用于預防錦鯉皰疹病毒(khv)引起的疾病的重組khv和疫苗的制作方法

用于預防錦鯉皰疹病毒(khv)引起的疾病的重組khv和疫苗的制作方法
【專利摘要】本發明涉及重組錦鯉皰疹病毒(KHV)、用于生產此類KHV的方法、包含此類KHV的細胞和此類KHV作為載體和在預防和/或治療性處理魚中由鯉魚諸如普通鯉魚或錦鯉中的錦鯉皰疹病毒引起的疾病中的用途。
【專利說明】用于預防錦鯉皰疹病毒（KHV)引起的疾病的重組KHV和疫 苗
[0001] 本發明涉及重組錦鯉皰疹病毒（KHV)、用于生產此類KHV的方法、包含此類KHV的 細胞和此類KHV作為載體和在預防和/或治療性處理魚中由鯉魚諸如普通鯉魚 carpio carpio)或錦鯉carpio ioi)中的錦鯉皰疫病毒引起的疾病中的 用途。
[0002] 普通鯉魚是主要在亞洲、歐洲和中東最廣泛養殖的供人食用的魚。相比之下，在全 世界，尤其在日本，培育錦鯉亞種作為用于個人愛好或競賽性展覽的寵物魚。1996年在英國 檢測到一種在普通鯉魚和錦鯉兩者中引起致死疾病的病毒，其最初被稱為錦鯉皰疹病毒病 (KHVD)。然后該病毒被迅速確認為在以色列、美國和德國的錦鯉和普通鯉魚中大量死亡的 原因。普通鯉魚的密集養殖、錦鯉展覽和國際貿易已經促進了這種高度傳染和毒力極高的 疾病的全球迅速傳播。由于其出現，KHVD已經在全球錦鯉和普通鯉魚養殖業中引起了嚴重 的金融和經濟損失。
[0003] 病毒的初步表征顯示皰疹樣結構，具有包膜和殼狀結構圍繞的100-110 nm的二十 面體電子致密核心。病毒的基因組包含約?295 kb的線性雙鏈DNA (dsDNA)，與鯉皰疹病 毒1 (CyHV-Ι)相似，但大于大小通常為125-240kb的皰疹病毒成員的那些。KHV基因組序 列最近已經公布（Aoki等人，J Virol, 81，pages 5058-5065 (2007))。KHV基因組含有 顯著量的與任何其它已知病毒序列無同源性的DNA序列。此外，其含有高度分歧（highly divergent)的編碼多肽的DNA序列，其與幾種dsDNA病毒（如皰疹病毒、痘病毒、虹彩病毒 和其它大型DNA病毒）的那些類似。
[0004] 該病毒的獨特特征已經導致了三種不同的命名：首先，根據其形態表現命名為 錦鯉皰疹病毒（KHV);其次，根據其在魚類中的致病作用命名為鯉間質性腎炎和鰓壞死 病毒（CNGV);最后，根據與CyHV-Ι和與CyHV-2的基因內容相似性命名為鯉皰疹病毒3 (CyHV-3)。最后的命名已經得到最新的病毒基因組全長測序的進一步支持。然而，以下將 使用名稱KHV。
[0005] KHV具有約295 kb的基因組，其代表皰疹病毒成員中曾經鑒定的最大基因組。盡 管首次分離KHV始于1996年，但關于個別基因在KHV發病機理和感染天然宿主的生物學中 的作用只獲得很少的信息。
[0006] 國際專利申請W0 2004/061093 A1中已經描述了減毒KHV及其作為疫苗候選物的 潛在用途。然而，該疫苗候選物隱藏了潛在的危險。減毒是病毒體外復制過程中發生的隨 機突變的結果。因此，減毒的特征是未知的，且不能排除其回復到完全致病表型。
[0007] KHV的應用研究和基礎研究需要產生重組病毒。最近，通過使用細菌人工染色體 (BAC)載體使操作大皰疹病毒基因組變得可行（Messerle等人，Proc Natl Acad Sci U S A, 94，14759-14763 (1997) ;Wagner 等人，Trends Microbiol, 10，318-324 (2002)，參 見下文）。這些載體允許在大腸桿菌中維持和有效誘變病毒基因組，隨后通過用 BAC質粒轉染進入真核允許細胞中來重構子代病毒顆粒。迄今為止，幾種皰疫病毒的基因組 已經作為感染性BAC克隆成功繁殖，包括人巨細胞病毒（HCMV)，其代表迄今為止作為BAC克 隆的第二大皰疹病毒基因組（230 Kb) (Borst 等人，J Virol, 73，8320-8329 (1999))。
[0008] 最近，已經使用BAC技術首次構建了幾種重組KHV ;這些重組體都描述于PCT專 利申請W02009/027412。該專利申請公開了制備在選自以下的一種或多種基因中具有缺陷 的重組KHV的方法：0RF55 :胸苷激酶基因；0RF12 :推定的腫瘤壞死因子（TNF)受體基因； 0RF16 :推定的G-蛋白偶聯受體（GPCR)基因；0RF134 :推定的白介素10同源基因；0RF140 : 推定的胸苷酸激酶基因，或它們的組合。此類突變體被用作活減毒疫苗病毒。
[0009] 顯示這些突變體中的一些當在一定大小和魚齡的特定SPF魚中使用時是安全的。 然而，在現場，漁民對早期疫苗接種感興趣，即當魚相對年幼/小時和魚的大小存在比較大 的分布的情況下。結果是，在此類條件下，基于如國際專利申請W02009/027412中公開的缺 失突變病毒的疫苗在一些情況下可能不是足夠安全的：此類重組KHV對于在年幼/小魚中 使用毒性太強。
[0010] 這意味著，目前，仍然缺乏用于控制現場情況諸如魚養殖中的安全且有效減毒的 重組疫苗。
[0011] 本發明的一個目的是提供可用于開發在現場控制KHV感染的安全且有效的減毒 疫苗的新型重組KHV病毒。
[0012] 現在令人驚訝地發現，開放閱讀框57 (0RF57)缺陷的重組KHV顯示強烈降低的死 亡率或完全沒有死亡，甚至在這種皰疹病毒重組體感染的非常年幼/小鯉魚中也是如此， 并提供針對野生型錦鯉皰疹病毒的免疫。此類重組KHV因此提供了可以合適地在年幼和/ 或小鯉魚中使用的安全且有效的減毒疫苗病毒。
[0013] 鑒于0RF57是到目前為止被認為是必需基因（沒有活病毒在沒有它的情況下是可 行的）的事實，該發現甚至更令人驚訝。
[0014] 因此，本發明的第一實施方案涉及0RF57缺陷的重組錦鯉皰疹病毒，導致產生減 毒的KHV并當用所述皰疹病毒感染時，誘導鯉魚優選普通鯉魚或錦鯉中40%或更少的死亡 率。
[0015] 如本文所用，"缺陷的"〇RF57是不再有功能，即不再能夠編碼功能蛋白的0RF57。 如本文所用，缺陷0RF57導致產生以下KHV :其被減毒至其在鯉魚中誘導40%或更低的死亡 率的水平。此類缺陷可以例如通過突變諸如編碼0RF57的基因中或其啟動子區域中插入或 缺失一個或多個核苷酸而獲得。此類突變可以例如是基因的5'位點的移框突變，或啟動子 區域（的一部分）或基因本身（的一部分）的缺失。
[0016] 0RF57的DNA序列的實例是如Genbank登錄號NC_009127給出的0RF57的DNA序 列，其中0RF57起始和終止密碼子位于位置99382和100803。不言而喻，0RF57的位置可能 由于自然變異在其它KHV毒株中不同。另外，由于自然變異，當與另一種KHV毒株比較時，一 種KHV毒株中的0RF57序列中可能存在小差異。因此，如本文所述的0RF57是與如Genbank 登錄號NC_009127給出的0RF57的DNA序列具有大于80%的序列同一性的開放閱讀框。
[0017] 橫跨核苷酸96630-101558的包含0RF56、57和58的核苷酸區域表示在SEQ ID N0:12中。還參見圖1。
[0018] 清楚的是，制備基因缺陷，即整個0RF57缺失，的最廣泛的方法將導致完全沒有 0RF57蛋白產生。
[0019] 從實用的角度和安全的觀點來看，此類完全缺失將是采取的合乎邏輯的步 驟。然而，如下從圖1來看，推定的啟動子區域位于可能參與相鄰0RF58的表達的位置 100212-100261。出于這個原因，0RF57中的突變應當優選不延伸進這個區域。因此，優選 在位置100212的左手側或位置100261的右手側的區域中引入ORF57中的突變。
[0020] 從圖1還可以看到，兩個推定的啟動子區域分別位于可能參與相鄰0RF56的表達 的位置99451-99500和位置99794-99843。因此，0RF57中區域中的缺失干擾0RF56的表 達在理論上是可能的。在那種情況下，可能根據本發明的0RF57缺陷的重組KHV僅僅由于 0RF56的較低表達而表現為減毒。然而，實施例部分中顯示：1) 0RF56不是必需基因，以及 2)缺陷的0RF56對于根據本發明的重組KHV的減毒特征沒有貢獻。在這些實施例中顯示， 可以在0RF56中進行大的缺失，而不影響重組KHV的生存力且不顯著改變重組KHV的減毒 特征。這尤其暗示位于0RF57中的推定的0RF56啟動子位點可以毫無問題地去除。
[0021] 也從圖1中得出結論，0RF57的兩個推定的啟動子位點位于0RF56中的位置 97075-97124和98712-98761。因此，不能排除，0RF57的小部分的缺失，諸如0RF57 Del 1， 提供了截短但仍有功能的0RF57編碼的蛋白。為了排除這種可能性，如實施例部分中所述， 可以進行橫跨位置97001-99750的區域的大0RF56-0RF57雙缺失。這種缺失的行為基本上 等于單0RF57突變體，如與圖7相比的圖5中可以看到。因此，可以得出結論，0RF57編碼 的蛋白對于病毒是非必需的。
[0022] 0RF57的只有小部分的缺失是一種可能性，其出于上面給出的理由甚至可以是一 種優選的可能性，但是必須當心所得截短蛋白是無功能的。如果技術人員會出于任何原因 決定缺失小于全0RF57,他就能夠容易地檢查0RF57是否變得缺陷：非缺陷0RF57會導致病 毒具有太高水平的毒力，即太低水平的減毒。
[0023] 優選地，所述重組KHV額外地在一種或多種病毒基因中是缺陷的，所述病毒基因 對毒力有貢獻，但對于病毒復制不是必需的。
[0024] 因此，該實施方案的優選形式涉及根據本發明的重組錦鯉皰疹病毒，其在至少一 種額外的基因中是缺陷的，所述基因對毒力有貢獻，但對于病毒復制不是必需的。
[0025] 該實施方案的更優選形式涉及根據本發明的重組錦鯉皰疹病毒，其在至少一種額 外的基因中是缺陷的，所述基因對毒力有貢獻，其中所述基因選自胸苷激酶基因；0RF12 : 推定的腫瘤壞死因子（TNF)受體基因；0RF16 :推定的G-蛋白偶聯受體（GPCR)基因； 0RF134 :推定的白介素10同源基因；0RF140 :推定的胸苷酸激酶基因，或它們的組合。
[0026] 在該實施方案的一個甚至更優選的形式中，重組KHV在至少胸苷激酶基因或推定 的胸苷酸激酶基因中是額外缺陷的。
[0027] 在該實施方案的另一個甚至更優選的形式中，根據本發明的重組KHV在胸苷激酶 基因和至少一種選自以下的對毒力有貢獻的其它基因中是額外缺陷的：〇RF12 :推定的腫 瘤壞死因子（TNF)受體基因；0RF16 :推定的G-蛋白偶聯受體（GPCR)基因；0RF134 :推定的 白介素10同源基因或0RF140 :推定的胸苷酸激酶基因。
[0028] 在該實施方案的一個仍甚至更優選的形式中，重組KHV在至少胸苷激酶基因和推 定的胸苷酸激酶基因中是額外缺陷的。
[0029] 在本實施方案的另一個優選形式中，根據本發明的重組錦鯉皰疹病毒為活形式。 優選地，當引入到真核允許細胞或魚個體（優選鯉類，更優選鯉魚（Cjpri/HAs carpio)，甚 至進一步優選普通鯉魚和/或錦鯉）時，重組錦鯉皰疹病毒優選具有重構感染性顆粒（即 復制）的能力。
[0030] 在一個可替代實施方案中，根據本發明的重組KHV在一種或多種對于復制是必需 的病毒基因中是額外缺陷的（并且任選地在一種或多種對于毒力有貢獻但對于病毒復制 不是必需的病毒基因中是缺陷的），因此提供了非復制形式的根據本發明的重組錦鯉皰疹 病毒。
[0031] 因此，一個可替代實施方案涉及根據本發明的重組KHV，其中所述皰疹病毒是非復 制形式。
[0032] "非復制形式"意味著重組錦鯉皰疹病毒仍然具有感染細胞或魚個體（例如鯉魚、 普通鯉魚或錦鯉）的能力，但不能夠復制到形成感染子代病毒的程度。
[0033] 非復制重組毒株通過失活（借助已知的技術，諸如插入、缺失或突變，例如使用 BAC克隆）對于復制必需的KHV基因而產生。
[0034] 在穩定表達缺失基因（反式互補）的允許細胞系上培養此類缺失的病毒。
[0035] 這種方法是本領域眾所周知的方法。所述方法尤其已成功用于不同的皰疹病毒， 諸如缺失了 gH的Suid皰疹病毒1 (偽狂犬病病毒）（Babic等人，1996)和牛皰疹病毒 1 (Schr5der 和 Keil, 1999)。
[0036] 可以使任何對復制有貢獻的基因缺陷，以獲得非復制的重組錦鯉皰疹病毒。換言 之，可以缺失其失活導致非復制重組錦鯉皰疹病毒的任何基因。優選地，為了提供病毒的非 復制型形式而缺失的根據本發明的重組KHV的基因選自： ORF25. ORF31. ORF32. ORB4. ORF55. ORF42. ORF43. ORF45. ORF51. ORF59. ORFAO, ORF62, (3RF?. ORFftf%. ORR?. ORF70. ORF72, 0RF7H. C3RFHI, ORFH4, C3RFS9. ORF90. ORF92, 0RFy5, ORF97, ORFW, ORF i OK, ORF i 15, ORF 131, ORF 132, ORF i 36, OR F B7, ORF14K {丨 ORFHSi。
[0037] 根據本發明的重組錦鯉皰疹病毒優選包含細菌人工染色體（BAC)載體序列。
[0038] 從約十五年以來，此類細菌人工染色體的使用已經大大促進了大皰疹病毒基因組 的操作。這些載體允許在大腸桿菌中維持和誘變病毒基因組，隨后通過轉染BAC質粒到真 核允許細胞中，將子代病毒粒子重構。在第一步，通過在感染細胞中的常規同源重組將BAC 載體序列引入皰疹病毒基因組中。皰疹病毒的線性雙鏈DNA基因組在復制過程中環化。其 足以分離BAC突變體的環狀復制中間體，并通過DNA轉化到大腸桿菌中而進行穿梭。只需 要這種穿梭一次以建立系統。皰疹病毒BAC然后在大腸桿菌中繁殖和突變。將同源克隆皰 疹病毒BAC DNA穿梭回僅用于病毒重構的真核允許細胞。由于不需要病毒功能，所以在大 腸桿菌中時該病毒基因組保持休眠，保留了克隆時存在的病毒功能。在體外培養程序改變 分離株的真正特性時，這對于病毒是重要的。
[0039] 如本文所用，術語"同源重組"是指當兩個不同的同源核酸分子相互遭遇時，發生 交叉并生成核酸的新組合。如本文所用，術語"介導同源重組的序列"是指引起同源重組的 序列，所述同源重組依賴于催化、進行或輔助同源重組的特異性重組蛋白。此類重組蛋白優 選特異性作用于"介導同源重組的序列"，但不作用于其它序列。
[0040] BAC載體序列是本領域中眾所周知的，并且本領域中已經經常描述了它們在重組 病毒諸如皰疹病毒的構建中的用途必I, E. Hahn.0., Kogmnvsku MaserL M. Vird 71 幻2i>4. il B,n Del forge, t" Ray, VTS," Dmvalx 11,, C tiller Orion. ?Κ, Brnty, Ar, Schynts, F_, I jcffrsg, F,s Vaiidcrpia^clien, A., 2CM)H. J Virol H2, 4955-44)M. IXn^-ak, B., Batidry, Ciillei, L,, Markme? fjimayjioiT, tie Laval, L" Haig, D, M, & Viindcqilassdnen, A, (20061, J Gqu Virol K7% 5(W-17, i]illct. I... Diiix. V,. iXmofriii. Cj.. Wagner. M. Kos/inowski. ?. H" C hina. B.. Ackcmtann. M.. Markine-CiorkiyiiuiT, K, &, VandcrplaNHcltcii,, A. (2〇〇5i J (icn Vlrul K6, 9E)7*17. Messerle. M.. 1,. HainiiienidiPiKft. WH. Ziegler. H & Kt)5%/iiww^ki,. tl Vi i I9y?>, Proc Katl Acad Sii U S A W, 147"我\ S.XtoiMtii紙 C·"，D- L, Jerikiiis, N"l & {2005), Nucleic Aeab Res 33, e36, Wagner, M., R^l7^ic^ Z. & Kas/inmvski, U, H. (2CM)2). Trends Microbiol 10, JI>：~24| 0
[0041] BAC載體序列不一定要插入0RF57。或者，其可以插入對毒力有貢獻的任何其它病 毒基因和/或對病毒復制必需或不是必需的任何其它病毒基因和/或任何基因間區域中。
[0042] 然而，在一個更優選的形式中，重組錦鯉皰疹病毒包含插入到0RF57中的BAC載體 序列。此類插入的優點在于，通過將BAC載體插入0RF57,0RF57同時變得缺陷，因此直接提 供根據本發明的重組KHV。
[0043] 根據本發明的重組KHV的一個實例通過將修飾的ΙοχΡ-側接的BAC盒插入0RF55 而克隆KHV基因組而實現（參見下文）。該插入導致BAC重組病毒，其基因組在細菌中穩 定保持，且當轉染允許細胞時能夠再生病毒顆粒。（對于BAC-載體詳情，參見：C 〇stes， B., Fournier, G., Michel, B. , Delforge，C. , Raj, V. S. , Dewals, B., Gillet，L， Drion，P. , Body, A. , Schynts, F. , Lieffrig，F. , Vanderplasschen, A. , 2008，J Virol 82，4955-4964,對于技術詳情，參見下文）。該載體用來在0RF57中引入缺失。
[0044] 術語"BAC載體"是指使用大腸桿菌的F質粒產生的質粒和在細菌諸如大腸桿菌等 中可以穩定保持且產生約300 kb或以上的大尺寸DNA片段的載體。所述BAC載體至少含 有對于BAC載體的復制必需的BAC載體序列。此類對于復制必需的區域的實例包括但不僅 限于F質粒的復制起點及其變體。
[0045] 如本文所用，術語"BAC載體序列"是指包含對于BAC載體的功能必需的序列的序 列。任選地，BAC載體序列可以進一步包含"依賴于重組蛋白的重組序列"和/或"可選擇 標記"。
[0046] 亦即"重組蛋白依賴性重組序列"和/或"選擇標記"的詳情在例如上文引用的文 獻中和W0 22009/027412中給出。
[0047] 無論BAC載體插入基因組中的位置，優選的是，BAC載體序列側接介導同源重組的 序列，優選ΙοχΡ。
[0048] 此外，優選地，BAC載體序列包含可選擇標記（參見下文）。在更優選的形式中，可 選擇標記為藥物可選擇標記（參見下文）。
[0049] 在另一個優選的實施方案中，所述重組皰疹病毒的基因組以質粒的形式存在。這 可通過分離上述包含BAC載體序列的重組錦鯉皰疹病毒的環狀形式，并將其引入細菌細胞 而實現。如上所述，在一種或多種對毒力有貢獻或對復制必需的病毒基因中插入BAC (細 菌人工染色體）載體序列對本發明不是必需的，只要通過基因工程改造技術使一種或多種 所述對毒力有貢獻或對復制必需的基因缺陷。
[0050] 因此，可以將BAC載體序列插入病毒基因組的任何區域，條件是0RF57和優選一種 或多種對毒力有貢獻的其他病毒基因也是缺陷的。
[0051] 當然，可以重復使用利用如上所述的BAC載體介導的克隆技術：例如第一次使 0RF57缺陷且第二次使額外基因缺陷。
[0052] 在進一步應用中，BAC載體序列在原則上可以毫無問題地仍然存在于根據本發明 的重組KHV中。然而，對于根據本發明的錦鯉皰疹病毒在例如疫苗中的應用，優選除去大部 分BAC序列。例如，對于包含編碼選擇性標記的基因的BAC序列就是這樣，且甚至對于抗性 基因更是如此。此類基因在疫苗中的存在，不僅被認為不必要，而且甚至是不期望的。
[0053] 因此，優選地，從所述皰疹病毒基因組中切除BAC載體序列的至少一部分（例如， 包含抗性基因或可選擇標記的部分）或更優選大部分，從而在所述皰疹病毒基因組中的切 除位點或先前插入位點優選留下異源序列。異源序列的大小優選少于200個核苷酸。所述 切除通過將所述重組KHV引入表達切除側接BAC載體序列的ΙοχΡ的Cre重組酶的真核允 許細胞而實現。
[0054] 因此，該實施方案的一個優選形式涉及根據本發明的重組錦鯉皰疹病毒，其特征 在于從所述皰疹病毒基因組中切除BAC載體序列的部分，從而分別在所述皰疹病毒基因組 中的切除位點或先前插入位點留下異源序列。
[0055] 并且，在該實施方案的一個更優選形式中，從所述皰疹病毒基因組中切除的BAC 載體序列的部分包含至少一種編碼選擇標記的基因和/或抗性基因。
[0056] 也可以使用涵蓋BAC盒的插入位點的野生型病毒基因組的DNA片段（例如，編碼 TK的0RF55)通過在真核細胞中的同源重組完全去除BAC盒。選擇不再表達EGFP (由BAC 盒編碼）的病毒斑塊允許選擇已經將BAC插入位點回復到野生型序列的重組體。
[0057] 任一形式的根據本發明的重組錦鯉皰疹病毒、KHV BAC克隆和上述其中至少部分 BAC載體序列從皰疹病毒基因組中切除的KHV構建體可用于涉及例如遺傳工程改造技術的 進一步操作以使基因組在其它特定基因中缺陷。如上面已經描述，此類其它基因的缺陷同 樣可以使用BAC技術來獲得。
[0058] 盡管根據本發明的重組KHV可以如此用于疫苗目的（參見下文），但僅僅為了防止 魚，更具體鯉魚，甚至更具體普通鯉魚或錦鯉，免于KHV疾病，其也可以有效地用作用于異 源（即非KHV) DNA片段的載體病毒。在那種情況下，根據本發明的重組KHV的有利特征將 被充分利用，并且此外，病毒將例如獲得額外特性，諸如標記特性、額外免疫特性或佐劑特 性。
[0059] 在這方面，"標記特性"是指異源DNA片段允許直接或間接區分實地病毒感染或疫 苗病毒感染。
[0060] 區分實地病毒感染和疫苗病毒感染的一種直接方式可以，例如，包含PCR反應，所 述PCR反應使用與根據本發明的重組KHV中的異源（即非KHV) DNA片段特異性反應，但不 與KHV實地病毒的DNA特異性反應的引物。
[0061] 區分實地病毒感染和疫苗病毒感染的一種間接方式可以，例如，包含免疫反應，所 述免疫反應使用與根據本發明的重組KHV中的異源（即非KHV) DNA片段編碼的免疫原性 蛋白特異性反應，但不與KHV實地病毒的任何蛋白特異性反應的抗體。
[0062] 因此，本發明的另一個實施方案涉及包含異源DNA片段，例如，異源基因的根據本 發明的重組KHV。
[0063] 優選地，此類異源DNA片段是編碼另一種病毒或微生物的免疫原性蛋白的異源基 因，所述另一種病毒或微生物對魚、更具體鯉魚、甚至更具體普通鯉魚或錦鯉是致病的。 [0064] 更優選地，所述異源基因是引起鯉魚春季病毒血癥的棒狀病毒（rhabdovirus)的 G糖蛋白。此類構建體，當在疫苗中使用時，將不僅保護鯉魚免于KHV，而且保護鯉魚免于鯉 魚春季病毒血癥。
[0065] 用于在真核細胞中表達異源基因的合適啟動子是本領域中眾所周知的。用于表達 異源基因（例如引起鯉魚春季病毒血癥的棒狀病毒的G糖蛋白）的合適啟動子的一個實例 是HCMV IE啟動子。
[0066] 本發明進一步提供了用于產生重組錦鯉皰疹病毒（KHV)的感染性顆粒的方法，其 中所述方法包括以下步驟： (a) 將根據本發明的重組KHV或包含根據本發明的重組KHV的基因組的重組KHV DNA 引入真核允許細胞中；和 (b) 培養宿主細胞以產生重組錦鯉皰疹病毒（KHV)。
[0067] 由于它們的減毒特征，上述根據本發明的重組錦鯉皰疹病毒和它們的DNA非常適 合用于通過注射或浴療法或經口的魚免疫，優選普通鯉魚或錦鯉個體。
[0068] 因此，本發明的又另一個實施方案提供了根據本發明的重組錦鯉皰疹病毒和/或 包含根據本發明的重組錦鯉皰疹病毒的基因組的KHV DNA，其用于預防和/或治療性處理 魚中的由錦鯉皰疹病毒（KHV)引起的疾病。
[0069] 預防性用途是目的在于預防感染，或疾病的至少臨床表現的用途。
[0070] 治療性用途是所述KHV或KHV DNA在已經患有KHV引起的疾病的魚中的用途。
[0071] 本發明的再另一個實施方案提供了根據本發明的重組錦鯉皰疹病毒和/或包含 根據本發明的重組錦鯉皰疹病毒的基因組的KHV DNA，其用于預防和/或治療性處理魚中 的由錦鯉皰疹病毒（KHV)引起的疾病的疫苗中。
[0072] 本發明的又另一個實施方案提供了用于預防和/或治療性處理魚中的由錦鯉皰 疹病毒（KHV)引起的疾病的疫苗，其特征在于所述疫苗包含根據本發明的重組錦鯉皰疹病 毒和/或包含根據本發明的重組錦鯉皰疹病毒的基因組的KHV DNA，和藥學可接受的載體。
[0073] 本發明的再另一個實施方案提供了用于預防和/或治療性處理魚中的由引起鯉 魚春季病毒血癥的棒狀病毒引起的疾病的疫苗，所述疫苗包含攜帶編碼所述引起鯉魚春季 病毒血癥的棒狀病毒的G糖蛋白的基因的重組KHV或包含所述重組KHV的基因組的DNA序 列，和藥學可接受的載體。
[0074] 本文所用的術語"疫苗"指能夠預防和/或治療宿主針對特定疾病的組合物。所 述疫苗可產生預防性的或治療性的免疫力。
[0075] 藥學可接受的載體可以和水或緩沖液一樣簡單。藥學可接受的載體還可以包含穩 定劑。它還可以包含佐劑，或者它本身可以是佐劑。
[0076] 通常，將疫苗制成液體溶液、乳液或懸浮液，用于注射或通過將魚浸沒在水中而遞 送。例如，可以制備液體乳液或可乳化濃縮物，以便將其添加到養魚的水箱或水缸。還可 以制備適于在施用之前溶解或懸浮于液體媒介物，或用于與固體食物混和的固體（例如粉 末）形式。該疫苗也可以是用于用滅菌稀釋劑重構的即用形式的凍干培養物。例如，凍干 細胞可以在0.9%鹽水（任選地作為包裝疫苗產品的部分提供）重構。可注射疫苗的優選 制劑是乳液。可以在添加到魚圈（pen)、魚箱或魚缸前，將疫苗的液體或重構形式在少量水 (例如1-100體積）中稀釋。
[0077] 在本實施方案的一個優選形式中，包含所述重組KHV毒株的疫苗制劑可以為干形 式，例如粉末形式、凍干形式、壓縮小球或片劑形式等。
[0078] 在本實施方案的另一個形式中，所述病毒可以是組織培養液的形式。所述液體可 在周圍環境中保存，優選在_70°C保存，最優選作為含有甘油的溶液保存。在一個具體實施 例中，所述組織培養液含有20 %甘油。
[0079] 本發明中公開的重組KHV毒株可以通過多種方法轉化為干形式。干燥的特別優選 的形式是通過凍干。在干燥前，例如凍干程序前，可以將各種成分（諸如防腐劑、抗氧化劑 或還原劑、各種賦形劑等）添加到介質中。也可以將此類賦形劑還在干燥步驟后添加到干 的（例如凍干的）活減毒病毒中。
[0080] 當根據本發明的重組KHV用作用于口服施用（例如，通過浸沒或浴療法）的疫苗 組分時，通常將不需要施用佐劑。
[0081] 然而，如果將所述疫苗制劑直接注射到魚中，佐劑的使用是任選的。如果根據本發 明的重組KHV是非復制形式，免疫刺激劑的添加可以是優選的。
[0082] 通常，為了增強免疫應答，所述制劑可以包括各種佐劑、細胞因子或其它免疫刺激 齊IJ，特別在制劑用于注射的情況下。
[0083] 佐劑為以非特異性方式增強宿主免疫應答的免疫刺激物質。所述佐劑可為親水性 佐劑（例如氫氧化鋁或磷酸鋁）或疏水性佐劑（例如基于礦物油的佐劑）。可將佐劑與根 據本發明的重組KHV混合，所述佐劑諸如：胞壁酰二肽、親和素（avidine)、氫氧化鋁、磷酸 鋁、油、油乳液、皂苷、硫酸葡聚糖、葡聚糖、細胞因子、嵌段共聚物、免疫刺激寡核苷酸和其 它本領域已知的佐劑。在魚類養殖中常用佐劑的實例為胞壁酰二肽、脂多糖、多種葡聚糖和 聚糖和Carbopol? (-種均聚物）。合適佐劑為例如油包水（w/o)乳液、o/w乳液和w/o/w 雙-乳液。適用于w/o乳液中的油佐劑為例如礦物油或可代謝油。礦物油為例如：Bayol?、 Marcol?和Drakeol?;可代謝油為例如植物油（諸如花生油和豆油）或動物油（諸如魚 油）、角鯊烷和角鯊烯。或者，可以有利地使用在EP 382, 271中描述的維生素 E (生育酚） 增溶物。非常合適的ο/w乳液例如從5-50% w/w水相和95-50% w/w油佐劑開始獲得，更 優選使用20% -50% w/w水相和80-50% w/w油佐劑。佐劑的添加量取決于佐劑本身的性 質和制造商提供的關于此類量的信息。
[0084] 在一個優選的實施方案中，根據本發明的疫苗還包含穩定劑。可以將穩定劑添加 到根據本發明的疫苗，例如，以防止其降解，延長保質期或提高凍干效率。有用的穩定劑可 尤其為 SPGA (Bovarnik 等人，1950，J. Bacteriology, vol. 59，ρ· 509)、脫脂乳、明 膠、牛血清白蛋白、碳水化合物例如山梨醇、甘露醇、海藻糖、淀粉、鹿糖、葡聚糖或葡萄糖、 乳糖、蛋白質諸如白蛋白或酪蛋白或其降解產物，和緩沖液諸如堿金屬磷酸鹽。
[0085] 可以添加抗生素諸如新霉素和鏈霉素以防止病菌的潛在生長。
[0086] 此外，疫苗可以包含一種或多種合適的表面活性化合物或乳化劑，例如Span?或 Tween?。疫苗也可包含所謂"媒介物（vehicle)"。媒介物為根據本發明的KHV病毒（或 為病毒顆粒形式或為DNA形式）粘附而不與其共價結合的化合物。此類媒介物為生物微 膠囊、微藻酸鹽、脂質體和大分子溶膠（macrosol)，其均為本領域已知。此類媒介物的特 殊形式為Iscom。不言而喻，將其它穩定劑、載體、稀釋劑、乳液等與根據本發明的疫苗混 和也在本發明的范圍內。此類添加劑例如描述于眾所周知的手冊諸如"Remington: the science and practice of pharmacy" （2000， Lippincot， USA, ISBN: 683306472)和 ''Veterinary vaccinology" (P. Pastoret等人編，1997, Elsevier, Amsterdam, ISBN: 0444819681)。
[0087] 當在疫苗中以干形式使用時，重組KHV毒株可以進一步包括重構液，優選無菌水、 鹽水或生理溶液。其也含有來自制造過程的少量殘留物質，諸如細胞蛋白質、DNA、RNA等。 盡管這些物質本身不是添加劑，但其可以存在于疫苗制劑中。
[0088] 疫苗可以通過口服，例如通過它們的飼料或通過強制經口施用或通過注射（例 如，經由肌肉或腹膜內途徑），個體施用于魚。
[0089] 或者，疫苗可以通過噴灑、溶解和/或浸沒疫苗來同時施用于水體中含有的整個 魚群體。這些方法可用于接種所有種類的魚（例如食用魚和觀賞魚）和用于各種環境諸如 池塘、水族館、自然棲息地和淡水水庫中。
[0090] 本發明的進一步方面涉及包含根據本發明的重組KHV的DNA疫苗。
[0091] 在包含根據本發明的重組KHV的基因組的意義上，根據本發明的DNA疫苗與包含 根據本發明的重組KHV的疫苗沒有基本上的不同。
[0092] 它們可以通過皮內應用，例如使用無針注射器諸如GeneGun?，容易地施用。這種 施用方式將DNA直接遞送到待接種的動物細胞內。在根據本發明的藥物組合物（如下文 述）中的根據本發明的重組KHV DNA的優選量在10 pg-1000 Pg的范圍內。優選地，使用 0. 1-100 Pg的范圍內的量。或者，可以將魚浸沒在包含例如10 pg-1000 Pg/ml之間的待施 用DNA的溶液中。所有這些技術和施用途徑都是本領域眾所周知的。
[0093] 優選地，將根據本發明的疫苗配制為適于注射或浸沒接種的形式，諸如懸浮液、溶 液、分散液、乳液等。
[0094] 用于將根據本發明的疫苗應用于目標生物的劑量方案可以是單劑量或多劑量的 應用，其可以與劑量和制劑相容的方式，且以免疫有效量同時或依次給予。確定治療是否是 "免疫有效"完全在本領域技術人員的能力之內，例如通過將實驗攻擊感染施用于經接種的 動物，并隨后確定目標動物的疾病臨床體征、血清學參數，或通過測量病原體的再次分離。
[0095] 對于基于根據本發明的重組KHV或重組KHV DNA的根據本發明的疫苗，由多少構 成"藥學有效量"取決于期望的效果和目標生物。確定有效量完全在普通技術人員的技術 之內。包含在根據本發明的藥物組合物中的根據本發明的重組KHV DNA的優選量已經在上 文描述。
[0096] 包含根據本發明的重組KHV毒株的活疫苗的優選量例如表示為噬斑形成單位 (pfu)。例如，對于活病毒載體，可以有利地使用1-101°噬斑形成單位（pfu)/動物劑量、優 選10 2 -106pfu/劑的劑量范圍。
[0097] 可以應用本領域均已知的許多施用方式。優選經由注射（肌肉內或腹膜內途徑）、 浸沒、浸漬或口服將根據本發明的疫苗施用于魚。施用方案可以根據標準接種實踐進行優 化。
[0098] 如果疫苗包含根據本發明的重組KHV的非復制形式，則劑量將表示為待施用的非 復制病毒顆粒的數目。然后，當與活病毒顆粒的施用比較時，劑量通常會略高，因為活病毒 顆粒在它們被免疫系統除去之前在目標動物中復制到一定程度。對于基于非復制病毒顆粒 的疫苗，約1〇 4至1〇9個顆粒范圍內的病毒顆粒量通常是合適的。
[0099] 優選經由浸沒施用所述疫苗，特別當使用本發明的活重組KHV時。這在商業水產 養殖的背景下使用此類疫苗的情況下特別有效。
[0100] 圖注 圖1 :涵蓋0RF57的CyHV-3基因組區域的示意圖。注明了每個0RF的ATG和終止密碼 子的坐標（根據GenBank登錄號NC_009127)。提供了通過在計算機芯片上分析鑒定的在 0RF56和0RF57之內或附近的推定啟動子（P)的坐標。字母P之后的數字標識在鑒定的啟 動子序列控制下的0RF。待缺失以使0RF56和/或0RF57無效的選擇的序列表示在頂部。 注明了缺失的坐標。
[0101] 圖2、3 :階段流程圖，進行所述階段以產生缺失0RF57 (圖2)或0RF56 (圖3)的 FL BAC galK重組質粒并表明從產生的質粒重構感染性病毒。使用在大腸桿菌中的同源重 組用galK表達盒替換如圖1中鑒定的0RF57或0RF56的區域。為了重構具有野生型胸苷 激酶（TK)基因座的感染性病毒（FL BAC回復毒株），將重組質粒與pGEMT-TK質粒共轉染 CCB允許細胞。為了重構具有TK的截短形式的感染性病毒（FL BAC切除毒株），將重組質 粒轉染到表達Cre重組酶的CCB細胞中。
[0102] 圖4 :階段流程圖，進行所述階段以產生缺失0RF57和0RF56 (0RF56-57)的FL BAC 重組質粒并表明從產生的質粒重構感染性病毒。使用在大腸桿菌中的同源重組，用galK表 達盒替換如圖1中鑒定的0RF56-57的區域。然后通過使用對應于側接galK表達盒的KHV 基因組區域的合成DNA序列（0RF56-57 Del盒）的同源重組，去除galK表達盒。為了重構具 有野生型胸苷激酶（TK)基因座的感染性病毒（FL BAC回復毒株），將重組質粒與pGEMT-TK 質粒共轉染CCB允許細胞。為了重構具有TK的截短形式的感染性病毒（FL BAC切除毒株）， 將重組質粒轉染到表達Cre重組酶的CCB細胞中。
[0103] 圖5 :0RF57單缺失重組體的安全性（A-D)和接種疫苗/攻擊（E-G)測試。如實施 例（安全性測試）中所述在普通鯉魚（7個月齡，平均重量3.74 g，η = 20)上測試FL BAC 切除的0RF57 Del 1 galK (Α)和FL BAC切除的0RF57 Del 2 galK⑶毒株的安全性。 FL BAC切除毒株（C)和模擬感染（D)分別用作陽性和陰性對照。根據感染后天數表示存活 鯉魚的百分數，取第0天作為參考。用0RF57單缺失重組體感染后六周（E和F)，如實施例 (接種疫苗/攻擊）中所述攻擊魚。模擬感染的魚用作對照（G)。根據感染后天數表示存 活鯉魚的百分數，取第42天作為參考。
[0104] 圖6 :0RF56單缺失重組體的安全性。
[0105] 如實施例（安全性測試）中所述在普通鯉魚（7個月齡，平均重量3. 74 g，η = 20) 上測試 FL BAC 切除的 0RF56 Del 1 galK (Α)和 FL BAC 切除的 0RF56 Del 2 galK (Β)毒 株的安全性。FL BAC切除毒株（C)和模擬感染（D)分別用作陽性和陰性對照。根據感染后 天數表示存活鯉魚的百分數，取第0天作為參考。
[0106] 圖7 :FL BAC切除的0RF56-57 Del毒株的安全性（Α-C)和接種疫苗/攻擊（D-G) 測試。如實施例（安全性測試）中所述在普通鯉魚（7個月齡，平均重量4.41 g，η = 30) 上測試FL BAC切除的0RF56-57 Del毒株（B)的安全性。FL BAC切除毒株（A)和模擬感 染（C)分別用作陽性和陰性對照。在重復組上進行模擬感染。根據感染后天數表示存活鯉 魚的百分數，取第〇天作為參考。接種疫苗/攻擊（D-G)測試。如實施例（接種疫苗/攻 擊）中所述在接種后3周⑶或6周（F)用KHV FL毒株攻擊用FL BAC切除的0RF56-57 Del毒株接種的魚（η = 15)。重復組的模擬感染的魚用作對照（E和G)。根據感染后天數 表示存活鯉魚的百分數，取攻擊當天作為參考。
[0107] 圖8 :FL BAC回復的0RF56-57 Del毒株的安全性（A-C)和接種疫苗/攻擊（D-G) 測試。如實施例（安全性測試）中所述在普通鯉魚（7個月齡，平均重量3.74 g，n = 30)上 測試FL BAC回復0RF56-57 Del毒株（B)的安全性。FL BAC回復毒株（A)和模擬感染（C) 分別用作陽性和陰性對照。在重復組上進行模擬感染。根據感染后天數表示存活鯉魚的百 分數，取第〇天作為參考。接種疫苗/攻擊（D-G)測試。如實施例（接種疫苗/攻擊）中 所述在接種后3周（D)或6周（F)用KHV FL毒株攻擊用FL BAC回復的0RF56-57 Del毒 株接種的魚（η = 15)。重復組的模擬感染的魚用作對照（E和G)。根據感染后天數表示存 活鯉魚的百分數，取攻擊當天作為參考。 實施例
[0108] a)細胞和病毒。將鯉魚腦細胞（CCB) (Neukirch等人，1999)在含有4.5 g/ 1葡萄糖（D-葡萄糖一水合物，Merck)和10%胎牛血清（FCS)的最小必需培養基（MEM， Invitrogen)中培養。將細胞在25°C、含有5%C02的潮濕氣氛中培養。從由于KHV (CER Marloie，Belgium)死亡的魚的腎中分離所述CyHV-3 FL毒株。
[0109] b) CyHV-3 BAC質粒。CyHV-3 FL BAC質粒用作產生CyHV-3重組體的親本質粒。 該質粒已經廣泛描述于Costes等人（2008)和國際專利申請W0 2009/027412。CyHV-3 FL BAC質粒是CyHV-3 FL毒株基因組的感染性細菌人工染色體（BAC)克隆。在該質粒中，將 側接的BAC盒插入CyHV-3 TK基因座（0RF55)。
[0110] C)使用細菌中的galK陽性篩選生產0RF 57 CyHV-3 FL BAC重組質粒。如前所 述（Warming等人，2005)，在細菌中使用galK陽性選擇產生具有0RF57基因座缺失（參見 圖1中的0RF57 Del 1和0RF57 Del 2)的兩個CyHV-3 FL BAC重組質粒（圖2)。重組片 段由側接于與側接待缺失序列的CyHV-3基因組中的區域同源的50 bp序列的半乳糖激酶 (galK)基因（1231 bp)組成（圖 1)。
[0111] 使用pgalK載體作為模板通過PCR產生這些片段。以下引物用于擴增（對于引物 序列，參見表1):用于產生0RF57 Del 1缺失：引物0RF57 Dell fw和0RF57 Dell rev，導 致 0RF57 Del Ι-galK 擴增子；用于產生 0RF57 Del 2 缺失：引物 0RF57 Del2 fw 和 0RF57 Del2 rev，導致0RF57 Del 2-galK擴增子。純化擴增產物（QIAquick凝膠提取試劑盒）。 接下來，用50 ng上述PCR產物電穿孔含有CyHV-3 FL BAC質粒的電感受態的SW102細胞。 將電穿孔的細胞平鋪在補充20%半乳糖和氯霉素（17 Pg/ml)的固體M63最小培養基，以 篩選其中發生同源重組的細菌。最后，如其它處所述，將獲得的集落劃線在MacConkey指示 板上，以確保galK陽性克隆的產生。擴增并純化重組BAC分子（QIAGEN Large-Construct Kit)，并且使用組合的限制性內切酶-Southern印跡方法、PCR和測序控制它們的分子結 構。
【權利要求】
1. 重組錦鯉皰疹病毒（KHV)，其中開放閱讀框57 (0RF57)是缺陷的，導致產生減毒的 KHV。
2. 根據權利要求1的重組錦鯉皰疹病毒，其特征在于，所述重組錦鯉皰疹病毒在至少 一種額外的基因中是缺陷的，所述基因對毒力有貢獻，但對于復制不是必需的。
3. 根據權利要求2的重組錦鯉皰疹病毒，其特征在于，所述至少一種額外的基因選自 胸苷激酶基因；0RF12 :推定的腫瘤壞死因子（TNF)受體基因；0RF16 :推定的G-蛋白偶聯受 體（GPCR)基因；0RF134 :推定的白介素10同源基因和0RF140 :推定的胸苷酸激酶基因。
4. 根據權利要求1-3中任一項的重組錦鯉皰疹病毒，其特征在于，所述皰疹病毒是活 形式。
5. 根據權利要求1-3中任一項的重組錦鯉皰疹病毒，其特征在于，所述皰疹病毒是非 復制形式。
6. 根據權利要求1-5中任一項的重組錦鯉皰疹病毒，其包含BAC (細菌人工染色體） 載體序列。
7. 根據權利要求6的重組錦鯉皰疹病毒，其特征在于，從所述皰疹病毒基因組中切 除BAC載體序列，從而分別在所述皰疹病毒基因組中的切除位點或先前插入位點留下異源 DNA片段。
8. 根據權利要求1-7中任一項的重組錦鯉皰疹病毒，其特征在于，其進一步包含異源 DNA片段。
9. 根據權利要求8的重組錦鯉皰疹病毒，其特征在于，所述異源基因是編碼引起鯉魚 春季病毒血癥的棒狀病毒的G糖蛋白的基因。
10. 根據權利要求1-9中任一項的重組錦鯉皰疹病毒，其用作用于異源DNA片段的載 體。
11. 細胞，其包含根據權利要求1-10中任一項的重組錦鯉皰疹病毒。
12. 用于產生重組錦鯉皰疹病毒（KHV)的感染性顆粒的方法，其中所述方法包括以下 步驟： (a) 將根據權利要求1-9中任一項的重組KHV或包含根據權利要求1-9中任一項的重 組錦鯉皰疹病毒的基因組的重組KHV DNA引入真核允許細胞中；和 (b) 培養所述細胞以產生重組錦鯉皰疹病毒（KHV)。
13. 根據權利要求1-9中任一項的重組錦鯉皰疹病毒和/或包含根據權利要求1-9中 任一項的重組錦鯉皰疹病毒的基因組的重組KHV DNA，其用于預防和/或治療性處理魚中 的由錦鯉皰疹病毒（KHV)引起的疾病的疫苗中。
14. 用于預防和/或治療性處理魚中的由錦鯉皰疹病毒（KHV)引起的疾病的疫苗，其特 征在于所述疫苗包含根據權利要求1-9中任一項的重組錦鯉皰疹病毒和/或包含根據權利 要求1-9中任一項的重組錦鯉皰疹病毒的基因組的重組KHV DNA，和藥學可接受的載體。
15. 用于預防和/或治療性處理魚中的由引起鯉魚春季病毒血癥的棒狀病毒引起的疾 病的疫苗，其特征在于所述疫苗包含根據權利要求9的重組錦鯉皰疹病毒和/或包含根據 權利要求9的重組錦鯉皰疹病毒的基因組的重組KHV DNA，和藥學可接受的載體。
【文檔編號】A61K39/245GK104159609SQ201280065496
【公開日】2014年11月19日 申請日期:2012年12月20日 優先權日:2011年12月30日
【發明者】A.F.C.范德普拉斯臣 申請人:列日大學