一種抗腫瘤的增效藥物的制作方法

一種抗腫瘤的增效藥物的制作方法
【專利摘要】本發明涉及抗腫瘤藥物，具體涉及一種抗腫瘤的增效藥物，該增效藥物由一種或多種細胞自噬抑制劑和重組人精氨酸酶組成藥物復合物；該增效藥物的一種或者幾種自噬抑制劑與重組人精氨酸酶，通過使用聯合給藥或是序貫給藥的方式，通過抑制精氨酸酶誘導的腫瘤細胞的細胞自噬而抵消腫瘤由于細胞自噬而引起的對精氨酸酶治療的拮抗作用，從而增強重組人精氨酸酶對腫瘤的殺傷作用，顯著增強精氨酸酶對腫瘤的治療效果。該增效藥物可用于治療淋巴瘤、白血病、肝癌、肺癌、黑色素瘤、乳腺癌和骨髓瘤。
【專利說明】一種抗腫瘤的增效藥物
【技術領域】
[0001]本發明涉及抗腫瘤藥物，具體涉及一種抗腫瘤的增效藥物，尤其涉及一種由自噬抑制劑和重組人精氨酸酶組成的藥物復合物。
【背景技術】
[0002]現有技術公開了目前用于腫瘤治療的化療藥物大多會產生耐藥性及對患者有較強的副作用。研究報道，近幾十年發展起來的生物大分子藥物具有高靶向性、高效、低毒副作用等優點，其中的重組人精氨酸酶的抗腫瘤作用得到了廣泛的論證，但其體內親和力較低，起效劑量較大，尚存在一些潛在的毒副作用。
[0003]精氨酸酶是哺乳動物肝臟中參與尿素循環的一種關鍵酶，在尿素循環中將精氨酸轉化為鳥氨酸和尿素，研究顯示，精氨酸是維持部分腫瘤細胞生長的必需氨基酸，腫瘤細胞內精氨酸水平低于一定值后，會導致細胞死亡。有研究在體外試驗中顯示，精氨酸酶能顯著殺傷肝癌細胞、黑色素瘤細胞、胰腺癌細胞以及白血病細胞等[①Lam TL，Wong GK, ChongHC, Cheng PN, Choi SC, Chow TL, et al.Recombinant human arginase inhibitsproliferation of human hepatocellular carcinoma by inducing cell cycle arrest.Cancer letters.2009;277:91-100.② Hernandez CP, Morrow K, Lopez-Barcons LA,Zabaleta J, Sierra R, Velasco C, et al.Pegylated arginase 1: a potentialtherapeutic approach in T-ALL.Blood.2010; 115:5214-21.?Hsueh EC, Knebel SM,Lo WH, Leung YC, Cheng PN, Hsueh CT.Deprivation of arginine by recombinanthuman arginase in prostate cancer cells.Journal of hematology & oncology.2012:5:17.]精氨酸酶治療肝癌的一期臨床結果顯示了其良好的 成藥性能[Yau T, ChengPN, Chan P, Chan ff, Chen L, Yuen J, et al.A phase I dose-escalating study ofpegylated recombinant human arginase I (Peg-rhArgl) in patients with advancedhepatocellular carcinoma.1nvestigational new drugs.2012.]盡管在體外顯不出良好的效果，精氨酸酶在體內低親和力和較短的半衰期等因素影響了藥物的抗腫瘤療效。因此，進一步提高精氨酸酶的抗腫瘤活性將有助于其抗腫瘤應用。
[0004]惡性淋巴瘤主要可以分為何杰金淋巴瘤(HL)和非何杰金淋巴瘤(NHL)，其中非何杰金淋巴瘤占絕大多數。據世界衛生組織國際癌癥研究組織(International Agency forResearch on Cancer)的數據顯示，全世界NHL的發病率均有所上升，而且發達國家的發病率明顯高于非洲和亞洲地區。惡性淋巴瘤的病因復雜，目前尚未完全研究清楚，遠期存活率較低。目前最常用的治療方法是R-CHOP方案聯合美羅華單克隆抗體，然而化療藥物會給病人帶來諸多嚴重的毒副作用以及后遺癥，且大量臨床研究表明病人產生美羅華耐藥性嚴重以及較高的疾病復發率。因此，開發新型高效低毒的治療策略十分緊迫。精氨酸在人體的正常生理功能中具有重要作用，是一種半必須氨基酸，正常體細胞能夠通過尿素循環將其他氨基酸轉化為精氨酸，從而抵消外源性精氨酸缺乏；然而，對于部分精氨酸依賴的腫瘤細胞，由于缺乏尿素循環過程中的關鍵酶，在外源性精氨酸剝奪時，無法自身合成精氨酸，最終導致細胞死亡。精氨酸酶能夠在體內外降解精氨酸，導致精氨酸依賴的腫瘤細胞死亡，而對正常細胞無影響。因此，精氨酸酶的應用前景引起有關研究者的關注。
[0005]細胞自卩遼(autophagy)又稱II 型程序性死亡(type II programmed celldeath),是真核生物體內常見的“自我消化”(cellular degradation)的現象，通常根據細胞內底物運送到溶酶體腔內方式的不同，哺乳動物細胞自噬可分為三種方式:大自卩遼(macroautophagy)、小自卩遼(microautophagy)和分子伴侶介導的自曬(chaperone-mediated autophagy, CMA)。近年來隨著分子生物學及基因技術的發展和對細胞自噬的深入認識，發現其與多種疾病，尤其是腫瘤的發展關系密切。
[0006]通常，由于細胞自噬有利于細胞的存活，無論在正常細胞或是腫瘤細胞中，自噬普遍被保留下來，并且在一般情況下都維持著基礎自噬。研究顯示，自噬初期可以作為腫瘤發生的一種抑制因素，一些已知的腫瘤抑制因子，例如PTEN、TSCl和TSC2能激活自噬，并且對自噬的抑制可使蛋白降解減少，合成代謝增加，最終導致原癌細胞持續增殖。大多數腫瘤細胞(如肝、胰腺、乳腺癌等)盡管癌變前自噬能力各有不同，但是在癌變之后其自噬能力均減弱。由于自噬在腫瘤發生及發展中所起的作用尚不明確，故其在抗腫瘤藥物殺傷腫瘤細胞過程中所起的作用也不盡相同，大致可以概括為兩種:一種是對腫瘤細胞的保護，另一種則是對腫瘤細胞的殺傷。研究表明化療藥物5-FU能顯著地誘導細胞自噬，且抑制由這3種藥物產生的細胞自噬能顯著增加腫瘤細胞對治療的敏感性[Li J，Hou N, FariedA, Tsutsumi S， et al.1nhibition of Autophagy by 3-MA Enhances the Effect of5-FU-1nduced Apoptosis in Colon Cancer Cells.Ann Surg Oncol.2009; 16(3):761 - 771.]。目前細胞自噬的調節類藥物按其對自噬的作用可以分為兩類，一類是自噬誘導劑如；雷帕霉素(Rapamycin),鋰鹽(lithium)和海藻糖(trehalose)等,還有一類則是自曬抑制劑如:3_MA (3-Methyladenine),渥曼青霉素(wortmannin)、LY294002 等，和 NH4C1、氯喹(Chloroquine) 和羥基氯喹(hydroxychloroquine)等。
[0007]迄今為止，尚未見有關重組人精氨酸酶誘導腫瘤細胞自噬以及細胞自噬抑制劑與重組人精氨酸酶制成抗腫瘤的增效藥物的報道。

【發明內容】

[0008]本發明的目的是提供一種抗腫瘤的增效藥物，尤其涉及一種由細胞自噬抑制劑和重組人精氨酸酶組成的藥物復合物。該藥物復合物，其中的一種或多種細胞自噬抑制劑，其自身無明顯細胞毒性但能通過抑制細胞自噬增強重組人精氨酸酶的療效，從而降低重組人精氨酸酶在治療腫瘤時的用量，減少其潛在的副作用和降低治療成本。
[0009]具體的，本發明提供了一種抗腫瘤的增效藥物，其特征在于，該增效藥物由一種或多種細胞自噬抑制劑和重組人精氨酸酶組成藥物復合物；該增效藥物的一種或者幾種自噬抑制劑與重組人精氨酸酶，通過使用聯合給藥或是序貫給藥的方式，可以通過抑制精氨酸酶誘導的腫瘤細胞的細胞自噬而抵消腫瘤由于細胞自噬而引起的對精氨酸酶治療的拮抗作用，從而增強重組人精氨酸酶對腫瘤的殺傷作用，顯著增強精氨酸酶對腫瘤的治療效果。
[0010]本發明的實施例中，使用細胞自噬抑制劑能加強重組人精氨酸酶對肺癌、腦瘤、乳腺癌、淋巴瘤、白血病、和骨髓瘤，尤其是淋巴瘤和白血病的療效。
[0011]本發明中，所述的精氨酸酶選自鼠源精氨酸酶、重組人精氨酸酶以及各種長效化修飾的精氨酸酶，包括求不限于聚乙二醇修飾的重組人精氨酸酶、唾液酸修飾的重組人精
氨酸酶。
[0012]本發明中，所述的細胞自卩遼抑制劑選自3-MA (3-Methyladenine)、渥曼青霉素(Wortmannin)、LY294002、放線菌酮、巴法洛霉素 Al (Bafilomycin A1)、NH4C1、氯喹(Chloroquine)或羥基氯喹(hydroxychloroquine),優選 3-MA (3-Methyladenine)> 氯喹(Chloroquine)和羥基氯喹(hydroxychloroquine)。
[0013]本發明中，所述的細胞自噬抑制劑中的一種或幾種與重組人精氨酸酶組成藥物復合物，通過序貫使用方式治療腫瘤。本發明的實施例中，精氨酸酶通過誘導淋巴瘤和白血病細胞凋亡和細胞周期阻滯殺傷腫瘤細胞，所述的一種或者幾種自噬抑制劑與重組人精氨酸酶，通過使用聯合給藥或是序貫給藥的方式，能增強重組人精氨酸酶對腫瘤的殺傷作用，增強重組人精氨酸酶的療效。
[0014]本發明所述的腫瘤包括肝癌、肺癌、黑色素瘤、乳腺癌、淋巴瘤、白血病、和骨髓瘤。尤其是淋巴瘤、白血病和肝癌。
[0015]所述的淋巴瘤包括何杰金淋巴瘤(HL)和非何杰金淋巴瘤(NHL)。
[0016]本發明的增效藥物進一步選自以下一組中的形式進行配方:固體、溶液、分散劑、膠束、乳劑、脂質體、納米微球等。
[0017]本發明進行了體外細胞試驗，結果表明:在精氨酸脫亞胺酶殺傷腫瘤細胞時，細胞自噬能保護腫瘤細胞免于細胞死亡，從而降低了藥物的療效；重組人精氨酸酶能顯著誘導淋巴瘤和白血病細胞發生細胞自噬，而細胞自噬則會部分抵消精氨酸酶的抗腫瘤效果，當使用細胞自噬抑制劑抑制細胞自噬則能增加淋巴瘤和白血病細胞對重組人精氨酸酶的敏感性，從而增強重組人精氨酸酶的療效。
[0018]【專利附圖】

【附圖說明】
[0019]圖1顯示:重組人精氨酸酶能抑制Raj1、Daudi淋巴瘤細胞的增殖。
[0020]圖2顯示:重組人精氨酸酶能誘導Raj1、Daudi淋巴瘤細胞發生細胞自噬，其中A顯示，給藥組細胞內有大量的典型的雙層膜結構自噬體，而對照組則未發現顯示，給藥組細胞內有大量的熒光斑點，而對照組較少。
[0021]圖3顯示，重組人精氨酸酶能顯著降低Raji和Daudi細胞的細胞活力。
[0022]圖4是抑制細胞自曬后細胞內相關蛋白的表達水平檢測結果。
[0023]圖5顯示抑制自噬能增強重組人精氨酸酶誘導的Raji和Daudi細胞凋亡。
[0024]圖6顯示重組人精氨酸酶能誘導Jurkat、HL-60白血病細胞發生細胞自噬，
其中，A:給藥組細胞內有大量的典型的雙層膜結構自噬體，而對照組則未發現；B、C:
與對照組相比，給予重組人精氨酸酶組的Jurkat和HL-60細胞的LC3 II的表達水平增強。
[0025]圖7顯示，重組人精氨酸酶能顯著降低Jurkat和HL-60細胞的細胞活力。
【具體實施方式】
[0026] 實施例1:制備重組人精氨酸酶
采用PCR的方法獲得編碼人精氨酸酶的編碼序列，該基因編碼序列全長969bp，帶有酶切位點XhoI和EcoRI。用XhoI和EcoRI內切酶分別雙酶切PCR產物和空質粒載體，將目的基因與載體連接后轉化氨芐抗性平板，挑取若干個陽性轉化子，取其中一個擴增并提取質粒，進行XhoI和EcoRI內切酶雙酶切鑒定，提取重組質粒，將重組載體用Bgl II酶切使線性化，電擊轉化畢赤酵母，挑取陽性轉化子，通過RDB、麗和MD平板篩選，得到表型為his+muts的克隆子，進一步在搖床水平上進行誘導表達，通過SDS-PAGE蛋白電泳檢測搖床水平上精氨酸酶的
表達情況，從而篩選分泌表達精氨酸酶的重組子，從若干株帶有精氨酸酶基因的重組酵母中篩選到分泌表達精氨酸酶的重組子，樣品純化中，將酵母離心后取上清，樣品經過超濾濃縮，采用凝膠排阻層析進行精制，選用Sephacryl S-200作為樣品的精制層析柱；采用聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)進行純度檢測，結果顯示，制得的重組精氨酸酶純度約為95%。獲得的重組人精氨酸酶保存于4攝氏度冰箱；試驗臨用前用細胞培養基稀釋至使用濃度。
[0027]實施例2配制自噬抑制劑藥物
(1)氯喹的配制:取適量氯喹溶于純水配成lOmmol/L的儲存液，用0.1 μ m的濾器過濾除菌后保存于4°C， 體外實驗用PRM1-1640培養基稀釋500-1000倍用于抑制細胞自噬；
(2)氯化銨的配制:取適量氯化銨溶于水配成0.4mol/L的儲存液，用0.1 μ m的濾器過濾除菌后保存于4°C。體外實驗時稀釋50-80倍用于抑制細胞自噬；
(3)羥基氯喹的配制:取適量羥基氯喹溶于純水配成lOmmol/L的儲存液，用0.1 μ m的濾器過濾除菌后保存于4°C，體外實驗室稀釋500-1000倍用于抑制細胞自噬；
(4)3-MA的配制:取適量3-MA干粉配制成0.2mol/L的儲存液，用0.1 μ m的濾器過濾除菌后保存于_20°C。體外實驗時稀釋50-200倍用于抑制細胞自噬；
(5)LY294002的配制:取適量LY294002干粉配制成0.2mol/L的儲存液，用0.1 μ m的濾器過濾除菌后保存于-20°C。體外實驗時稀釋50-100倍用于抑制細胞自噬；
(6)巴伐洛霉素Al的配制:取適量巴伐洛霉素Al干粉配制成0.5 μ g/ml的儲存液，用
0.1um的濾器過濾除菌后保存于_20°C，體外實驗時稀釋1000倍用于抑制細胞自噬；
(7)自噬抑制劑與精氨酸酶聯合應用于體內或體外抗腫瘤時，自噬抑制劑3-MA的使用濃度范圍為0-1 mol/L,自噬抑制劑CQ的使用濃度范圍為0-50 mol/L，羥基氯喹的使用濃度范圍為0-50 mol/L, LY294002的使用濃度范圍為Ο-lmol/L，巴伐洛霉素Al的使用濃度范圍為O-lOmol/L，精氨酸酶的使用濃度范圍為0-100IU/ml。
[0028]實施例3:細胞培養
Raji和Daudi淋巴瘤細胞使用含有10% FBS和1%青霉素-鏈霉素的PRM1-1640培養基培養，細胞生長至對數生長期時，將細胞1000轉每分鐘離心，棄上清，用新鮮培養基將細胞輕輕吹勻，以2*105cellS/ml的濃度轉入細胞培養板內培養，各組細胞分別給予相應濃度的重組人精氨酸酶處理；使用時，給藥前Ih加入2mmol/L的3-MA和5mmol/L的CQ抑制Raji和Daudi細胞的細胞自噬，連續培養24h、48h或72h后進行下一步處理。
[0029]實施例4:重組人精氨酸酶能抑制Raj1、Daudi淋巴瘤細胞的增殖
將適當濃度的Raji和Daudi細胞種在96孔培養板內，加入精氨酸酶使體系終體積為100 μ L，精氨酸酶的終濃度為0.016-4IU/ml的精氨酸酶，培養24h、48h或72h，向每孔加入
10μ MTT液，在培養箱內放置4h，之后用含20% SDS的DMF水溶液溶解，570nm下測量光密度值(0.D.)，結果顯示，0.032-4IU/ml的精氨酸酶處理24h、48h或72h顯著地抑制了細胞的增殖(如圖1A、1B所示)。
[0030]實施例5:重組人精氨酸酶能誘導Raj1、Daudi淋巴瘤細胞發生細胞自噬
Raji和Daudi細胞用lIU/ml的精氨酸酶處理24h后，進行石蠟包埋、切片、染色，在透射電子顯微鏡下觀察細胞亞顯微結構，結果顯示，給藥組細胞內有大量的典型的雙層膜結構自噬體，而對照組則未發現(如圖2A所示)；
Raji和Daudi細胞用lIU/ml的精氨酸酶處理24h后，用Cyto-1D? AutophagyDetection Kit自噬體染色試劑盒按說明書處理，在激光共聚焦顯微鏡下觀綠色熒光斑點，結果顯示，給藥組細胞內有大量的突光斑點，而對照組較少(如圖2B所示)；
將收集到的Raj1、Daudi淋巴瘤細胞用PBS洗I次，用RIPA試劑盒裂解細胞，并定量后按照每個泳道20yg進行蛋白電泳后轉膜至PVDF膜上，用5%脫脂牛奶封閉lh，分別加入LC3b和β -actin抗體，于4°C孵育12h。TBST洗膜后加入二抗室溫孵育1.5h，用ECL顯色液顯色，Raji和Daudi細胞經過重組人精氨酸酶處理不同時間或不同濃度處理后，通過Western Blot的檢測，結果顯示,與對照組相比，給予重組人精氨酸酶組的Raji和Daudi細胞的LC3 II的表達水平增強(如圖2C所示)。
[0031]實施例6:抑制自噬能增強重組人精氨酸酶誘導的Raji和Daudi細胞死亡
Raji和Daudi細胞分別給予lIU/ml的重組人精氨酸酶，并在給藥前Ih加入2mmol/L的3-MA和5 μ mol/L的CQ抑制細胞自噬，連續培養48h后經過MTT法測定各組的細胞活力，結果顯示，重組人 精氨酸酶能顯著降低Raji和Daudi細胞的細胞活力(如圖3所示)，與重組人精氨酸酶單獨使用組相比，重組人精氨酸酶與自噬抑制劑3-MA或CQ聯合應用組的Raji和Daudi細胞的細胞活力有顯著性下降，證明自噬抑制劑和重組人精氨酸酶的聯合給藥能更有效地抑制Raji和Daudi細胞的生長，并且只加抑制劑3-MA和CQ組的細胞活力與對照組相比，無顯著差異，說明抑制劑本身對細胞無明顯細胞毒性，表明自噬抑制劑和重組人精氨酸酶的聯合給藥所降低的Raji和Daudi細胞的細胞活性并非是抑制劑和藥物的協同作用所致，而是因為抑制自噬后增加了 Raji和Daudi細胞對重組人精氨酸酶的藥物敏感性；結果證實，抑制自噬能增加重組人精氨酸酶對Raji和Daudi細胞的殺傷作用。
[0032]實施例7:抑制細胞自噬后細胞內相關蛋白的表達水平檢測
用RIPA裂解液裂解抽取細胞總蛋白，定量后按每孔50 μ g蛋白量上樣進行蛋白電泳并轉膜進行Western blot，用ECL化學發光試劑盒進行化學發光，結果顯示:經過lIU/ml重組人精氨酸酶處理的Raji和Daudi細胞的LC3 II的表達量高于對照組，經過2mmol/L 3-MA和lIU/ml重組人精氨酸酶處理后的Raji和Daudi細胞的LC3 II的表達量低于lIU/ml重組人精氨酸酶處理后的Raji和Daudi細胞，而經過lIU/ml重組人精氨酸酶和5 μ mol/L的CQ處理后的Raji和Daudi細胞的LC3 II的表達量高于lIU/ml重組人精氨酸酶處理后的Raji和Daudi細胞；經過lIU/ml重組人精氨酸酶處理的Raji和Daudi細胞的Cleaved-PARP的表達量高于對照組，經過2mmol/L 3-MA或5 μ mol/L的CQ與lIU/ml重組人精氨酸酶聯合處理后的Raji和Daudi細胞的Cleaved-PARP的表達量高于lIU/ml重組人精氨酸酶單獨處理后的Raji和Daudi細胞(如圖4所示);基于3-MA是一種PI3K III抑制劑，PI3K III在細胞自噬的調控中起重要的作用，其能與Beciln I等分子結合，參與調控自噬體膜的運輸，因此抑制PI3K III將阻遏自噬體的形成，從而起到抑制細胞自噬的作用；Western Blot的結果證明2mmol/L的3-MA能抑制由lIU/ml重組人精氨酸酶所誘導的Raji和Daudi細胞的細胞自噬；而CQ是自噬溶酶體的抑制劑，CQ能造成溶酶體的堿化，使溶酶體酶失去活性，從而造成自噬體的堆積，這造成了自噬體無法在溶酶體內進行降解，導致了處于自噬體膜表面的LC3 II分子的量增加，所以Western Blot的結果能證明5 μ mol/L的CQ能抑制由lIU/ml重組人精氨酸酶誘導的Raji和Daudi細胞的細胞自噬。PARP是caspase家族蛋白的剪切底物，經剪切后變為其剪切形式Cleaved-PARP，Cleaved-PARP的量的多少能直接地反應細胞凋亡的程度，Cleaved-PARP表達量越多則細胞凋亡越顯著；本實驗結果進一步支持“抑制細胞自噬能增強人重組人精氨酸酶誘導的淋巴瘤細胞凋亡”的結論。
[0033]實施例8:抑制自噬能增強重組人精氨酸酶誘導的Raji和Daudi細胞凋亡 收集的Raji和Daudi細胞用PBS洗I次，之后加入500 μ I結合液和
5 μ IAnexin V -FITC，避光室溫孵育15min，隨即進行流式細胞檢測，結果使用SPSSstatistics 19進行統計學分析,Raji和Daudi細胞經過重組人精氨酸酶和抑制劑處理48小時經過流式細胞檢測，結果顯示，經過lIU/ml重組人精氨酸酶處理的Raji和Daudi細胞的細胞凋亡率高于對照組，而lIU/ml重組人精氨酸酶與2mmol/L 3-MA或5 μ mol/L的CQ聯合干預的Raji和Daudi細胞的細胞凋亡率顯著高于lIU/ml重組人精氨酸酶單獨處理的Raji 和 Daudi 細胞 ρ〈0.05，ρ〈0.01，(如圖 5 所示)。
[0034]實施例9:重組人精氨酸酶能誘導Jurkat、HL-60白血病細胞發生細胞自噬 Jurkat和HL-60細胞用lIU/ml的精氨酸酶處理24h后，進行石蠟包埋、切片、染色，在
透射電子顯微鏡下觀察細胞亞顯微結構，結果顯示，給藥組細胞內有大量的典型的雙層膜結構自噬體，而對照組則未發現(如圖6A所示)；
Jurkat和HL-60細胞用lIU/ml的精氨酸酶處理不同時間后，將離心收集到的Jurkat和HL-60淋巴瘤細胞用PBS洗I次，用RIPA試劑盒裂解細胞，并定量后按照每個泳道20 μ g進行蛋白電泳后轉膜至PVDF膜上，用5%脫脂牛奶封閉lh，分別加入LC3b和β-actin抗體，于4°C孵育12h。TBST洗膜后加入二抗室溫孵育1.5h，用ECL顯色液顯色。Jurkat和HL-60細胞經過重組人精氨酸酶處理不同時間或不同濃度處理后,通過Western Blot的檢測，結果，與對照組相比，給予重組人精氨酸酶組的Jurkat和HL-60細胞的LC3 II的表達水平增強(如圖6B、6C所示)。
[0035]實施例10:抑制細胞自噬能增強重組人精氨酸酶誘導的Jurkat和HL-60白血病細胞死亡
Jurkat和HL-60細胞分別給予lIU/m I的重組人精氨酸酶，并在給藥前Ih加入2mmol/L的3-MA和10 μ mol/L的CQ抑制細胞自噬，連續培養48h后經過MTT法測定各組的細胞活力(如圖7所示)，重組人精氨酸酶能顯著降低Jurkat和HL-60細胞的細胞活力，與重組人精氨酸酶單獨使用組相比，重組人精氨酸酶與自噬抑制劑3-MA或CQ聯合應用組的Jurkat和HL-60細胞的細胞活力有顯著性下降，證明自噬抑制劑和重組人精氨酸酶的聯合給藥能更有效地抑制Jurkat和HL-60細胞的生長，并且只加抑制劑3-MA和CQ組的細胞活力與對照組相比，無顯著 差異，說明抑制劑本身對細胞無明顯細胞毒性，自噬抑制劑和重組人精氨酸酶的聯合給藥所降低的Jurkat和HL-60細胞的細胞活性并非是抑制劑和藥物的協同作用所致，而是因為抑制自噬后增加了 Jurkat和HL-60細胞對重組人精氨酸酶的藥物敏感性，結果證實，抑制自噬能增加重組人精氨酸酶對Jurkat和HL-60細胞的殺傷作用。
【權利要求】
1.一種抗腫瘤的增效藥物，其特征在于，該增效藥物由一種或多種細胞自噬抑制劑和重組人精氨酸酶組成藥物復合物。
2.按權利要求1所述的抗腫瘤的增效藥物，其特征在于，所述的細胞自噬抑制劑選自，3-MA (3-Methyladenine)、渥曼青霉素(wortmannin)、LY294002、放線菌酮、巴法洛霉素 Al(Bafilomycin Al )、NH4Cl、氯喹(Chloroquine)或羥基氯喹(hydroxychloroquine)。
3.按權利要求1所述的抗腫瘤的增效藥物，其特征在于，所述的細胞自噬抑制劑選自3-MA (3-Methyladenine)、氯喹(Chloroquine)和羥基氯喹(hydroxychloroquine)。
4.按權利要求1所述的抗腫瘤的增效藥物，其特征在于，所述的精氨酸酶選自鼠源精氨酸酶、重組人精氨酸酶或長效化修飾的精氨酸酶。
5.按權利要求1所述的抗腫瘤的增效藥物，其特征在于，所述的重組人精氨酸酶以及長效化修飾的精氨酸酶選自聚乙二醇修飾的重組人精氨酸酶或唾液酸修飾的重組人精氨酸酶。
6.按權利要求1所述的抗腫瘤的增效藥物，其特征在于，所述的藥物復合中選自以下一組中的形式進行配方:固體、溶液、分散劑、膠束、乳劑、脂質體、或納米微球。
7.按權利要求1所述的抗腫瘤的增效藥物,其特征在于,所述的腫瘤為淋巴瘤、白血病、肝癌、肺癌、黑色素瘤、乳腺癌或骨髓瘤。
8.按權利要 求7所述的抗腫瘤的增效藥物，其特征在于所述的淋巴瘤包括何杰金淋巴瘤(HL)和非何杰金淋巴瘤(NHL)。
【文檔編號】A61K45/00GK103990128SQ201310052032
【公開日】2014年8月20日 申請日期:2013年2月17日 優先權日:2013年2月17日
【發明者】鞠佃文, 曾賢, 李玉彬, 范佳君, 王子玉, 王紹飛 申請人:復旦大學