TM9SF1蛋白的應用和重組TM9SF1慢病毒表達載體及其構建方法與流程

本發明涉及生物技術領域，具體而言，涉及tm9sf1蛋白的應用和重組tm9sf1慢病毒表達載體及其構建方法。

背景技術：

九次跨膜超家族蛋白(transmembrane9superfamilyprotein,tm9sf,又稱nonaspanins蛋白)結構上均含有一個大的非胞質區和9個跨膜區，在進化過程中高度保守。該家族蛋白在細菌、酵母、果蠅、哺乳動物等多個物種均有表達，與細胞免疫、細胞粘附、自噬、腫瘤侵襲和預后等多種生物功能密切相關，迄今為止尚未發現該家族成員在內質網應激方面功能的研究報道。

九次跨膜超家族蛋白1(transmembrane9superfamilyproteinmember1，tm9sf1)別稱mp70，屬于九次跨膜超家族成員之一，于1997年被初次克隆，在人體組織(尤其是肺、腎和胰腺表達水平較高)和多種細胞系廣譜表達，人類tm9sf1蛋白與相應酵母蛋白具有大約30％的同源性，提示其可能與某些古老而重要的生物功能有關。現階段關于tm9sf1的研究多數集中在表達方面：根據schlegel等報道，在對6-羥基多巴胺耐受和敏感的pc12細胞株中tm9sf1展現出表達差異性，相關機制和生理意義尚無研究；wang等通過蛋白質組學方法發現tm9sf1在破裂的顱內動脈瘤血管壁高表達，隨后在組織學方面進行驗證，推測tm9sfl持續高表達參與顱內動脈瘤形成和破裂過程相關的炎性和血管壁蛋白質降解過程。he等通過高通量篩選發現tm9sf1可以誘導宮頸癌細胞系hela細胞發生自噬現象，然而并未揭示其相關分子機制。而目前關于tm9sf1蛋白在其他細胞或組織內的功能研究尚未見諸報道。

鑒于此，特提出本發明

技術實現要素：

本發明的目的在于提供tm9sf1蛋白的在抑制細胞生長、引起細胞發生自噬、誘導細胞發生內質網應激等方面的應用。

本發明的另一目的在于提供一種重組tm9sf1慢病毒表達載體。

本發明的另一目的在于提供上述重組tm9sf1慢病毒表達載體的構建方法。

本發明的另一目的在于提供一種tm9sf1病毒的制備方法。

本發明的另一目的在于提供由上述制備方法得到tm9sf1病毒。

本發明的另一目的在于提供一種慢病毒表達系統。

本發明是這樣實現的：

tm9sf1蛋白在制備用于抑制細胞生長的抑制劑中的應用。

tm9sf1蛋白在制備用于誘導細胞發生自噬的誘導劑中的應用。

tm9sf1蛋白制備用于誘導細胞發生內質網應激的誘導劑中的應用。

一種重組tm9sf1慢病毒表達載體，其由用于編碼tm9sf1蛋白的核苷酸片段插入至plvx-ires載體上得到。

上述的重組tm9sf1慢病毒表達載體的構建方法，其包括：

用seqidno.1-2所示的引物進行pcr擴增得到用于編碼tm9sf1蛋白的核苷酸片段；

用限制性內切酶speⅰ和bamhⅰ分別對所述核苷酸片段和plvx-ires載體進行雙酶切；

將雙酶切后的所述核苷酸片段和所述plvx-ires載體進行連接。

一種tm9sf1病毒的制備方法，其包括：用慢病毒包裝質粒pspax2和pmd2g對權利要求4所述的重組tm9sf1慢病毒表達載體進行包裝，轉染293t細胞后，得到tm9sf1病毒。

上述的tm9sf1病毒的制備方法得到的tm9sf1病毒。

一種慢病毒表達系統，其包括上述的重組tm9sf1慢病毒表達載體和慢病毒包裝質粒。

本發明的有益效果包括：

本發明的研究結果顯示，tm9sf1蛋白作為九次跨膜超家族成員之一具有抑制細胞生長甚至引起細胞死亡的作用，且研究結果還顯示tm9sf1蛋白引起細胞發生自噬和引起細胞發生內質網應激的作用。基于此，本發明提供的tm9sf1蛋白在制備用于抑制細胞生長的抑制劑、用于誘導細胞發生自噬的誘導劑以及用于誘導細胞發生內質網應激的誘導劑等領域中的應用，豐富了對九次跨膜超家族蛋白的認識，擴展了對tm9sf1的功能性研究，補充了tm9sf1蛋白在細胞或組織內的功能研究空白。

附圖說明

為了更清楚地說明本發明實施例的技術方案，下面將對實施例中所需要使用的附圖作簡單地介紹，應當理解，以下附圖僅示出了本發明的某些實施例，因此不應被看作是對范圍的限定，對于本領域普通技術人員來講，在不付出創造性勞動的前提下，還可以根據這些附圖獲得其他相關的附圖。

圖1為本發明實施例1提供的重組tm9sf1慢病毒表達載體上的tm9sf1基因的部分測序結果；

圖2為本發明實施例3提供的重組tm9sf1慢病毒表達載體表達tm9sf1蛋白的western印跡檢測結果和免疫熒光檢測結果；

圖3為本發明實施例4提供的過表達tm9sf1蛋白對293t細胞形態和生長的影響結果；

圖4為本發明實施例4提供的過表達tm9sf1蛋白引起293t細胞發生自噬和內質網應激的檢測結果。

具體實施方式

為使本發明實施例的目的、技術方案和優點更加清楚，下面將對本發明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述。實施例中未注明具體條件者，按照常規條件或制造商建議的條件進行。所用試劑或儀器未注明生產廠商者，均為可以通過市售購買獲得的常規產品。

下面對本發明實施例的tm9sf1蛋白的應用和重組tm9sf1慢病毒表達載體及其構建方法進行具體說明。

tm9sf1蛋白在進化過程中高度保守，在人體組織和多種細胞系廣泛表達。目前關于該蛋白質的功能研究十分有限和初步。本發明采用慢病毒介導的tm9sf1表達系統，研究了重組tm9sf1蛋白的生化特點及其對細胞生長的調控作用。慢病毒感染的293t全細胞裂解液的蛋白質免疫印跡結果揭示，tm9sf1蛋白具有表觀分子質量約為70kd的單體及寡聚體兩種主要形式；在室溫及加熱37℃時蛋白質相對穩定，隨變性溫度升高(56℃以上)逐漸失去其穩定性。cck8法顯示，與慢病毒空載體感染的293t細胞比較，tm9sf1慢病毒表達載體感染的293t細胞在感染2d后增殖明顯減緩(p<0.001)。western印跡實驗證明，過表達tm9sf1引起lc3ⅱ表達明顯上調，lc3ⅱ/lc3ⅰ比例升高，說明tm9sf1可引起293t細胞發生自噬。熒光實時定量pcr結果顯示，過表達tm9sf1的293t細胞內質網應激標志分子chop、gadd34和xbp1(s)表達水平是對照細胞的3～4倍，提示發生了內質網應激反應。以上結果提示，tm9sf1具有抑制293t細胞生長的功能，該功能可能與其引起的內質網應激和自噬有關，本發明的研究結果利于進一步加深對tm9sf1在細胞生長調控中的功能的認識。

基于上述發現，容易理解到，對于本領域技術人員來說，細胞外添加tm9sf1也具有引起細胞發生自噬、產生內質網應激以及抑制細胞生長的效果。

基于此，一方面，本發明提供了tm9sf1蛋白在制備用于抑制細胞生長的抑制劑中的應用。

另一方面，本發明提供了tm9sf1蛋白在制備用于誘導細胞發生自噬的誘導劑中的應用。

另一方面，本發明提供了tm9sf1蛋白制備用于誘導細胞發生內質網應激的誘導劑中的應用。

進一步地，上述細胞為293t細胞。

為研究tm9sf1在細胞環境中的潛在生物功能，本發明研建立了tm9sf1慢病毒過表達系統，并首次發現該蛋白質的理化特性和在293t細胞中特有的生物功能。即在293t細胞過表達tm9sf1蛋白，可引起細胞發生內質網應激、誘導細胞發生自噬以及抑制細胞生長的功能。

另一方面，本發明還提供了一種重組tm9sf1慢病毒表達載體，其由用于編碼tm9sf1蛋白的核苷酸片段插入至plvx-ires載體上得到。

另一方面，本發明提供了上述重組tm9sf1慢病毒表達載體的構建方法，其包括：用seqidno.1-2所示的引物進行pcr擴增得到用于編碼tm9sf1蛋白的核苷酸片段；

用限制性內切酶speⅰ和bamhⅰ分別對上述核苷酸片段和plvx-ires載體進行雙酶切；

將雙酶切后的上述核苷酸片段和上述plvx-ires載體進行連接。

另一方面，本發明還提供了tm9sf1病毒的制備方法，其包括：用慢病毒包裝質粒pspax2和pmd2g對上述的重組tm9sf1慢病毒表達載體進行包裝，轉染293t細胞后，得到tm9sf1病毒。

可選地，在本發明的一些實施方案中，上述重組tm9sf1慢病毒表達載體、上述pspax2和上述pmd2g的質量比為(2.8-3.2):(1.8-2.2):(0.8-1.2)。

優選地，在本發明的一些實施方案中，上述重組tm9sf1慢病毒表達載體、上述pspax2和上述pmd2g的質量比為3:2:1。

另一方面，本發明還提供了由上述tm9sf1病毒的制備方法所得到的tm9sf1病毒。

另一方面，本發明提供了一種慢病毒表達系統，其包括上述的重組tm9sf1慢病毒表達載體和慢病毒包裝質粒。

可選地，在本發明的一些實施方案中，上述慢病毒包裝質粒包括pspax2和pmd2g質粒中一種或兩種的組合。

本發明提供的重組tm9sf1慢病毒表達載體和慢病毒表達系統大大提高了轉染效率，并在蛋白水平驗證了tm9sf1蛋白的表達情況，為后續的功能和分子機制研究提供了有力的技術支撐。

綜上，本發明提供的tm9sf1蛋白在制備用于抑制細胞生長的抑制劑、用于誘導細胞發生自噬的誘導劑以及用于誘導細胞發生內質網應激的誘導劑等領域中的應用，豐富了對九次跨膜超家族蛋白的認識，擴展了對tm9sf1的功能性研究，補充了tm9sf1蛋白在細胞或組織內的功能研究空白。

以下結合實施例對本發明的特征和性能作進一步的詳細描述。

慢病毒表達系統由plvx-ires-puro、pspax2和pmd2g三種質粒構成，購買自吉凱基因公司；限制性內切酶spei和bamhi、t4dna連接酶、堿性磷酸酶由neb公司生產；2xcobuddymastermix(含超高保真dna聚合酶)、瓊脂糖凝膠回收試劑盒、感受態細菌、質粒小提和大提試劑盒購買自康為世紀有限公司；hek293細胞和293t細胞購買自atcc(美國標準生物品收藏中心)；dmem培養基和胰酶來自gibco公司；胎牛血清(fbs)由sciencell公司生產；轉染試劑vigofect購買自維格拉斯公司；trizol試劑由invitrogen公司生產，逆轉錄試劑盒購買自thermoscientific公司；tm9sf1和gapdh抗體由abclonal公司生產，lc3抗體、羊抗兔二抗和羊抗鼠二抗為abcam公司生產。

實施例1

重組tm9sf1慢病毒過表達載體的構建1.1經ncbi數據庫檢索，獲取tm9sf1基因mrna的編碼區序列，堿基序列如seqidno.1所示，其編碼的tm9sf1蛋白的氨基酸序列如seqidno.4所示。

1.2由primerpremier軟件設計出擴增tm9sf1編碼區全長的引物，上下游引物序列分別為：

f：5′-gactagtatgacagtcgtagggaaccct-3′(下劃線為spei酶切位點，seqidno.1)和r：5′-cgggatcctcagtccatcttgaggttaacatag-3′(下劃線為bamhi酶切位點，seqidno.2)。

1.3提取hek293細胞總rna，逆轉錄獲得cdna文庫。

1.4以cdna為模板，利用上下游引物f和r以及高保真cobuddymastermix進行pcr擴增。

pcr擴增體系：2×cobuddymastermix25μl、引物f和r各0.5μl、cdna模板2.5μl、去離子水21.5μl。

pcr擴增程序：首先98℃預變性1min；然后98℃10s、58℃20s、72℃1min，32cycles；最后延伸10min。

1.5利用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收的pcr產物與plvx-ires-puro質粒同時分別進行speⅰ和bamhⅰ雙酶切，37℃孵育1h。、

1.6切膠回收的雙酶切pcr片段與質粒片段按照5∶1的比例通過t4dna連接酶進行連接反應，連接產物轉化dh5α感受態細菌。

1.7待長出單菌落后，隨機挑單克隆10個，37℃搖床孵育8h進行擴增。用小提試劑盒提取質粒，瓊脂糖凝膠電泳挑選比空載體大的克隆送往擎科公司測序，最后挑選1個經測序證明插入片段完全正確的克隆進行大量擴增和質粒提取，該質粒為重組tm9sf1慢病毒過表達載體，記為plvx-ires-tm9sf1。

測序的鑒定結果如圖1所示(圖中：(a)為plvx-ires-tm9sf1載體插入序列測序峰圖(部分)。(b)為plvx-ires-tm9sf1載體插入序列與ncbi數據庫公布的標準序列比對結果(部分))，峰圖清晰銳利(圖1-a)，所插入片段與ncbi數據庫中的tm9sf1cds序列一致性為100％(圖1-b)，說明載體構建成功。

實施例2

tm9sf1慢病毒的包裝

2.1293t細胞于高糖dmem培養基(含10％胎牛血清)中培養。待細胞匯合度至40％～60％之間時，轉染病毒質粒。

2.2取5μg質粒dna(plvx-ires-tm9sf1∶pspax2∶pmd2g＝3∶2∶1)加入pbs稀釋液中至總體積為100μl，輕輕混勻。

2.3取vigofect2μl加入pbs稀釋液中至總體積為100μl，輕輕混勻，室溫放置5min。

2.4將稀釋的vigofect逐滴加入稀釋的dna溶液中，輕輕混勻，所得的轉染工作液室溫放置15min。

2.5將轉染工作液逐滴加入培養基(步驟2.1中的培養有293t細胞的dmem培養基)中，輕輕混勻，置于37℃，5％co2孵箱中培養。轉染后6h換液，48～72h之間收獲上清，2000r/min離心10min去掉細胞碎片，即為含tm9sf1慢病毒的病毒液。

2.6空載體系統慢病毒制備同上。

實施例3

重組tm9sf1慢病毒表達鑒定以及蛋白特性分析

3.1待293t細胞密度達到50％左右時，進行病毒感染，感染液成分包含兩份完全培養基和一份病毒液，另加感染促進劑polybrene至終濃度為10μg/ml。

3.2感染后24h換液，48h觀察細胞形態，收集細胞進行western印跡表達鑒定。

3.3用含蛋白酶抑制劑cocktail的ripa裂解液裂解細胞獲取總蛋白質，bca定量試劑盒檢測蛋白濃度，取50μg總蛋白質進行sds-page電泳。

3.4電泳結束后將蛋白質轉印至硝酸纖維素(nc)膜上，用含5％脫脂牛奶的tbst室溫封閉2h，之后用兔抗tm9sf1抗體(1∶1000)4℃搖床孵育過夜。

3.5tbst充分洗滌nc膜后用alexa790標記的羊抗兔二抗(1∶10000)室溫孵育1h，再次洗滌后用鼠抗gapdh抗體(1∶3000)與alexa680標記的羊抗鼠二抗(1∶10000)混合液室溫孵育1h。

3.6洗滌后用odyssey紅外成像系統掃描。

3.7免疫熒光：細胞爬片感染慢病毒后48h，用4％多聚甲醛固定30min，0.5％tritonx-100打孔30min，山羊血清封閉1h，兔抗tm9sf1(1∶200)4℃孵育過夜。充分洗滌爬片后用alexafluor488標記的羊抗兔二抗(1∶500)室溫孵育40min。充分洗滌后，激光共聚焦掃描顯微鏡(confocal)拍照。

結果如圖2所示(圖中：(a)為western免疫印跡技術檢測全細胞裂解液中的tm9sf1蛋白。ripa制備全細胞裂解液，加入上樣緩沖液后于不同溫度條件下孵育(如圖所示)，總蛋白通過sds-page分離并轉印至nc膜，然后與抗tm9sf1抗體進行雜交，gapdh作為內參提示上樣量的一致性。nc：陰性對照；rt：室溫。(b)為免疫熒光技術鑒定tm9sf1在293t細胞中的表達。細胞與tm9sf1特異性一抗雜交后，再與alexafluor488標記的熒光二抗(綠色)進行孵育。dapi(藍色)特異性染核。同型抗體組作為陰性對照。紅色箭頭指示tm9sf1過表達陽性細胞。比例尺＝20μm。)，通過tm9sf1特異性抗體雜交，在預定分子質量位置(70kd)有特異性差異帶(圖2-a)，說明重組慢病毒成功過表達。有意思的是除了在預定信號位置有特異性條帶外，還有相當一部分蛋白質滯留在免疫印跡膜上分子質量大于170kd以上的位置，推測是形成蛋白質寡聚體(圖2-a)。通過不同溫度下變性處理，發現37℃生理溫度下變性后，tm9sf1蛋白寡聚體形成量最少，即無論是室溫(rt)還是隨著溫度不斷升高(56℃，75℃，98℃)條件下變性蛋白質寡聚體形成比例均高于37℃生理溫度下的形成量。另外，在超過37℃變性時該蛋白質單體和寡聚體含量均隨著溫度升高逐漸減少，說明在37℃以上其穩定性隨溫度升高而逐漸降低(圖2-a)。

免疫熒光實驗結果顯示(圖2-b)，tm9sf1慢病毒過表達的293t細胞特異性抗體染色陽性(箭頭所示)，而同型對照組無明顯染色，說明tm9sf1慢病毒成功過表達，且該蛋白質主要表達于細胞質，既有彌散性亦有聚集性表達。

實施例4

tm9sf1過表達抑制293t細胞生長

cck8細胞增殖實驗：tm9sf1慢病毒感染293t細胞24h后，消化細胞，計數，鋪到96孔板中，每孔2000個細胞，每組3個復孔，當天記為第0天。待細胞貼壁后加cck8，4h后酶標儀檢測450nm吸光度a450，每天檢測一次，連續檢測至第4d。結果如圖3所示。

圖3的結果顯示(圖中：(a)293t細胞形態學改變。細胞感染plvx-ires-tm9sf1慢病毒后48h，相差顯微鏡下拍照。比例尺＝200μm。nc:陰性對照組細胞；tm9sf1：過表達組293t細胞。(b)為cck8實驗檢測細胞生長的結果。plvx-ires-tm9sf1慢病毒感染后24h，細胞被消化，鋪到96孔板中，進行cck8實驗檢測0-4天內的生長情況。數據以均值±標準差表示(n＝3)。***表示p<0.001。)，發現感染后48h過表達組293t細胞較陰性對照組生長受到明顯抑制，甚至發生了死亡，而陰性對照組生長狀態良好。相差顯微鏡下觀察，過表達組較陰性對照組細胞密度降低，細胞碎片明顯增多，陰性對照組細胞形態飽滿，匯合度接近飽和(圖3-a)。cck8增殖實驗結果顯示，隨著時間延長，過表達組較陰性對照組細胞生長曲線受到一定程度的抑制(圖3-b)。由此表明，tm9sf1蛋白具有抑制細胞生長的作用。

實施例5

tm9sf1過表達引起293t細胞自噬和內質網應激反應

5.1利用western印跡檢測自噬最常用的指標lc3，結果發現lc3ii表達明顯增多，lc3ii/lc3i比例明顯升高(如圖4-a所示)，說明tm9sf1可以引起293t細胞發生自噬。

5.2利用實時熒光定量pcr技術檢測一系列內質網應激的標志分子，具體操作如下：

5.2.1慢病毒感染293t細胞48h后，trizol裂解細胞，提取總rna，取3μg逆轉錄得cdna，用sbrygreen染料法實時定量pcr檢測相關基因的表達水平。

5.2.2擴增條件為：95℃10min，95℃15s，60℃1min，40個循環。各基因的表達量用內參基因gapdh進行校正。利用熒光定量pcr溶解曲線確定引物的特異性。

相關基因的熒光定量pcr引物的上下游引物的序列見表1如下：

表1

結果圖如4所示(圖中：(a)為western免疫印跡檢測自噬標志分子lc3ii表達水平。gapdh作為上樣內參。右圖為左圖的灰度分析結果。(b)為實時定量pcr技術檢測內質網應激標志分子chop,gadd34和xbp1(s)的表達水平。(c)為實時定量pcr技術檢測增殖相關基因bcl-2,bcl-xl和cyclind1。gapdh作為定量pcr內參，陰性對照組(puro)被標準化為1。數據以均值±標準差表示(n＝3)。***表示p<0.001。)，結果顯示chop、gadd34和xbp1(s)表達水平是陰性對照組的3～4倍(圖4-b)，提示發生了內質網應激反應。細胞增殖相關基因bcl-2、bcl-xl和cyclind1則無明顯變化(圖4-c)。

綜上，九次跨膜超家族蛋白(tm9sf)進化保守、表達譜廣，盡管目前關于該家族蛋白的功能性研究比較有限，但根據目前已知研究成果，其成員涉及的生物功能非常重要。為了進一步探索該基因潛在生物功能，本研究首先建立了重組tm9sf1慢病毒過表達系統，大大提高了轉染效率，并在蛋白水平驗證了其表達情況(圖2)，為后續的功能和分子機制研究提供了有力的技術支撐。本發明首次發現tm9sf1蛋白作為九次跨膜超家族成員之一具有抑制293t細胞生長甚至引起細胞死亡的作用(圖3)。由于自噬是細胞在應激時的一種防御反應，其結局可能是使細胞度過暫時難關而恢復正常狀態，當應激過強或持續時間過久也可能導致細胞走向死亡。

利用western印跡技術檢測了研究自噬最常用的指標lc3,發現lc3ⅱ表達明顯增多，提示tm9sf1同樣可以引起293t細胞發生自噬(圖4-a)，這可能是其引起細胞生長抑制的原因之一。

為了探索內質網應激在tm9sf1抑制293t細胞生長過程中的作用，利用定量pcr技術檢測了內質網應激相關分子，發現chop、gadd34和xbp1(s)表達水平較陰性對照組明顯升高(圖4-b)，說明的確發生了內質網應激。bcl-2和bcl-xl是bcl-2家族重要的抗凋亡成員，對細胞的存活和增殖發揮著重要作用。細胞周期相關蛋白控制著細胞周期進程，對細胞生長起到重要調節作用。本發明檢測了與細胞增殖相關的幾個重要基因bcl-2、bcl-xl和cyclind1，結果無顯著變化(圖4-c)，說明在該過程中相關分子無轉錄水平的調節或者并未發揮作用。因此，根據本發明結果，又充足的理由推測是tm9sf1導致293t細胞發生了內質網應激，進而引起自噬，最終導致細胞生長抑制甚至死亡。

總之，本發明通過所構建的慢病毒過表達系統對tm9sf1進行了初步的功能性探究，發現其具有抑制293t細胞生長的作用，該作用可能與其導致的內質網應激和自噬有關。該結果豐富了對九次跨膜超家族蛋白的認識，擴展了對tm9sf1的功能性研究。

以上所述僅為本發明的優選實施例而已，并不用于限制本發明，對于本領域的技術人員來說，本發明可以有各種更改和變化。凡在本發明的精神和原則之內，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發明的保護范圍之內。

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<110>湖北文理學院

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