專利名稱:一種鯉春病毒血癥病毒rt-lamp檢測試劑盒及檢測方法
技術領域：
本發明屬于魚類病毒檢測技術領域：
，具體涉及一種鯉春病毒血癥病毒RT-LAMP檢測試劑盒，還涉及一種利用鯉春病毒血癥病毒RT-LAMP檢測試劑盒檢測鯉春病毒血癥病毒的方法。
背景技術：
趣春病毒血癥病毒(Spring viraemia of carp virus, SVCV),屬單分子負鏈RNA病毒目(Mononegavirales),彈狀病毒科(Rhabdoviridae),水泡性口炎病毒屬(Vesiculovirus)的暫定種，目前僅有一個血清型。SVCV引起的鯉春病毒血癥(SpringViraemia of Carp, SVC)是一種急性、出血性并有高度傳染的流行病，嚴重危害漁業生產并能造成毀滅性打擊。世界動物衛生組織(OIE)將其列為必報的重要疫病。2008年我國新頒布的動物疫病名錄中將其列為一類動物疫病，是新中國成立以來第一個也是唯一一個魚類 病毒疫病被列為一類傳染病。
SVC對水產養殖特別是鯉科魚類養殖的危害巨大。由于暫時沒有較好的防治藥物和方法，對該病的防控需要依賴實驗室的診斷，因此建立快速準確的檢測方法至關重要。SVCV檢測的“金標準”是通過細胞培養分離病毒，利用免疫學技術或分子生物學技術進行鑒定，這個過程耗時長，程序復雜。另外制備高效價抗血清困難，也限制了免疫學方法的使用。OIE水生動物疾病診斷手冊、我國關于SVCV檢測的國標和行標，已經將RT-PCR列為診斷方法，但是RT-PCR方法操作起來較復雜，對儀器和人員要求比較高，不適用于現場快速檢測及基層普及應用。
環介導等溫擴增(Loop-mediatedisothermal amplification, LAMP)技術是Notomi等于2000年報道的一種新型等溫核酸擴增方法(國際專利公開號WO 00/28082)，針對靶基因的6個位點設計4條LAMP引物，利用一種具有鏈置換活性的DNA聚合酶(Bst DNA聚合酶)，在恒溫條件下快速、高效、高特異、高靈敏地擴增靶序列，適合于現場和實驗條件較簡單的實驗室進行快捷檢測。逆轉錄環介導恒溫擴增(RT-LAMP)是在反應液中加入一定量的逆轉錄酶，實現RNA的一步擴增。引入一對環狀引物的改進方法，進一步縮短反應時間。
發明內容
本發明的一個目的是在于提供了一種鯉春病毒血癥病毒RT-LAMP檢測試劑盒，根據GenBank公布的SVCV毒株的N基因片段編碼區序列(U18101),應用PrimerExplorer V4(http://primerexplorer. jp/elamp4. O. 0/index, html)在線軟件設計特異性引物，利用RT-LAMP技術擴增靶基因的特定區域，從分子水平對鯉春病毒血癥病毒進行快速檢測，具有簡便、快速、高特異性和靈敏性的特點。
本發明的另一個目的是在于提供了一種利用鯉春病毒血癥病毒RT-LAMP檢測試劑盒檢測鯉春病毒血癥病毒的方法，本方法僅需一個水浴鍋或金屬浴即可在2小時內準確檢測出樣品中的SVCV，能檢測SVCV感染的病魚組織，能檢測SVCV感染的細胞(例如EPC細胞)，非常適用于SVCV的現場快速檢測。
為了實現上述目的，本發明采用以下技術方案
一種鯉春病毒血癥病毒RT-LAMP檢測試劑盒,包括以下成分
該試劑盒包括以下成分10XThermoPolReaction Buffer ；Bst DNA 聚合酶(NEB) ；dNTPs ;AMV 逆轉錄酶(BBI);外引物 F3 和 B3、內引物 FIP 和 BIP,Betaine (Sigma),MgCl2, DTT (Invitrogen),1000XSYBR Green I (Invitrogen)。
F3 5, -GGGATAGCTTCGGACACAAG-3,；
B3 5, -CCATCAGCAAAGTCCGGTAT-3，；
FIP 5, -GTTTCCCATCTGGTAGCCCGTCTTTTAGATCGGGCCTTTTAACCTG-3,；
BIP 5, -AGGTGAGTGCTGAGGATGATGCTTTTTTGCCCTTCCCACTCTGT-3,。
一種利用鯉春病毒血癥病毒RT-LAMP檢測試劑盒檢測鯉春病毒血癥病毒的方法，其步驟是
I、病毒RNA的獲取
采用TRIzof3或TRIzoM) LS試劑或柱吸附洗脫法等提取樣本總RNA。
2、RT-LAMP 擴增
采用25 μ I反應體系，包括內引物FIP和BIP各O. 8μΜ，外引物F3和Β3各O. I μ M，dNTPs ImM, Betaine O. 5M, DTT 4mM, MgCl2 2-10mM, Bst DNA 聚合酶 8U，AMV 逆轉錄酶 5U，模板 RNA5 μ 1，IOXThermoPol Reaction Buffer 2· 5 μ I。選擇 55_65°C的溫度范圍和30 — 120分鐘的時間范圍進行RT-LAMP反應之后，80°C滅活2分鐘。
3、檢測結果判定，可用下述三種方法之一進行結果的判定
I)發生擴增反應時，從dNTPs析出的焦磷酸根離子和反應液中的鎂離子形成白色焦磷酸鎂沉淀，通過肉眼判斷檢測管出現明顯渾濁為陽性，未見渾濁為陰性。
2)每 25 μ I 體系的反應管加 1000XSYBR Green I (Invitrogen) 1-2 μ I, l-5min觀察結果，反應液變綠為陽性，保持橙色為陰性。
3)取擴增產物，用2% (w/v)的瓊脂糖凝膠電泳后，置于凝膠成像系統中成像，電泳圖片顯示LAMP特征性梯狀條帶，則結果為陽性；如無任何條帶，則結果為陰性。
一種利用鯉春病毒血癥病毒RT-LAMP檢測試劑盒檢測鯉春病毒血癥病毒的方法(最佳條件)，其步驟是
I、病毒RNA的獲取
采用TRIzd 或TRIzol LS試劑或柱吸附洗脫法等提取樣本總RNA,模板RNA在950C 5分鐘后迅速置于冰浴中的預處理可以增加檢測的靈敏度。
2、RT-LAMP 擴增
采用25 μ I反應體系，包括內引物FIP和BIP各O. 8μΜ，外引物F3和Β3各O. I μ M，dNTPs ImM, Betaine O. 5M, DTT 4mM, MgCl2 8mM, Bst DNA 聚合酶 8U，AMV 逆轉錄酶5U，模板 RNA 5 μ I, IOXThermoPol Reaction Buffer 2.5 μ I。反應管于 64°C溫育 60 分鐘進行RT-LAMP反應之后，80°C滅活2分鐘。
3、檢測結果判定，可用下述三種方法之一進行結果的判定
I)發生擴增反應時，從dNTPs析出的焦磷酸根離子和反應液中的鎂離子形成白色焦磷酸鎂沉淀，通過肉眼判斷檢測管出現明顯渾濁為陽性，未見渾濁為陰性。
2)每 25 μ I 體系的反應管加 1000XSYBR Green I (Invitrogen) 1-2 μ l，l_5min觀察結果，反應液變綠為陽性，保持橙色為陰性。
3)取擴增產物，用2% (w/v,以下相同)的瓊脂糖凝膠電泳后，置于凝膠成像系統中成像，電泳圖片顯示LAMP特征性梯狀條帶，則結果為陽性；如無任何條帶，則結果為陰性。
與現有技術相比，本發明具有以下優點
I、本發明公開了一種鯉春病毒血癥病毒RT-LAMP檢測試劑盒；
2、特異性好，能有效檢測出SVCV病毒；3、快速高效，檢測時間約I小時，非常適用于SVCV的現場快速檢測；
4、不需要特殊試劑與設備，檢測成本低；
5、鑒定簡單，通過從dNTPs析出的焦磷酸根離子和反應液中的鎂離子形成白色焦磷酸鎂沉淀，經肉眼就可判斷結果，通過加入1000XSYBR Green I,可提高結果的靈敏度。
圖I為一種鯉春病毒血癥病毒RT-LAMP試劑盒檢測結果的特異性的示意圖。
從左至右的泳道依次為水的空白對照、正常EPC細胞總RNA、CRV感染CCO細胞的總 RNA、GCRV-104 株感染 CIK 細胞的總 RNA、SVCV 感染 EPC 細胞的總 RNA、DL2, OOOMarker。
具體實施方式
下列實例進一步說明本發明，但不應該當做對本發明的限制。若無特別說明，本發明所用試劑均為上海生工生物工程公司生產。
實施例I :
一種鯉春病毒血癥病毒RT-LAMP檢測試劑盒,包括以下成分
該試劑盒它包括以下成分10XThermoPol Reaction Buffer ；Bst DNA聚合酶(NEB) ；dNTPs ;AMV 逆轉錄酶(BBI);外引物 F3 和 B3、內引物 FIP 和 BIP,Betaine (Sigma),MgCl2, DTT (Invitrogen),1000XSYBR Green I (Invitrogen)。
F3 5, -GGGATAGCTTCGGACACAAG-3,
B3 5, -CCATCAGCAAAGTCCGGTAT-3,
FIP 5, -GTTTCCCATCTGGTAGCCCGTCTTTTAGATCGGGCCTTTTAACCTG-3,
BIP 5, -AGGTGAGTGCTGAGGATGATGCTTTTTTGCCCTTCCCACTCTGT-3,。
實施例2
鯉春病毒血癥病毒RT-LAMP檢測試劑盒不同濃度的Mg2+的優化
一、取待檢樣品提取病毒RNA:
培養鯉上皮乳頭瘤細胞(EPC細胞)至匯合單層，吸出培養液，以感染復數為O. I的劑量，接種ImL經4000r/min離心5min除去細胞碎片的鯉春病毒血癥病毒(張朋，劉葒，陳孝煊，等.鯉春病毒血癥病毒單克隆抗體的制備及其特性鑒定[J]，中國預防獸醫學報，2011,33(4):305-308.)細胞毒材料，添加 10 μ L 的 Polybrene(終濃度 10 μ g/ml )，置于 26°C培養箱中吸附lh，使病毒吸附細胞，吸附過程中每20min輕輕晃動培養瓶一次，使病毒液與細胞單層充分均勻接觸，吸附Ih后，吸棄病毒液，加入5mL 2%胎牛血清(V/V)的培養液，置26 V培養，直至細胞出現明顯的致細胞病變效應，收集細胞病變材料，于-80°C至室溫(20-25°C )反復凍融 3 次，5000r/min 離心 30min,取上清 250 μ 1，用TRlzoi8 LS( Invitrogen)試劑按照說明書提取RNA，最后溶于50 μ I滅菌水，_80°C保存備用。
二、RT-LAMP擴增的反應體系
采用25 μ I反應體系，包括內引物FIP和BIP各O. 8μΜ，外引物F3和Β3各O. I μ M，dNTPs ImM, Be taine O. 5M, DTT 4mM, MgCl2, Bst DNA 聚合酶 8U，AMV 逆轉錄酶 5U，模板 RNA5 μ I, IOXThermoPol Reaction Buffer 2·5μ1。
其中Mg2+的濃度分別為2、4、6、8和10mM。
三、RT-LAMP擴增的反應條件
反應管于64°C溫育60分鐘后，80°C滅活2分鐘。
四、檢測結果判定
取8 μ I擴增產物，用2%的瓊脂糖凝膠電泳后，置于凝膠成像系統中成像，電泳圖片顯示Mg2+的濃度為8mM時結果最好。
實施例3
鯉春病毒血癥病毒RT-LAMP檢測方法反應溫度的優化
—、取待檢樣品提取病毒RNA:
待SVCV感染的EPC細胞出現90%病變后收獲(制備方法同實施例2)，于_80°C至室溫反復凍融3次，5000r/min離心30min,取上清250 μ 1，用TRlzd LS試劑按照說明書提取RNA，最后溶于50 μ I滅菌水，_80°C保存備用。
二、RT-LAMP擴增的反應體系
采用25 μ I反應體系，包括:內引物FIP和BIP各O. 8μΜ，外引物F3和Β30. I μ Μ，dNTPs ImM, Betaine O. 5M, DTT 4mM, MgCl2 8mM, Bst DNA 聚合酶 8U，AMV 逆轉錄酶 5U，模板RNA 5 μ 1,10XThermoPol Reaction Buffer 2.5 μ I。
三、RT-LAMP擴增的反應條件
反應管分別置于60、61、62、63、64、65°C溫育60分鐘后，80°C滅活2分鐘。
四、檢測結果判定
取8 μ I擴增產物，用2%的瓊脂糖凝膠電泳后，置于凝膠成像系統中成像，電泳圖片顯示64°C時結果最好。
實施例4
鯉春病毒血癥病毒RT-LAMP檢測方法的特異性
一、取待檢樣品提取病毒RNA:
SVCV (張朋，劉葒，陳孝煊，等.鯉春病毒血癥病毒單克隆抗體的制備及其特性鑒定[J]，中國預防獸醫學報，2011，33 (4) :305-308.)感染的EPC細胞、CRV (曾令兵、徐進、李艷秋，等.斑點叉尾鮰出血病病原呼腸孤病毒的分尚與鑒定[J]，病毒學報，2009, 25
(6)=460-466.)感染的 CCO 細胞、GCRV-104 株(CCTCC N0:V201217)感染的 CIK 細胞出現90%病變后收獲(上述病毒的制備方法同SVCV)，于-80°C至室溫反復凍融3次，5000r/min離心30min，取上清250μ 1，用TRfed LS試劑按照說明書提取RNA，最后溶于50 μ I滅菌水，-80°C保存備用。
二、RT-LAMP擴增的反應體系[0074]采用25 μ I反應體系，包括:內引物FIP和BIP各O. 8μΜ，外引物F3和Β30. I μ Μ，dNTPs ImM, Betaine O. 5M,DTT 4mM,MgCl28mM,Bst DNA 聚合酶 8U，AMV 逆轉錄酶 5U，模板 RNA
5μ 1,10XThermoPol Reaction Buffer 2.5 μ I。
三、RT-LAMP擴增的反應條件
反應管于64°C溫育60分鐘后，80°C滅活2分鐘。
四、檢測結果判定
取8 μ I擴增產物，用2%的瓊脂糖凝膠電泳后，置于凝膠成像系統中成像，電泳圖 片顯示針對SVCV設計的特異RT-LAMP引物組能保證對SVCV的特異性檢測，只檢測出SVCV，而GCRV-104、CRV和對照均無法檢出(圖I)。
權利要求
1.一種鯉春病毒血癥病毒RT-LAMP檢測試劑盒，其特征在于，包括以下成分 該試劑盒包括以下成分10 X ThermoPol Reaction緩沖液;ifei DNA聚合酶；dNTPs ;AMV逆轉錄酶；外引物 F3 和 B3、內引物 FIP 和 BIP、Betaine，MgCl2，DTT, 1000X SYBR GreenI；
F3 :5’_ GGGATAGCTTCGGACACAAGB3 :5’_ CCATCAGCAAAGTCCGGTAT -3’ ；
FIP :5’_ GTTTCCCATCTGGTAGCCCGTCTTTTAGATCGGGCCTTTTAACCTGBIP :5’_ AGGTGAGTGCTGAGGATGATGCTTTTTTGCCCTTCCCACTCTGT- 3’。
2.利用權利要求
I所述的一種鯉春病毒血癥病毒RT-LAMP檢測試劑盒檢測鯉春病毒血癥病毒的方法，其步驟是 1)、病毒RNA的獲取 采用TRIzof或TRIzofLS試劑或柱吸附洗脫法提取樣本總RNA ； 2)、RT-LAMP擴增 采用25μ I反應體系內引物FIP和BIP各O. 8 μ Μ，外引物F3和Β3各O. I μ Μ，dNTPsImM, BetaineO. 5M, DTT4mM, MgCl2 2-10mM, Bst DNA 聚合酶 8U, AMV 逆轉錄酶 5U，模板 RNA5y 1，IOXThermoPol Reaction Buffer 2. 5 μ 1，選擇 55-65°C 和 30-120 分鐘進行RT-LAMP反應之后，80°C滅活2分鐘； 3)、檢測結果判定，采用下述三種方式之一 A、發生擴增反應時，從dNTPs析出的焦磷酸根離子和反應液中的鎂離子形成白色焦磷酸鎂沉淀，通過肉眼判斷檢測管出現明顯渾濁為陽性，未見渾濁為陰性； B、每25μ I體系的反應管加1000X SYBR Green I 1-2 μ 1,1-5 min觀察結果，反應液變綠為陽性，保持橙色為陰性； C、取擴增產物，用2%w/v的瓊脂糖凝膠電泳后，置于凝膠成像系統中成像，電泳圖片顯示LAMP特征性梯狀條帶，則結果為陽性；如無任何條帶，則結果為陰性。
3.根據權利要求
2所述的一種鯉春病毒血癥病毒RT-LAMP檢測試劑盒檢測鯉春病毒血癥病毒的方法，，其特征在于=MgCl2的濃度為8mM。
4.根據權利要求
2所述的一種鯉春病毒血癥病毒RT-LAMP檢測試劑盒檢測鯉春病毒血癥病毒的方法，，其特征在于:反應溫度為64V。
5.根據權利要求
2所述的一種鯉春病毒血癥病毒RT-LAMP檢測試劑盒檢測鯉春病毒血癥病毒的方法，，其特征在于模板RNA在95°C 5分鐘后置于冰浴中進行預處理。
專利摘要
本發明公開了一種鯉春病毒血癥病毒RT-LAMP檢測試劑盒及檢測方法，一種鯉春病毒血癥病毒RT-LAMP檢測試劑盒,包括以下成分10×ThermoPolReaction緩沖液；BstDNA聚合酶；dNTPs；AMV逆轉錄酶；外引物F3和B3、內引物FIP和BIP、Betaine，MgCl2，DTT,1000×SYBRGreenI。本發明具有簡便、快速、高特異性和靈敏性的特點，僅需一個水浴鍋或金屬浴即可在2小時內準確檢測出樣品中的SVCV，能檢測SVCV感染的病魚組織，能檢測SVCV感染的細胞，非常適用于SVCV的現場快速檢測。
文檔編號C12Q1/68GKCN102876811SQ201210403053
公開日2013年1月16日 申請日期2012年10月19日
發明者張輝, 曾令兵, 周勇, 范玉頂, 徐進 申請人:中國水產科學研究院長江水產研究所導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan