，539。
[0073]本文使用的術語“人抗體”是指由人產生的抗體，或者具有對應于使用任何本領域已知的技術制造的由人產生的抗體的氨基酸序列的抗體。人抗體的該定義特別排除了包含非人抗原結合殘基的人源化抗體。
[0074]本文使用的術語“嵌合抗體”是指其中免疫球蛋白分子的氨基酸序列源自兩種以上物種的抗體。通常，輕鏈和重鏈的可變區對應于源自一個具有所需特異性、親和性和/或結合能力的哺乳動物物種(例如小鼠、大鼠、兔等)，而恒定區與源自另一物種(通常為人)的抗體中的序列是同源的，以避免引起該物種中的免疫響應。
[0075]文使用的短語“親和性成熟抗體”是指在其一個或多個CDR中具有一個或多個改變的抗體，所述改變導致與不擁有這些改變的親本抗體相比，該抗體與抗原的親和性得到改善。優選的親和性成熟抗體會對靶抗原具有納摩爾甚至皮摩爾的親和性。親和性成熟抗體通過本領域已知的步驟產生。例如，Marks等，1992，Bio/TechnologylO:779-783中描述了通過VH和VL結構域重排產生的親和性成熟。Barbas等，1994，PNAS, 91:3809-3813;Schier 等,1995, Gene, 169:147-155;Yelton 等，1995，J.1mmunol.155:1994-2004;Jackson 等，1995，J.1mmunol.，154:3310-9 ;和 Hawkins等，1992，J.Mol.Biol., 226:889-896中描述了 CDR和/或框架殘基的隨機誘變。
[0076]術語“表位”和“抗原決定簇”在本文可以相互替換地使用，并且是指抗原的能夠被特定抗體識別和特異性結合的部分。當抗原是多肽時，表位可以由相鄰的氨基酸以及通過蛋白質的三維折疊而并排的非相鄰氨基酸形成。由相鄰氨基酸形成的表位(也稱為線性表位)通常在蛋白質變性時保留，而由三維折疊形成的表位(也稱為構象表位)通常在蛋白質變性時丟失。表位通常在獨特的空間構象中包括至少3個、更經常至少5個或8~10個氨基酸。
[0077]術語“選擇性結合”或“特異性結合”是指與替代物質(包括不相關蛋白)相比，抗體與表位、蛋白質或靶分子反應或結合得更頻繁、更迅速、更持久、更具親和性或以上情況的一些組合。在一些實施方式中，“特異性結合”例如是指抗體與蛋白結合的Kd為約0.1mM以下，更通常小于約ΙμΜ。在一些實施方式中，“特異性結合”有時是指抗體與靶標結合的Kd為至少約0.1 μ M以下，其他情況下是指為至少約0.01 μ M以下，另外的情況下為至少約InM以下。由于不同物種的同源蛋白之間的序列同一性，特異性結合可以包括在超過一個物種(例如人RSPOl和小鼠RSP01)中識別蛋白質的抗體。類似地，由于不同蛋白質的多肽序列的特定區域內的同源性，特異性結合可以包括識別超過一種蛋白質(例如人RSPOl和人RSP02)的抗體(或其他多肽或結合劑)。應該理解的是，在一些實施方式中，抗體或特異性結合第一靶標的結 合部分可以或不可以特異性結合第二靶標。因此，“特異性結合”不必然要求(但其包括)專一性結合(即與單一靶標結合)。所以，在一些實施方式中，抗體可以特異性結合超過一種祀標。在一些實施方式中，多種祀標可以被抗體上的同一抗原結合位點結合。例如，在一些情況下，抗體可以包括兩個相同的抗原結合位點，每個抗原結合位點特異性結合兩種以上蛋白質(例如RSPOl和RSP02)上的相同表位。在一些替代實施方式中，抗體可以是雙特異性的或多特異性的，并且包含至少兩個具有不同特異性的抗原結合位點。非限制性舉例而言，雙特異性抗體可以包括識別一種蛋白質(例如人RSP01)上的表位的一個抗原結合位點，還包含第二個不同的識別第二蛋白質上的不同表位的抗原結合位點。通常提到結合是指特異性結合，但并非必然如此。
[0078]術語“多肽”和“肽”和“蛋白質”在本文中可以相互替換地使用，并且是指任何長度的氨基酸的聚合物。該聚合物可以是直鏈或支鏈的，其可以包含經修飾氨基酸，并且其可以間插非氨基酸。該術語還涵蓋了通過天然或干預而進行修飾的聚合物，例如二硫鍵形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或任何其他操作或修飾，例如與標記成分綴合。該定義中還涵蓋了例如含有氨基酸的一種或多種類似物(包括例如非天然氨基酸)以及其他本領域已知的修飾的多肽。應該理解的是，由于本發明的多肽可以基于抗體，在一些實施方式中，所述多肽可以作為單鏈或結合鏈出現。
[0079]術語“多核苷酸”和“核酸”在本文可以相互替換地使用，是指任何長度的核苷酸的聚合物，并且包括DNA和RNA。核苷酸可以是脫氧核糖核酸、核糖核酸、經修飾核苷酸或堿基和/或他們的類似物，或者可以通過DNA或RNA聚合酶引入聚合物中的任何物質。
[0080]“高嚴謹條件”可以通過以下鑒定:(1)使用低離子強度和高溫以用于洗滌，例如500C的15mM氯化鈉/1.5mM檸檬酸鈉/0.1%十二烷基硫酸鈉；(2)雜交期間使用諸如甲酰胺等變性劑，例如42°C的具有0.1%胎牛血清白蛋白/0.l%Ficoll/0.1%聚乙烯吡咯烷酮/pH6.5的50mM磷酸鈉緩沖液(帶750mM氯化鈉、75mM檸檬酸鈉)的50%(v/v)甲酰胺；或(3)使用 420C 的 50% 甲酰胺、5 X SSC (0.75M NaCl, 75mM 檸檬酸鈉)、50mM 磷酸鈉(ρΗ6.8)、0.1%焦磷酸鈉、5 X鄧哈特溶液(Denhardt’ s solution)、超聲處理的鮭魚精子DNA (50 μ g/ml)、0.1%SDS和10%右旋糖酐硫酸酯，在42°C的0.2 X SSC中洗滌，在55°C的50%甲酰胺中洗滌，然后在55 °C的由含有EDTA的0.1XSSC組成的高嚴謹洗滌液中洗滌。
[0081]在兩個以上核酸或多肽的背景下的術語“同一性”或百分比“同一性”，是指不考慮作為序列同一性的一部分的任何保守性氨基酸取代，當就最大相應性進行比較和比對(必要時引入空位)時，兩個或更多個相同或的序列或亞序列、或所述序列或亞序列的特定百分比的核苷酸或氨基酸殘基是相同的。可以使用序列比較軟件或算法或通過目視檢查測定百分比同一性。可用于獲得氨基酸或核苷酸序列的比對的各種算法和軟件是本領域已知的。這些包括但不限于 LAST、ALIGN、Megalign、BestFit、GCG Wisconsin Package 及其各種變體。如使用序列比較算法或通過目視檢查所測定的，當就最大相應性進行比較和比對時，本發明的兩種核酸或多肽基本上具有同一性，這意味著他們具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、且在一些實施方式中至少95%、96%、97%、98%、99%核苷酸或氨基酸殘基同一性。在一些實施方式中，在長度為至少約10個、至少約20個、至少約40-60個、至少約60-80個殘基或其間的任意整數值的序列區域上存在同一性。在一些實施方式中，在大于60-80個殘基的更長區域(例如至少約80-100個殘基)上存在同一性，并且在一些實施方式中，序列在 所比較的序列(例如核苷酸序列的編碼序列)的全長上基本上是相同的。
[0082]“保守性氨基酸取代”是其中一個氨基酸被具有相似側鏈的另一氨基酸替換的取代。具有相似側鏈的氨基酸殘基家族已經在本領域中定義，包括堿性側鏈(例如賴氨酸、精氨酸、組氨酸)、酸性側鏈(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不帶電的極性側鏈(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非極性側鏈(例如丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β支鏈側鏈(例如蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)和芳香族側鏈(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)。例如，苯丙氨酸取代酪氨酸是保守性取代。優選的是，本發明的多肽序列和抗體中的保守性取代不會消除含有上述氨基酸序列的多肽或抗體與抗原的結合，所述抗原即所述多肽或抗體所結合的一種或多種RSPO蛋白。鑒定不消除抗原結合的核苷酸和氨基酸保守性取代的方法是本領域公知的。
[0083]本文使用的術語“載體”是指構建體，其能夠遞送并且通常在宿主細胞中表達一種或多種目的基因或序列。載體的實例包括但不限于病毒載體、裸DNA或RNA表達載體、質粒、粘粒或噬菌體載體、與陽離子縮合劑連接的DNA或RNA表達載體和包封在脂質體中的DNA或RNA表達載體。
[0084]“分離的”多肽、抗體、多核苷酸、載體、細胞或組合物是處于未見于自然界中的形式的多肽、抗體、多核苷酸、載體、細胞或組合物。分離的多肽、抗體、多核苷酸、載體、細胞或組合物包括已經被純化至他們不再處于其見于自然界中的形式的程度的那些。在一些實施方式中，分離的多肽、抗體、多核苷酸、載體、細胞或組合物是基本上純的。
[0085]本文使用的術語“基本上純”是指至少為50%純(純即無污染物)、至少為90%純、至少為95%純、至少為98%純或至少為99%純的材料。
[0086]本文使用的術語“癌”和“癌性的”是指或描述其中細胞群的特征在于不受控的細胞生長的哺乳動物中的生理條件。癌的實例包括但不限于上皮癌、母細胞瘤、肉瘤和血液癌(例如淋巴瘤和白血病)。
[0087]本文使用的術語“腫瘤”和“贅生物”是指由過度細胞生長或增殖(良性(非癌性)或惡性(癌性)，包括前癌損傷)引起的任何組織團塊。
[0088]本文使用的術語“轉移”是指癌從起始位點擴散或轉移至身體的其他區域并在新位置發育有類似的癌損傷的過程。“轉移”或“轉移性”細胞是喪失與鄰近細胞的粘附接觸、通過血流或淋巴從疾病的原發位點移動從而入侵鄰近的身體結構的細胞。
[0089]術語“癌干細胞”和“CSC”和“腫瘤干細胞”和“腫瘤起始細胞”在本文可以相互替換地使用，并且是指來自癌或腫瘤的如下細胞:(1)具有全面的增殖能力；2)能夠進行不對稱細胞分裂以產生一種或多種分化細胞后裔，其中分化細胞具有減少的增殖或發育潛能；和(3)能夠進行對稱細胞 分裂以自我更新或自我維持。與不能形成腫瘤的大多數腫瘤細胞相比，這些性質賦予癌干細胞在連續移植到免疫妥協的宿主(例如小鼠)時形成或建立腫瘤或癌的能力。癌干細胞以無序方式進行自我更新和分化，從而形成具有異常細胞類型的腫瘤，由于發生突變，所述異常細胞類型能夠隨時間發生改變。
[0090]術語“癌細胞”和“腫瘤細胞”是指源自癌或腫瘤或前癌損傷的總細胞群體，其包括非致瘤性細胞(其包含大量癌細胞群)和致瘤性干細胞(癌干細胞)。如本文所用，術語“癌細胞”或“腫瘤細胞”當僅指缺乏更新分化能力的那些細胞時會被術語“非致瘤性的”修飾，從而將這些腫瘤細胞與癌干細胞區分開。
[0091]本文使用的術語“致瘤性的”是指癌干細胞的功能特征，包括自我更新性質(產生另外的致瘤性癌干細胞)和增殖以產生所有其他腫瘤細胞的性質(產生分化的非致瘤性腫瘤細胞)。
[0092]本文使用的術語“致瘤性”是指來自腫瘤的隨機細胞樣品在連續移植至免疫妥協的宿主(例如，小鼠)時形成可察覺的腫瘤的能力。
[0093]術語“受試對象”是指任何動物(例如，哺乳動物)，包括但不限于人、非人靈長類、犬科動物、貓科動物和嚙齒動物等，其是特定治療的接受者。通常而言，本文術語“受試對象”或“患者”在指人類受試對象時可相互替換地使用。
[0094]術語“藥學上可接受的”是指由聯邦或州政府的管理機構批準或能夠批準或在美國藥典或用于包括人類在內的動物的其它公認的藥典中列出。
[0095]術語“藥學上可接受的賦形劑、載劑或佐劑”或“可接受的藥物載劑”是指可以與至少一種本發明的結合劑(例如抗體)施用至受試對象的賦形劑、載劑或佐劑，當以足以遞送治療效果的劑量施用時其不破壞至少一種本發明的結合劑的藥物活性，并且是非毒性的。
[0096]術語“有效量”或“治療有效量”或“治療效果”是指對于“治療”受試對象或哺乳動物中的疾病或病癥有效的結合劑、抗體、多肽、多核苷酸、有機小分子或其他藥物的量。在癌的情況下，藥物的治療有效量具有治療效果，因此能夠減少癌細胞的數量；降低致瘤性、致瘤頻率或致瘤能力；減小癌干細胞的數量和頻率；減小腫瘤尺寸；減少癌細胞群；抑制或停止癌細胞浸潤到周圍器官，包括例如癌擴散至軟組織和骨中；抑制和停止腫瘤或癌細胞轉移；抑制和停止腫瘤或癌細胞生長；某種程度上減緩與癌有關的一種或多種癥狀；減少發病率和致死率；改善生活品質；或所述效果的組合。如果試劑，例如抗體防止現有癌細胞生長和/或殺死現有癌細胞，則可以將其稱為細胞抑制劑和/或細胞毒素。
[0097]術語“治療中”或“治療”或“待治療”或“緩解”或“待緩解”等術語是指I)治愈、減慢、減輕所診斷病理疾病或病癥的癥狀和/或暫停其發展的治療性措施，以及2)預防和/或減慢目的病理疾病或病癥的發展的預防性或防止性措施。因此需要治療的對象包括已經罹患疾病的對象、傾向于罹患疾病的對象和其中待要預防疾病的對象。在一些實施方式中，如果患者顯示以下情況中的一種或多種，則根據本發明的方法成功地“治療”了受試對象:癌細胞的數量減少或完全不存在；腫瘤尺寸的減小；浸潤到周圍器官的癌細胞(包括例如癌至軟組織和骨的擴散)受抑制或不存在；腫瘤或癌細胞轉移受抑制或不存在；癌生長受抑制或不存在；與特定癌相關的一種或多種癥狀的緩解；發病率和致死率減少；生活品質提高；或上述效果的某些組合。
[0098]如本說明書和權利要求所用，單數形式的“一種”、“一個”和“所述”包括復數形式，除非上下文明確地指出例外。
[0099]應該理解的是，在本文無論何處以語言“包含”描述了實施方式，也就提供了以術語“由……組成”和/或“基本上由……組成”描述的另外的類似實施方式。
[0100]本文諸如“A和/或B”等短語中使用的術語“和/或”旨在包括A和B、A或B、(單獨的)A和(單獨的)B。類似地，諸如“A、B和/或C”等短語中使用的術語“和/或”旨在涵蓋了以下實施方式 中的每一種:A、B和C ;A、B或C ;A或C ;A或B ;B或C ;A和C ;A和B ;B和C ;(單獨的)A(單獨)；(單獨的)B (單獨)；和(單獨的)C。
[0101]I1.RSPO-結合劑
[0102]本發明提供結合人RSPO蛋白的試劑。本文將這些試劑稱為“RSP0-結合劑”。在一些實施方式中，所述RSPO-結合劑是抗體。在一些實施方式中，所述RSPO-結合劑是多肽。在一些實施方式中，所述RSPO-結合劑結合RSPOl。在一些實施方式中，所述RSPO-結合劑結合RSP02。在一些實施方式中，所述RSPO-結合劑結合RSP03。在一些實施方式中，所述RSPO試劑特異性結合至少一種其他人RSP0。在一些實施方式中，由RSPOl-結合劑結合的所述至少一種其他人RSPO選自由RSP02、RSP03和RSP04組成的組。在一些實施方式中，由RSP02-結合劑結合的所述至少一種其他人RSPO選自由RSP01、RSP03和RSP04組成的組。在一些實施方式中，由RSP03-結合劑結合的所述至少一種其他人RSPO選自由RSPOl、RSP02和RSP04組成的組。人RSP01、RSP02、RSP03和RSP04的全長氨基酸(aa)序列是本領域已知的，并且在本文作為 SEQ ID NO:1 (RSPOl)、SEQ ID NO: 2 (RSP02)、SEQ ID NO: 3 (RSP03)和 SEQID N0:4(RSP04)提供。
[0103]在一些實施方式中，本文描述的RSPO-結合劑(例如抗體)的抗原結合位點能夠結合(或結合)一種、兩種、三種或四種RSP0。在一些實施方式中，本文描述的RSPOl-結合劑(例如抗體)的抗原結合位點能夠結合(或結合)RSPOl以及一種、兩種或三種其他RSPO0例如，在一些實施方式中，RSPOl-結合劑的抗原結合位點能夠特異性結合RSPOl以及至少一種選自由RSP02、RSP03和RSP04組成的組中的其他RSP0。在一些實施方式中，所述RSPOl-結合劑特異性結合RSPOl和RSP02。在一些實施方式中，所述RSPOl-結合劑特異性結合RSPOl和RSP03。在一些實施方式中，所述RSPOl-結合劑特異性結合RSPOl和RSP04。在一些實施方式中，所述RSPOl-結合劑特異性結合RSP01、RSP02和RSP03。在一些實施方式中，所述RSPOl-結合劑特異性結合RSPOl、RSP02和RSP04。在一些實施方式中，所述RSPOl-結合劑特異性結合RSPOl、RSP03和RSP04。在一些實施方式中，所述RSPOl-結合劑特異性結合人RSP01。在一些實施方式中，本文描述的RSPOl-結合劑(例如抗體)特異性結合人RSPOl和小鼠RSPOl。
[0104]在一些實施方式中，所述試劑(結合劑)是在人RSPOl的21~263位氨基酸內特異性結合的抗體。在一些實施方式中，所述試劑(結合劑)是在人RSPOl的31~263位氨基酸內特異性結合的抗體。在一些實施方式中，所述抗原結合劑是在人RSPOl的34~135位氨基酸內特異性結合的抗體。在一些實施方式中，所述抗原結合劑是在人RSPOl的91~135位氨基酸內特異性結合的抗體。在一些實施方式中，所述RSPOl-結合劑在SEQ ID NO: 5內結合。在一些實施方式中，所述RSPOl-結合劑在SEQ IDN0:9內結合。在一些實施方式中，所述RSPOl-結合劑或抗體結合RSPOl的弗林蛋白酶樣富半胱氨酸結構域。在一些實施方式中，所述試劑或抗體結合在RSPOl的弗林蛋白酶樣富半胱氨酸結構域內的至少一個氨基酸。在一些實施方式中，所述RSPOl-結合劑或抗體在序列SEQ ID NO: 6或SEQ ID NO: 7內結合。在一些實施方式中，所述RSPOl-結合劑或抗體在序列SEQ ID NO: 6和SEQ ID NO: 7內結合。在一些實施方式中，所述RSPOl-結合劑結合RSPOl的血小板反應蛋白結構域。在一些實施方式中，所述RSPOl-結合劑或抗體結合RSPOl的血小板反應蛋白結構域內的至少一個氨基酸。在一些實施方式中，所述RSPOl-結合劑或抗體在SEQ ID NO:8內結合。
[0105]在一些實施 方式中，本文描述的RSP02-結合劑(例如抗體)的抗原結合位點能夠結合(或結合)RSP02以及一種、兩種或三種其他RSP0。例如，在一些實施方式中，RSP02-結合劑的抗原結合位點能夠特異性結合RSP02以及至少一種選自由RSP01、RSP03和RSP04組成的組中的其他RSP0。在一些實施方式中，所述RSP02-結合劑特異性結合RSP02和RSPOl。在一些實施方式中，所述RSP02-結合劑特異性結合RSP02和RSP03。在一些實施方式中，所述RSP02-結合劑特異性結合RSP02和RSP04。在一些實施方式中，所述RSP02-結合劑特異性結合RSP02、RSP03和RSP04。在一些實施方式中，所述RSP02-結合劑特異性結合RSP02、RSPOl和RSP03。在一些實施方式中，所述RSP02-結合劑特異性結合RSP02、RSPOl和RSP04。在一些實施方式中，所述RSP02-結合劑特異性結合人RSP02。在一些實施方式中，所述RSP02-結合劑(例如抗體)特異性結合人RSP02和小鼠RSP02。
[0106]在一些實施方式中，所述試劑(結合劑)是在人RSP02的22~243位氨基酸內特異性結合的抗體。在一些實施方式中，所述試劑(結合劑)是在人RSP02的22~205位氨基酸內特異性結合的抗體。在一些實施方式中，所述抗原-結合劑是在人RSP02的31~146位氨基酸內特異性結合的抗體。在一些實施方式中，所述抗原結合劑是在人RSP02的31~89位氨基酸內特異性結合的抗體。在一些實施方式中，所述抗原結合劑是在人RSP02的90~134位氨基酸內特異性結合的抗體。在一些實施方式中，所述抗原結合劑是在人RSP02的90~146位氨基酸內特異性結合的抗體。在一些實施方式中，所述RSP02-結合劑在SEQID NO:43內結合。在一些實施方式中，所述RSP02-結合劑在SEQ ID NO:44內結合。在一些實施方式中，所述RSP02-結合劑或抗體結合RSP02的弗林蛋白酶樣富半胱氨酸結構域。在一些實施方式中，所述試劑或抗體結合在RSP02的弗林蛋白酶樣富半胱氨酸結構域內的至少一個氨基酸。在一些實施方式中，所述RSP02-結合劑或抗體在序列SEQ ID NO:45或SEQID NO:46內結合。在一些實施方式中，所述RSP02-結合劑或抗體在序列SEQ ID NO:45和SEQ ID NO:46內結合。在一些實施方式中，所述RSP02-結合劑結合RSP02的血小板反應蛋白結構域。在一些實施方式中，所述RSP02-結合劑或抗體結合RSP02的血小板反應蛋白結構域內的至少一個氨基酸。在一些實施方式中，所述RSP02-結合劑或抗體在SEQ ID NO:47內結合。
[0107]在一些實施方式中，本文描述的RSP03-結合劑(例如抗體)的抗原結合位點能夠結合(或結合)RSP03以及一種、兩種或三種其他RSP0。例如，在一些實施方式中，RSP03-結合劑的抗原結合位點能夠特異性結合RSP03以及至少一種選自由RSP01、RSP02和RSP04組成的組中的其他RSP0。在一些實施方式中，所述RSP03-結合劑特異性結合RSP03和RSPOl。在一些實施方式中，所述RSP03-結合劑特異性結合RSP03和RSP02。在一些實施方式中，所述RSP03-結合劑特異性結合RSP03和RSP04。在一些實施方式中，所述RSP03-結合劑特異性結合RSP03、RSPOl和RSP02。在一些實施方式中，所述RSP03-結合劑特異性結合RSP03、RSPOl和RSP04。在一些實施方式中，所述RSP03-結合劑特異性結合RSP03、RSP02和RSP04。在一些實施方式中，所述RSP03-結合劑特異性結合人RSP03。在一些實施方式中，所述RSP03-結合劑(例如抗體)特異性結合人RSP03和小鼠RSP03。
[0108]在一些實施方式中，所述試劑(結合劑)是在人RSP03的22~272位氨基酸內特異性結合的抗體。在一些實施方式中，所述試劑(結合劑)是在人RSP03的22~207位氨基酸內特異性結合的抗體。在一些實施方式中，所述抗原結合劑是在人RSP03的35~135位氨基酸內特異性結合的抗體。在一些實施方式中，所述抗原結合劑是在人RSP03的35~86位氨基酸內特異 性結合的抗體。在一些實施方式中，所述抗原-結合劑是在人RSP03的92~135位氨基酸內特異性結合的抗體。在一些實施方式中，所述RSP03-結合劑在SEQ IDNO:48內結合。在一些實施方式中，所述RSP03-結合劑或抗體結合RSP03的弗林蛋白酶樣富半胱氨酸結構域。在一些實施方式中，所述試劑或抗體結合在RSP03的弗林蛋白酶樣富半胱氨酸結構域內的至少一個氨基酸。在一些實施方式中，所述RSP03-結合劑或抗體在序列SEQ ID NO: 49或SEQ ID NO: 50內結合。在一些實施方式中，所述RSP03-結合劑或抗體在序列SEQ ID NO:49和SEQ ID NO:50內結合。在一些實施方式中，所述RSP03-結合劑結合RSP03的血小板反應蛋白結構域。在一些實施方式中，所述RSP03-結合劑或抗體結合RSP03的血小板反應蛋白結構域內的至少一個氨基酸。在一些實施方式中，所述RSP03-結合劑或抗體在SEQ ID NO:51內結合。
[0109]在一些實施方式中，所述RSPO-結合劑或抗體以約ΙμΜ以下、約IOOnM以下、約40ηΜ以下、約20ηΜ以下、約IOnM以下、約InM以下或約0.1nM以下的解離常數(Kd)結合至少一種RSPO蛋白。在一些實施方式中，RSPOl-結合劑或抗體以約ΙμΜ以下、約IOOnM以下、約40ηΜ以下、約20ηΜ以下、約IOnM以下、約InM以下或約0.1nM以下的解離常數(Kd)結合RSPOl。在一些實施方式中，RSPOl-結合劑或抗體以約InM以下的解離常數(Kd)結合RSPOl。在一些實施方式中，RSPOl-結合劑或抗體以約0.1nM以下的解離常數(Kd)結合RSP01。在一些實施方式中，本文描述的RSPOl-結合劑或抗體結合至少一種其他RSP0。在一些實施方式中，本文描述的結合至少一種其他RSPO的RSPOl-結合劑或抗體與至少一種其他RSPO結合的Kd為約IOOnM以下、約20nM以下、約IOnM以下、約InM以下或約0.1nM以下。例如，在一些實施方式中，RSPOl-結合劑或抗體還以約IOnM以下的Kd結合RSP02、RSP03和/或RSP04。在一些實施方式中，RSPOl-結合劑(例如抗體)以約0.1nM以下的Kd結合人RSPOl。在一些實施方式中，所述RSPO-結合劑以約IOnM以下的Kd結合人RSPO和小鼠RSP0。在一些實施方式中，RSPOl-結合劑以約InM以下的Kd結合人RSPOl和小鼠RSPOl。在一些實施方式中，RSPOl-結合劑以約0.1nM以下的Kd結合人RSPOl和小鼠RSPOl。在一些實施方式中，RSP02-結合劑或抗體以約ΙμΜ以下、約IOOnM以下、約40ηΜ以下、約20ηΜ以下、約IOnM以下、約InM以下或約0.1nM以下的解離常數(Kd)結合RSP02。在一些實施方式中，RSP02-結合劑或抗體以約IOnM以下的解離常數(Kd)結合RSP02。在一些實施方式中，RSP02-結合劑或抗體以約InM以下的解離常數(Kd)結合RSP02。在一些實施方式中，本文描述的RSP02-結合劑或抗體結合至少一種其他RSP0。在一些實施方式中，本文描述的結合至少一種其他RSPO的RSP02-結合劑或抗體與至少一種其他RSPO結合的Kd為約IOOnM以下、約20ηΜ以下、約IOnM以下、約InM以下或約0.1nM以下。例如，在一些實施方式中，RSP02-結合劑或抗體還以約IOnM以下的Kd結合RSP01、RSP03和/或RSP04。在一些實施方式中，RSP02-結合劑(例如抗體)以約InM以下的Kd結合人RSP02。在一些實施方式中，所述RSPO-結合劑以約IOnM以下的Kd結合人RSPO和小鼠RSP0。在一些實施方式中，所述RSP02-結合劑以約InM以下的Kd結合人RSPOl和小鼠RSPOl。在一些實施方式中，RSP02-結合劑以約0.1nM以下的Kd結合人RSP02和小鼠RSP02。在一些實施方式中，所述結合劑(例如抗體)與RSPO蛋白的解離常數是使用固定在Biacore芯片上的包含至少一部分所述RSPO蛋白的RSPO融合蛋白確定的解離常數。
[0110]在一些實施方式中，所述RSPO-結合劑(例如抗體)以約ΙμΜ以下、約IOOnM以下、約40ηΜ以下、約20ηΜ以下、約IOnM以下、約InM以下或約0.1nM以下的半最大效應濃度(EC5tl)結合至 少一種人RSPO蛋白。在一些實施方式中，RSPOl-結合劑(例如抗體)以約I μ M以下、約IOOnM以下、約40ηΜ以下、約20ηΜ以下、約IOnM以下、約InM以下或約0.1nM以下的半最大效應濃度(EC5tl)結合人RSP01。在一些實施方式中，RSPOl-結合劑(例如抗體)還以約40ηΜ以下、約20ηΜ以下、約IOnM以下、約InM以下或約0.1nM以下的EC5tl結合人RSP02、RSP03和/或RSP04。在一些實施方式中，RSP02-結合劑(例如抗體)以約I μ M以下、約IOOnM以下、約40ηΜ以下、約20ηΜ以下、約IOnM以下、約InM以下或約0.1nM以下的半最大效應濃度(EC5tl)結合人RSP02。在一些實施方式中，RSP02-結合劑(例如抗體)還以約40ηΜ以下、約20ηΜ以下、約IOnM以下、約InM以下或約0.1nM以下的EC5tl結合人RSPOl、RSP03 和 / 或 RSP04。
[0111]在一些實施方式中，所述RSPO-結合劑是抗體。在一些實施方式中，所述抗體是重組抗體。在一些實施方式中，所述抗體是單克隆抗體。在一些實施方式中，所述抗體是嵌合抗體。在一些實施方式中，所述抗體是人源化抗體。在一些實施方式中，所述抗體是人抗體。在一些實施方式中，所述抗體是IgGl抗體。在一些實施方式中，所述抗體是IgG2抗體。在一些實施方式中，所述抗體是包含抗原結合位點的抗體片段。在一些實施方式中，所述抗體是單價抗體、單特異性抗體、雙價抗體、雙特異性抗體或多特異性抗體。在一些實施方式中，所述抗體綴合至細胞毒素部分。在一些實施方式中，所述抗體是分離的。在一些實施方式中，所述抗體是基本上純的。[0112]本發明的RSPO-結合劑(例如抗體)可以通過本領域已知的任何方法進行特異性結合檢驗。可以使用的免疫檢驗包括但不限于使用諸如以下技術的競爭性和非競爭性檢驗系統=Biacore分析、FACS分析、免疫熒光、免疫細胞化學、蛋白質印跡、放射性免疫檢驗、ELISA、“夾心”免疫檢驗、免疫沉淀檢驗、沉淀反應、凝膠擴散沉淀反應、免疫擴散檢驗、凝集檢驗、補體固定檢驗、免疫放射檢驗、熒光免疫檢驗和蛋白A免疫檢驗。此類檢驗是常規的，并且是本領域公知的(例如參見，Ausubel等編，1994-present, Current Protocolsin Molecular Biology, John ffiley&Sons, Inc., New York, NY)。
[0113]例如，抗體與人RSPOl的特異性結合可以使用ELISA確定。ELISA檢驗包括:制備抗原，用抗原包被96孔微量滴定板的孔，向所述孔添加綴合至諸如酶促底物(例如辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶)等可檢測化合物的所述RSP01-結合抗體或其他RSP01-結合劑，溫育一段時間，和檢測與所述抗原結合的抗體的存在。在一些實施方式中，所述述RSP01-結合抗體或試劑不綴合至可檢測化合物，而是向所述孔添加識別所述RSP01-結合抗體或試劑的第二綴合抗體。在一些實施方式中，作為用所述抗原包被所述孔的替代方案，將所述RSPO-結合抗體或試劑包被孔，將所述抗原添加至經包被孔，之后可以添加綴合至可檢測化合物的第二抗體。本領域技術人員能夠知曉對于參數可以對其進行修改以增加所檢測信號以及本領域已知的ELISA的其他變化。
[0114]在一個實例中，抗體與人RSP01的特異性結合可以使用FACS確定。FACS篩選檢驗可以包括:產生表達作為融合蛋白(例如，RSPOl-Fc或RSP01-⑶4TM)的抗原的cDNA構建體，將所述構建體轉染至細胞中，在所述細胞的表面上表達所述抗原，將所述RSP01-結合抗體或其他RSP01-結合劑與所轉染的細胞混合，和溫育一段時間。被RSP01-結合抗體或其他RSP01-結合劑結合的細胞可以通過使用綴合有可檢測化合物的第二抗體(例如，綴合有PE-的抗-Fe抗體) 和流式細胞儀來鑒定。本領域技術人員能夠知曉對于參數可以對其進行修改以增加所檢測信號以及可以增強篩選的FACS的其他變化(例如，就阻斷抗體進行篩選)。
[0115]抗體或其他結合劑與抗原(例如RSPO蛋白)的結合親和性和抗體-抗原相互作用的解離速率(off-rate)可以通過競爭性結合檢驗來確定。競爭性結合檢驗的一個實例是放射性免疫檢驗，其包括使經標記抗原(例如3H或125I)或其片段或變體與目的抗體在遞增量的未標記抗原的存在下進行溫育，然后檢測與所述經標記抗原結合的抗體。抗體對抗原(例如RSPO蛋白)的親和性和結合解離速率可以通過Scatchard作圖分析確定。在一些實施方式中，使用Biacore動力學分析來確定結合抗原(例如RSPO蛋白)的抗體或試劑的結合和解離速率。Biacore動力學分析包括從表面上具有經固定抗原(例如RSPO蛋白)的芯片上分析抗體的結合和解離。
[0116]在一些實施方式中，本發明提供特異性結合人RSP01的RSP01-結合劑(例如，抗體)，其中所述RSP01-結合劑(例如，抗體)包含抗體89M5的CDR中的一個、兩個、三個、四個、五個和/或六個(見表1)。在一些實施方式中，所述RSP01-結合劑包含89M5的⑶R中的一個以上、89M5的⑶R中的兩個以上、89M5的⑶R中的三個以上、89M5的⑶R中的四個以上、89M5的⑶R中的五個以上或89M5的⑶R中的所有六個。
[0117]表1
【權利要求】
1.一種特異性結合人R-反應蛋白I(RSPOl)的分離的抗體，所述分離的抗體包含:
(a)包含TGYTMH(SEQ ID NO: 12)的重鏈 CDR1、包含 GINPNNGGTTYNQNFKG(SEQ ID NO: 13)的重鏈 CDR2 和包含 KEFSDGYYFFAY(SEQ ID NO: 14)的重鏈 CDR3 ;和 / 或
(b)包含KASQDVIFAVA(SEQ ID NO: 15)的輕鏈 CDRl，包含 WASTRHT (SEQ ID NO: 16)的輕鏈 CDR2 和包含 QQHYSTPW(SEQ ID NO: 17)的輕鏈 CDR3。
2.一種特異性結合人RSPOl的分離的抗體，所述分離的抗體包含: (a)與SEQID NO: 10具有至少90%序列同一性的重鏈可變區；和/或 (b)與SEQID NO: 11具有至少90%序列同一性的輕鏈可變區。
3.如權利要求2所述的抗體，所述抗體包含: (a)與SEQID NO: 10具有至少95%序列同一性的重鏈可變區；和/或 (b)與SEQID NO: 11具有至少95%序列同一性的輕鏈可變區。
4.如權利要求2所述的抗體，所述抗體包含: (a)包含SEQID NO: 10的重鏈可變區；和/或 (b)包含SEQID NO: 11的輕鏈可變區。
5.如權利要求2所述的抗體，所述抗體包含: (a)基本上由SEQID NO: 10組成的重鏈可變區；和 (b)基本上由SEQID NO: 11組成的輕鏈可變區。
6.一種特異性結合人RSPOl的分離的抗體，所述分離的抗體包含: (a)與SEQID NO: 55具有至少90%序列同一性的重鏈可變區；和/或 (b)與SEQID NO:59具有至少90%序列同一性的輕鏈可變區。
7.如權利要求6所述的抗體，所述抗體包含: (a)與SEQID NO: 55具有至少95%序列同一性的重鏈可變區；和/或 (b)與SEQID NO:59具有至少95%序列同一性的輕鏈可變區。
8.如權利要求6所述的抗體，所述抗體包含: (a)包含SEQID NO:55的重鏈可變區；和/或 (b)包含SEQID NO:59的輕鏈可變區。
9.如權利要求6所述的抗體，所述抗體包含: (a)基本上由SEQID NO:55組成的重鏈可變區；和 (b)基本上由SEQID NO:59組成的輕鏈可變區。
10.一種分離的抗體，所述分離的抗體與權利要求1~9中任一項所述的抗體競爭與RSPOl的特異性結合。
11.一種分離的抗體，所述分離的抗體與權利要求1~10中任一項所述的抗體所結合的RSPOl上的表位相同。
12.—種分離的抗體，所述分離的抗體所結合的RSPOl上的表位與權利要求1~10中任一項所述的抗體所結合的RSPOl上的表位重疊。
13.如權利要求1~12中任一項所述的抗體，所述抗體是重組抗體、單克隆抗體、嵌合抗體或雙特異性抗體。
14.如權利要求1~13中任一項所述的抗體，所述抗體是人源化抗體。
15.如權利要求1~13中任一項所述的抗體，所述抗體是人抗體。
16.如權利要求1~14中任一項所述的抗體，所述抗體是IgGl抗體或IgG2抗體。
17.如權利要求1~14中任一項所述的抗體，所述抗體是包含抗原結合位點的抗體片段。
18.—種單克隆抗體，所述單克隆抗體由ATCC保藏號為PTA-11970的雜交瘤細胞系生產。
19.權利要求18所述的抗體的人源化形式。
20.如權利要求1~19中任一項所述的抗體，所述抗體抑制RSPOl與至少一種富含亮氨酸重復的G蛋白偶聯受體(LGR)的結合。
21.如權利要求20所述的抗體，其中，所述LGR選自由LGR4、LGR5和LGR6組成的組。
22.如權利要求21所述的抗體，其中，所述LGR是LGR5。
23.如權利要求1~22中任一項所述的抗體，所述抗體抑制RSPOl信號傳導。
24.如權利要求1~23中任一項所述的抗體，所述抗體抑制β-連環素的激活。
25.如權利要求1~24中任一項所述的抗體,所述抗體抑制β-連環素信號傳導。
26.如權利要求1~25中任一項所述的抗體，所述抗體抑制腫瘤生長。
27.如權利要求1~26中任一項所述的抗體，所述抗體誘導腫瘤中分化標記物的表達。
28.如權利要求1~27中任一項所述的抗體，所述抗體誘導腫瘤中的細胞進行分化。
29.如權利要求1~28中任一項所述的抗體，所述抗體減小腫瘤中的癌干細胞的頻率。
30.一種多肽，所述多肽包含選自由以下序列組成的組中的序列:SEQ ID NO: 10,SEQ IDNO:1USEQ ID NO:21,SEQ ID NO: 22,SEQ ID NO:25,SEQ ID NO:26,SEQ ID NO:53,SEQ ID NO: 55,SEQ ID NO: 57、SEQ ID NO: 59、SEQ ID NO:68 和 SEQ ID NO:69。
31.如權利要求30所述的多肽，所述多肽是抗體。
32.—種細胞，所述細胞包含或產生權利要求1~31中任一項所述的抗體或多肽。
33.一種雜交瘤細胞系，所述細胞系具有ATCC保藏號PTA-11970。
34.—種分離的多核苷酸分子,所述多核苷酸分子包含編碼權利要求1~31中任一項所述的抗體或多肽的多核苷酸。
35.一種分離的多核苷酸分子，所述多核苷酸分子包含選自由以下序列組成的組中的多核苷酸序歹Ij:SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 23、SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO: 52、SEQID NO: 54、SEQ ID NO: 56 和 SEQ ID NO: 58。
36.一種載體,所述載體包含權利要求34或權利要求35所述的多核苷酸。
37.一種細胞，所述細胞包含權利要求34或權利要求35所述的多核苷酸或者權利要求36所述的載體。
38.一種藥物組合物，所述藥物組合物包含權利要求1~31中任一項所述的抗體或多肽和藥學上可接受的載劑。
39.一種抑制腫瘤生長的方法，其中，所述方法包括使所述腫瘤與有效量的權利要求1~29中任一項所述的抗體接觸。
40.一種抑制受試對象中腫瘤生長的方法，其中，所述方法包括對所述受試對象施用治療有效量的權利要求1~29中任一項所述的抗體。
41.一種誘導受試對象中腫瘤細胞的分化的方法，所述方法包括對所述受試對象施用治療有效量的權利要求1~29中任一項所述的抗體。
42.一種減小受試對象的腫瘤中的癌干細胞的頻率的方法，所述方法包括對所述受試對象施用治療有效量的權利要求1~29中任一項所述的抗體。
43.一種抑制細胞中β連環素信號傳導的方法，所述方法包括使所述細胞與有效量的權利要求1~29中任一項所述的抗體接觸。
44.如權利要求43所述的方法，其中，所述細胞是腫瘤細胞。
45.如權利要求39~42或44中任一項所述的方法，其中，所述腫瘤選自由以下腫瘤組成的組:結直腸瘤、卵巢瘤、胰腺瘤、肺瘤、肝瘤、乳腺瘤、腎瘤、前列腺瘤、胃腸瘤、黑素瘤、子宮頸瘤、膀胱瘤、成膠質細胞瘤以及頭頸瘤。
46.如權利要求45所述的方法，其中，所述腫瘤是胰腺瘤。
47.如權利要求45所述的方法，其中，所述腫瘤是卵巢瘤。
48.一種治療受試對象中的癌的方法，其中，所述方法包括對所述受試對象施用治療有效量的權利要求1~29中任一項所述的抗體。
49.如權利要求48所述的方法，其中，所述癌選自由以下癌組成的組:結直腸癌、卵巢癌、胰腺癌、肺癌、肝癌、乳腺癌、腎癌、前列腺癌、胃腸癌、黑素瘤、子宮頸癌、膀胱癌、成膠質細胞瘤以及頭頸癌。
50.如權利要求49所述的方法，其中，所述癌是結直腸癌或胰腺癌。
51.如權利要求50所 述的方法，其中，所述結直腸癌包含腺瘤性結腸息肉病(APC)基因中的失活突變。
52.如權利要求50所述的方法，其中，所述結直腸癌不包含APC基因中的失活突變。
53.如權利要求50所述的方法，其中，所述結直腸癌包含野生型APC基因。
54.如權利要求50所述的方法，其中，所述結直腸癌不包含β連環素基因中的失活突變。
55.如權利要求49所述的方法，其中，所述癌是卵巢癌。
56.如權利要求39~42或44~55中任一項所述的方法，其中，所述腫瘤或所述癌表達的RSPOl水平比正常組織中的RSPOl水平高。
57.如權利要求40~42或45~56中任一項所述的方法，其中，所述受試對象的腫瘤或癌已被去除。
58.如權利要求39~42或44~57中任一項所述的方法,所述方法還包括確定所述腫瘤或癌中RSPOl的表達水平的步驟。
59.如權利要求39~42或44~58中任一項所述的方法,所述方法還包括確定所述腫瘤或癌是否具有所述APC基因中的失活突變的步驟。
60.如權利要求39~42或44~59中任一項所述的方法,所述方法還包括確定所述腫瘤或癌是否具有β連環素基因的激活突變的步驟。
61.如權利要求58所述的方法，其中，所述確定RSPOl的表達水平的步驟在用所述抗體進行治療或與所述抗體接觸之前完成。
62.如權利要求61所述的方法，其中，如果所述腫瘤或癌具有升高的RSPOl表達水平，則將所述抗體: (a)施用至所述受試對象；或 (b)與所述腫瘤或腫瘤細胞接觸。
63.一種治療受試對象中的疾病的方法，其中，所述疾病與β連環素的激活相關，所述方法包括施用治療有效量的權利要求1~29中任一項所述的抗體。
64.如權利要求39~63中任一項所述的方法，所述方法還包括施用至少一種另外的治療劑。
65.如權利要求64所述的方法，其中，所述另外的治療劑是化學治療劑。
66.如權利要求64所述的方法，其中，所述另外的治療劑是血管生成抑制劑。
67.如權利要求39~42或45~66中任一項所述的方法，其中，所述受試對象是人。
68.—種選擇人受試對象以用結合RSPOl的抗體進行治療的方法，所述方法包括:確定所述受試對象是否具有RSPOl表達水平升高的腫瘤，其中，如果所述腫瘤具有升高的RSPOl表達水平，則選擇所述受試對象以用特異性結合RSPOl的抗體進行治療。
69.如權利要求68所述的方法，其中，所述腫瘤是卵巢瘤。
70.如權利要求58、68或69中任一項所述的方法，其中，通過基于PCR的檢驗、微陣列分析或核苷酸測序來確定樣品中RSPOl的表達水平。
71.一種選擇人受試對象以用結合RSPOl的抗體進行治療的方法，所述方法包括:確定所述受試對象是否具有包含APC基因中的失活突變的腫瘤，其中，如果所述腫瘤具有所述APC基因中的失活突變，則選擇所述受試對象以用特異性結合RSPOl的抗體進行治療。
72.如權利要求71所述的方法，其中，所述腫瘤是結直腸瘤。
73.如權利要求59、71或72中任一項所述的方法，其中，通過基于PCR的檢驗、雜交檢驗、微陣列分析或核苷酸測序來確定樣品中APC基因的失活突變。
74.如權利要求70或73中任一項所述的方法，其中，所述樣品是新鮮的腫瘤樣品、冷凍的腫瘤樣品或福爾馬林固定的石蠟包埋樣品。
75.如權利要求68~74中任一項所述的方法，其中，所述抗體是權利要求1~29中任一項所述的抗體。
76.一種分離的抗體，所述分離的抗體特異性結合人R-反應蛋白2(RSP02)，并且包含:
(a)包含SSYAMS(SEQ ID NO:29)的重鏈 CDR1、包含 SISSGGSTYYPDSVKG(SEQ ID NO:30)的重鏈 CDR2 和包含 RGGDPGVYNGDYEDAMDY(SEQ ID NO: 31)的重鏈 CDR3 ;和 / 或
(b)包含KASQDVSSAVA (SEQ ID NO: 32)的輕鏈 CDRl、包含 WASTRHT (SEQ ID NO: 33)的輕鏈 CDR2 和包含 QQHYSTP (SEQ ID NO: 34)的輕鏈 CDR3。
77.一種分離的抗體，所述分離的抗體特異性結合人RSP02，并且包含: (a)與SEQID NO: 27具有至少90%序列同一性的重鏈可變區；和/或 (b)與SEQID NO: 28具有至少90%序列同一性的輕鏈可變區。
78.如權利要求77所述的抗體，所述抗體包含: (a)與SEQID NO: 27具有至少95%序列同一性的重鏈可變區；和/或 (b)與SEQID NO:28具有至少95%序列同一性的輕鏈可變區。
79.如權利要求77所述的抗體，所述抗體包含: (a)包含SEQID NO:27的重鏈可變區；和/或 (b)包含SEQID NO:28的輕鏈可變區。
80.如權利要求77所述的抗體，所述抗體包含:(a)基本上由SEQID NO:27組成的重鏈可變區；和 (b)基本上由SEQID NO:28組成的輕鏈可變區。
81.一種分離的抗體，所述分離的抗體特異性結合人RSP02，并且包含: (a)與SEQID NO:63具有至少90%序列同一性的重鏈可變區；和/或 (b)與SEQID NO:67或SEQ ID NO: 76具有至少90%序列同一性的輕鏈可變區。
82.如權利要求81所述的抗體，所述抗體包含: (a)與SEQID NO:63具有至少95%序列同一性的重鏈可變區；和/或 (b)與SEQID NO:67或SEQ ID NO:76具有至少95%序列同一性的輕鏈可變區。
83.如權利要求81所述的抗體，所述抗體包含: (a)包含SEQID NO:63的重鏈可變區；和/或 (b)包含SEQID NO:67或SEQ ID NO:76的輕鏈可變區。
84.如權利要求81所述的抗體，所述抗體包含: (a)基本上由SEQ ID NO:63組成的重鏈可變區；和 (b)基本上由SEQID NO:67組成的輕鏈可變區。
85.如權利要求81所述的抗體，所述抗體包含: (a)基本上由SEQID NO:63組成的重鏈可變區；和 (b)基本上由SEQID NO:76組成的輕鏈可變區。
86.一種分離的抗體，所述分離的抗體與權利要求76~85中任一項所述的抗體競爭與RSP02的特異性結合。
87.一種分離的抗體，所述分離的抗體與權利要求76~86中任一項所述的抗體所結合的RSP02上的表位相同。
88.一種分離的抗體，所述分離的抗體所結合的RSP02上的表位與權利要求76~86中任一項所述的抗體所結合的RSP02上的表位重疊。
89.如權利要求76~88中任一項所述的抗體，所述抗體是重組抗體、單克隆抗體、嵌合抗體或雙特異性抗體。
90.如權利要求76~89中任一項所述的抗體，所述抗體是人源化抗體。
91.如權利要求76~89中任一項所述的抗體，所述抗體是人抗體。
92.如權利要求76~91中任一項所述的抗體，所述抗體是IgGl抗體或IgG2抗體。
93.如權利要求76~92中任一項所述的抗體，所述抗體是包含抗原結合位點的抗體片段。
94.一種單克隆抗體，所述單克隆抗體由ATCC保藏號為PTA-12021的雜交瘤細胞系生產。
95.權利要求94所述的抗體的人源化形式。
96.如權利要求76-95中任一項所述的抗體，所述抗體抑制RSP02與至少一種富含亮氨酸重復的G蛋白偶聯受體(LGR)的結合。
97.如權利要求96所述的抗體，其中，所述LGR選自由LGR4、LGR5和LGR6組成的組。
98.如權利要求97所述的抗體，其中，所述LGR是LGR5。
99.如權利要求76~98中任一項所述的抗體，所述抗體抑制RSP02信號傳導。
100.如權利要求76~99中任一項所述的抗體，所述抗體抑制β-連環素的激活。
101.如權利要求76~100中任一項所述的抗體,所述抗體抑制β-連環素信號傳導。
102.如權利要求76~101中任一項所述的抗體，所述抗體抑制腫瘤生長。
103.如權利要求76~102中任一項所述的抗體，所述抗體誘導腫瘤中分化標記物的表達。
104.如權利要求76~103中任一項所述的抗體，所述抗體誘導腫瘤中的細胞進行分化。
105.如權利要求76~104中任一項所述的抗體，所述抗體減小腫瘤中的癌干細胞的頻率。
106.—種多肽，所述多肽包含選自由以下序列組成的組中的序列:SEQ ID NO:27、SEQID NO:28, SEQ IDNO:37、SEQ ID NO:38, SEQ IDN0:41、SEQ IDNO:42、SEQ IDNO:61、SEQ IDNO:63,SEQ ID NO:65,SEQ ID NO:67,SEQ ID NO:70,SEQ IDNO:71、SEQ ID NO:73,SEQ ID NO:74和 SEQ ID NO:76。
107.如權利要求106所述的多肽，所述多肽是抗體。
108.—種細胞，所述細胞包含或產生權利要求76~107中任一項所述的抗體或多肽。
109.—種雜交瘤細胞系，所述細胞系具有ATCC保藏號PTA-12021。
110.一種分離的多核苷酸分子，所述多核苷酸分子包含編碼權利要求76~107中任一項所述的抗體或多肽的多核苷酸。
111.一種分離的多核苷酸分子，所述多核苷酸分子包含選自由以下序列組成的組中的多核苷酸序列:SEQ ID NO: 35、SEQ ID NO: 36、SEQ ID NO: 39、SEQ ID NO: 40、SEQ ID NO: 60、SEQID NO:62、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO: 72 和 SEQ ID NO: 75。
112.—種載體，所述載體包含權利要求110或權利要求111所述的多核苷酸。
113.—種細胞，所述細胞包含權利要求110或權利要求111所述的多核苷酸或者權利要求112所述的載體。
114.一種藥物組合物，所述藥物組合物包含:權利要求76~107中任一項所述的抗體或多肽；和藥學上可接受的載劑。
115.一種抑制腫瘤生長的方法，其中，所述方法包括使所述腫瘤與有效量的權利要求76~105中任一項所述的抗體接觸。
116.—種抑制受試對象中腫瘤生長的方法，其中，所述方法包括對所述受試對象施用治療有效量的權利要求76~105中任一項所述的抗體。
117.一種誘導受試對象中腫瘤細胞的分化的方法，所述方法包括對所述受試對象施用治療有效量的權利要求76~105中任一項所述的抗體。
118.—種減小受試對象的腫瘤中的癌干細胞的頻率的方法，所述方法包括對所述受試對象施用治療有效量的權利要求76~105中任一項所述的抗體。
119.一種抑制細胞中β連環素信號傳導的方法，所述方法包括使所述細胞與有效量的權利要求76~105中任一項所述的抗體接觸。
120.如權利要求119所述的方法，其中，所述細胞是腫瘤細胞。
121.如權利要求115~118或120中任一項所述的方法，其中，所述腫瘤選自由以下腫瘤組成的組:結直腸瘤、卵巢瘤、胰腺瘤、肺瘤、肝瘤、乳腺瘤、腎瘤、前列腺瘤、胃腸瘤、黑素瘤、子宮頸瘤、膀胱瘤、成膠質細胞瘤以及頭頸瘤。
122.如權利要求121所述的方法，其中，所述腫瘤是胰腺瘤。
123.如權利要求121所述的方法，其中，所述腫瘤是卵巢瘤。
124.—種治療受試對象中的癌的方法，其中，所述方法包括對所述受試對象施用治療有效量的權利要求76~105中任一項所述的抗體。
125.如權利要求124所述的方法，其中，所述癌選自由以下癌組成的組:結直腸癌、卵巢癌、胰腺癌、肺癌、肝癌、乳腺癌、腎癌、前列腺癌、胃腸癌、黑素瘤、子宮頸癌、膀胱癌、成膠質細胞瘤以及頭頸癌。
126.如權利要求125所述的方法，其中，所述癌是結直腸癌。
127.如權利要求126所述的方法，其中，所述結直腸癌包含腺瘤性結腸息肉病(APC)基因的失活突變。
128.如權利要求126所述的方法，其中，所述結直腸癌不包含APC基因中的失活突變。
129.如權利要求126所述的方法，其中，所述結直腸癌包含野生型APC基因。
130.如權利要求126所述的方法，其中，所述結直腸癌不包含β連環素基因中的激活突變。
131.如權利要求125所述的方法，其中，所述癌是胰腺癌。
132.如權利要求115~118或120~131中任一項所述的方法，其中，所述腫瘤或所述癌表達的RSP02水平比正常組織中的RSP02水平高。
133.如權利要求116~118或121~132中任一項所述的方法，其中，所述受試對象的腫瘤或癌已經被去除。
134.如權利要求115~118或120~133中任一項所述的方法，所述方法還包括確定所述腫瘤或癌中RSP02的表達水平的步驟。
135.如權利要求115~118或120~134中任一項所述的方法，所述方法還包括確定所述腫瘤或癌是否具有所述APC基因中的失活突變的步驟。
136.如權利要求115~118或120~135中任一項所述的方法，所述方法還包括確定所述腫瘤或癌是否具有β連環素基因的激活突變的步驟。
137.如權利要求134所述的方法，其中，所述確定RSP02的表達水平的步驟在用所述抗體進行治療或與所述抗體接觸之前完成。
138.如權利要求137所述的方法，其中，如果所述腫瘤或癌具有升高的RSP02表達水平，則將所述抗體: (a)施用至所述受試對象；或 (b)與所述腫瘤或腫瘤細胞接觸。
139.—種治療受試對象中的疾病的方法，其中，所述疾病與β連環素的激活相關，所述方法包括施用治療有效量的權利要求76~105中任一項所述的抗體。
140.如權利要求115~139中任一項所述的方法，所述方法還包括施用至少一種另外的治療劑。
141.如權利要求140所述的方法，其中，所述另外的治療劑是化學治療劑。
142.如權利要求140所述的方法，其中，所述另外的治療劑是Wnt途徑抑制劑。
143.如權利要求116~118或121~142中任一項所述的方法，其中，所述受試對象是人。
144.一種選擇人受試對象以用結合RSP02的抗體進行治療的方法，所述方法包括:確定所述受試對象是否具有RSP02表達水平升高的腫瘤，其中，如果所述腫瘤具有升高的RSP02表達水平，則選擇所述受試對象以用特異性結合RSP02的抗體進行治療。
145.如權利要求144所述的方法，其中，所述腫瘤是胰腺瘤。
146.如權利要求144所述的方法，其中，所述腫瘤是乳腺瘤。
147.如權利要求144所述的方法，其中，所述腫瘤是肺瘤。
148.如權利要求144所述的方法，其中，所述腫瘤是黑素瘤。
149.如權利要求144所述的方法，其中，所述腫瘤是結直腸瘤。
150.如權利要求134或144~149中任一項所述的方法，其中，通過基于PCR的檢驗、微陣列分析或核苷酸測序來確定樣品中RSP02的表達水平。
151.—種選擇人受試對象以用結合RSP02的抗體進行治療的方法，所述方法包括:確定所述受試對象是否具有包含APC基因中的失活突變的腫瘤，其中，如果所述腫瘤具有所述APC基因中的失活突變，則選擇所述受試對象以用特異性結合RSP02的抗體進行治療。
152.如權利要求151所述的方法，其中，所述腫瘤是結直腸瘤。
153.如權利要求135、151或152中任一項所述的方法，其中，通過基于PCR的檢驗、雜交檢驗、微陣列分析或 核苷酸測序來確定樣品中APC基因的失活突變。
154.如權利要求150或權利要求153所述的方法，其中，所述樣品是新鮮的腫瘤樣品、冷凍的腫瘤樣品或福爾馬林固定的石蠟包埋樣品。
155.如權利要求144~154中任一項所述的方法，其中，所述抗體是權利要求76~105中任一項所述的抗體。
156.一種抗體，所述抗體包含SEQ ID NO:25的重鏈氨基酸序列和SEQ ID NO:26的輕鏈氨基酸序列。
157.一種抗體，所述抗體包含SEQ ID NO:41的重鏈氨基酸序列和SEQ ID NO:42的輕鏈氨基酸序列。
158.一種抗體，所述抗體包含SEQ ID NO:68的重鏈氨基酸序列和SEQ ID NO:69的輕鏈氨基酸序列。
159.一種抗體，所述抗體包含SEQ ID NO:70的重鏈氨基酸序列和SEQ ID NO:71的輕鏈氨基酸序列。
160.一種抗體，所述抗體包含SEQ ID NO:70的重鏈氨基酸序列和SEQ ID NO:74的輕鏈氨基酸序列。
161.一種選擇人受試對象以用結合RSP03的抗體進行治療的方法，所述方法包括:確定所述受試對象是否具有RSP03表達水平升高的腫瘤，其中，如果所述腫瘤具有升高的RSP03表達水平，則選擇所述受試對象以用特異性結合RSP03的抗體進行治療。
162.如權利要求161所述的方法，其中，所述腫瘤是肺瘤。
163.如權利要求161所述的方法，其中，所述腫瘤是乳腺瘤。
164.如權利要求161所述的方法，其中，所述腫瘤是卵巢瘤。
165.如權利要求161所述的方法，其中，所述腫瘤是結直腸瘤。
166.如權利要求161~165中任一項所述的方法,其中,通過基于PCR的檢驗、微陣列分析或核苷酸測序來確定樣品中RSP03的表達水平。
167.如權利要求166所述的方法，其中，所述樣品是新鮮的腫瘤樣品、冷凍的腫瘤樣品或福爾馬林固定的石蠟包埋樣品。
168.—種選擇人受試對象以用結合RSP04的抗體進行治療的方法，所述方法包括:確定所述受試對象是否具有RSP04表達水平升高的腫瘤，其中，如果所述腫瘤具有升高的RSP04表達水平，則選擇所述受試對象以用特異性結合RSP04的抗體進行治療。
169.如權利要求168所述的方法，其中，所述腫瘤是肺瘤。
170.如權利要求168所述的方法，其中，所述腫瘤是乳腺瘤。
171.如權利要求168所述的方法，其中，所述腫瘤是卵巢瘤。
172.如權利要求168~171中任一項所述的方法，其中，通過基于PCR的檢驗、微陣列分析或核苷酸測序來確定樣品中RSP03的表達水平。
173.如權利要求172所述的方法，其中，所述樣品是新鮮的腫瘤樣品、冷凍的腫瘤樣品或福爾馬林固定的石 蠟包埋樣品。
【文檔編號】A61K39/395GK104023746SQ201280045135
【公開日】2014年9月3日 申請日期:2012年7月13日 優先權日:2011年7月15日
【發明者】奧斯丁·L·格尼, 富米考·塔卡達·阿克塞爾羅德, 蒂莫西·查爾斯·霍伊, C·沙爾捷-庫爾托 申請人:昂考梅德藥品有限公司