一種攜帶人金屬硫蛋白基因的臍帶間充質干細胞及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明涉及一種攜帶人金屬硫蛋白基因的臍帶間充質干細胞的制備方法，其包括如下步驟：構建攜帶金屬硫蛋白基因的重組腺相關病毒載體質粒pAAV-MCS-hMT；制備攜帶人金屬硫蛋白基因的重組腺相關病毒rAAV-hMT，測定滴度；將重組腺相關病毒rAAV-hMT感染臍帶間充質干細胞，得到攜帶人金屬硫蛋白基因臍帶間充質干細胞。本發明得到的攜帶金屬硫蛋白基因臍帶間充質干細胞用于衰老模型小鼠，能有效延緩小鼠衰老進程；將其用于高血鉛模型小鼠，可明顯降低小鼠血鉛含量。
【專利說明】—種攜帶人金屬硫蛋白基因的臍帶間充質干細胞及其應用
【技術領域】
[0001]本發明屬于干細胞再生醫學【技術領域】。更具體地，本發明涉及一種攜帶人金屬硫蛋白(Human Metalloth1nein, hMT)基因的臍帶間充質干細胞的制備方法,及其在氧自由基、重金屬導致疾病或衰老治療中的應用。
【背景技術】
[0002]金屬硫蛋白(Metalloth1nein，MT)是指一類低分子量、高巰基含量(20%_30%)，能大量結合金屬離子的性能獨特的蛋白質或活性肽。在人體、動物、植物以及微生物體內均廣泛存在。MT具有非常保守的一級結構和相似的空間結構，在許多物種中MT以多種亞型存在。
[0003]MT具有較強的清除自由基的作用。自由基過剩或任何引起自由基過程剩的因素均會引起細胞病變，影響細胞正常功能的發揮，甚者引起衰老及疾病。天然形式下MT中的巰基均以還原狀態存在，巰基具親核性，從而使MT易與親電性物質特別是某些自由基相互作用。MT對自由基如羥自由基(OH)，氧自由基(O2)或一氧化氮(NO)等有較強的清除作用。MT是訖今為止發現的清除自由基最強的活性蛋白蛋(或多肽)，其清除羥自由基(OH)的能力約為SOD的10，000倍，而清除氧自由基(O)的能力約是谷胱甘肽(GSH)的25倍。
[0004]MT富含巰基及其重金屬結合能力決定了它在重金屬解毒方面起著重要的作用。MT的巰基基團(-SH)能強烈螯合有毒重金屬Hg、Pb、Cd、As等，其中螯合Pb的強度比Zn大200倍，而螯合Cd的強度又比Pb大10倍[13]，從而使它們無法毒害人體，同時對體內Zn等微量元素無影響。這對保護大腦、肝、腎等人體重要器官具有極其重要意義。
[0005]目前，MT的來源主要有三類，一類是在培養基中添加金屬離子，直接誘導微生物生產MT;另一類是對動物喂養含金屬離子的飼料或者注射相關溶液，然后從動物內臟中提取MT ;還有的就是利用基因工程技術生產MT。這幾類生產方法都存在著產量極低，成本高、提純步驟復雜的缺陷，更值得一提的是直接誘導法、動物提取法產生的MT為非人源性MT，且常結合有重金屬，失去了清除氧自由基和結合重金屬的能力。因此，針對MT的轉基因治療將逐漸成為研究的熱點方向。
[0006]胳帶間充質干細胞(umbilical-derivedmesenchymal stem cells, UMSCs)是存在于臍帶華通氏膠和血管周圍組織中的一種干細胞，具有多向分化和自我更新的潛能。UMSCs具有以下優點:臍帶是分娩后的廢棄物，取材方便；UMSCs可在體外分離、培養，擴增迅速，且生物學特性穩定；UMSCs免疫原性低，異體移植不引起免疫排斥反應；UMSCs具有分泌 SCF、LIF、M-CSF、Flt-3、IL_6、GM-CSF、G_CSF、SDF_1、VEGF 等因子的特性，具有免疫調節功能，可用于自身免疫性疾病、神經系統疾病的治療。當前，針對MSC抗衰老、MSC基因修飾等研究才剛剛興起，國內外尚無攜帶hMT基因UMSCs構建的報道，亦無其用于氧自由基、重金屬導致的疾病治療、抗衰老的報道。
【發明內容】
[0007]本發明的目的是提供一種具有較強實用價值的攜帶人金屬硫蛋白(HumanMetalloth1nein, hMT)基因的臍帶間充質干細胞方法。得到的攜帶hMT基因的臍帶間充質干細胞具有分泌hMT、SCF、LIF、M-CSF, Flt_3、IL-6等因子，去除氧自由基或重金屬，調節體內微環境的特性。將其用于衰老模型小鼠，能有效延緩小鼠衰老進程；將其用于高血鉛小鼠，可明顯降低血鉛含量。
[0008]本發明的攜帶人金屬硫蛋白基因的臍帶間充質干細胞制備方法，包含如下步驟:
(1)將人金屬硫蛋白基因連接到腺相關病毒載體PAAV-MCS上，得到攜帶人金屬硫蛋白基因的重組腺相關病毒載體pAAV-MCS-hMT，鑒定人金屬硫蛋白基因已連接到腺相關病毒載體上；
(2)利用磷酸鈣共沉淀法將重組腺相關病毒載體pAAV-MCS-hMT、pHelper和pAAV-RC共轉染到AAV-293細胞中，培養直至AAV-293細胞出現表型變化和毒性反應；
(3)收集細胞懸液，反復凍融后，收集含有重組腺相關病毒株rAAV-hMT的上清液，純化并測定毒株的滴度；
(4)將重組腺相關病毒rAAV-hMT按20M0I加入第2代對數生長期臍帶間充質干細胞培養液中，培養箱培養，得到攜帶人金屬硫蛋白基因的臍帶間充質干細胞。
[0009]步驟(I)所述的人金屬硫蛋白基因經RcoR I和Xba I雙酶切后插入pAAV-MCS，構建重組質粒 pAAV- MCS-hMT ;合成鑒定引物 5 ’ -ATTCTGAGTCCAAGCTAGGC-3 ’，5 ’ -CAGCTGCACTTGTCTGACGT -3’ ；測序鑒定hMT基因正確連接到pAAV- MCS質粒上；
步驟(2 )培養AAV-293細胞，待細胞生長密度為80%，制備lmg/mL濃度的pAAV-MCS-hMT、pAAV-RC、pHelper，共轉染AAV-293細胞進行重組病毒包裝。于37°C、5%C02條件下轉染孵育6 h后，更換培養液，繼續培養直至AAV-293細胞出現表型變化和毒性反應，完成病毒包裝；
步驟(3)收集細胞懸液輪流放置于干燥的冰乙醇浴箱中冰凍和37°C水浴箱中融化，反復凍融4次，每次10分鐘，室溫下1000g轉速離心10分鐘，收集含有重組腺相關病毒株rAAV-hMT的上清液，純化并測定毒株的滴度；
步驟(4)將重組腺相關病毒rAAV-hMT按20M0I加入第2代對數生長期臍帶間充質干細胞培養液中，5%C02, 37 V細胞培養箱培養24小時，得到攜帶人金屬硫蛋白基因的臍帶間充質干細胞。
[0010]采用上述技術方案，本發明方法可獲得一種攜帶有人金屬硫蛋白基因的臍帶間充質干細胞，以2 X 105/ml細胞濃度結種至細胞培養瓶，置于5%C02，37°C細胞培養箱培養24小時，培養液中人金屬硫蛋白含量明顯升高。該攜帶人金屬硫蛋白基因的臍帶間充質干細胞或分泌液可用來制備成用于氧自由基、重金屬導致疾病或衰老治療的制品。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0011]圖1.重組腺相關病毒rAAV-hMT的構建示意圖；
圖2.MTS法測定20M0I腺相關病毒rAAV-hMT感染UMSCs細胞存活率結果圖；
圖3.流式細胞術測定攜帶人金屬硫蛋白基因臍帶間充質干細胞表面標記結果圖；
圖4.攜帶人金屬硫蛋白基因UMSCs的成骨、成脂分化結果圖圖5.qRT-PCR法檢測攜帶人金屬硫蛋白UMSCs hMT mRAN水平結果圖； 圖6.攜帶人金屬硫蛋白基因UMSCs對重金屬Cd2+、Pb2+耐受性鑒定結果圖；
圖7.攜帶人金屬硫蛋白基因UMSCs對衰老小鼠血清MT、腦組織端粒酶影響結果圖； 圖8.攜帶人金屬硫蛋白基因UMSCs對高鉛小鼠的促排鉛作用結果圖。
【具體實施方式】
[0012]以下結合附圖詳細說明本發明的【具體實施方式】:
實施例一攜帶金屬硫蛋白基因臍帶間充質干細胞的制備
本發明將兩端含有RcoR I和Xba I酶切位點的hMT基因片段和pAAV- MCS質粒用RcoRI和Xba I雙酶切，用T4連接酶將hMT基因連接到pAAV- MCS質粒上，構建重組質粒pAAV-MCS-hMT ;合成鑒定引物 5’ -ATTCTGAGTCCAAGCTAGGC-3’，5’ - CAGCTGCACTTGTCTGACGT -3’ ；進行測序鑒定hMT基因正確連接到pAAV- MCS質粒上(見圖1)。將lmg/mL濃度的pAAV-MCS-hMT、pAAV-RC、pHelper，共轉染生長密度約80%的AAV-293細胞進行重組病毒包裝，37°C、5%C02條件下孵育6 h后，更換培養液，繼續培養直至AAV-293細胞出現表型變化和毒性反應，完成重組腺相關病毒株rAAV-hMT的包裝。收集細胞懸液輪流放置于干燥的冰乙醇浴箱中冰凍和37°C水浴箱中融化，反復凍融4次，每次10分鐘，室溫下1000g轉速離心10分鐘，收集含有重組腺相關病毒株rAAV-hMT的上清液，超濾濃縮純化并測定毒株的滴度；將重組腺相關病毒rAAV-hMT按20M0I加入第2代對數生長期UMSCs培養液中，5%C02，37°C細胞培養箱培養24小時，得到攜帶金屬硫蛋白基因臍帶間充質干細胞。將攜帶金屬硫蛋白基因臍帶間充質干細胞以3X 104/ml細胞濃度結種至96孔板，置于5%C02，37°C細胞培養箱培養24、48、72、96小時，細胞具有良好的生長狀態(見圖2)。流式細胞術測定攜帶金屬硫蛋白基因臍帶間充質干細胞表面標記結果與UMSCs相比，表面標記無明顯變化(見圖3)。攜帶金屬硫蛋白基因臍帶間充質干細胞的成骨、成脂分化實驗結果顯示其分化能力無明顯變化(見圖4)。
[0013]實施例二攜帶金屬硫蛋白基因臍帶間充質干細胞中hMT mRAN水平鑒定
合成hMT熒光定量PCR引物5’- CCMCTGCTCCTGCTCGC -3’，5’- CAGCTGCACTTGTCTGACGT-3’。將細胞株I =UMSCs ;細胞株2:空載腺相關病毒感染的UMSCs ;細胞株3:本發明獲得的攜帶金屬硫蛋白基因臍帶間充質干細胞共3種細胞株，傳代至細胞培養瓶。待細胞長至90%密度，用PBS洗3遍后，加I ml TRIzol試劑提取細胞總RNA。核酸檢測儀檢測RNA質量和濃度，取2 μ g的總RNA，利用逆轉錄試劑盒進行逆轉錄，獲得cDNA。熒光實時定量PCR鑒定hMT mRNA水平。反應體系:SYBR Green mix 25μ L,2.0μ L cDNA模板、引物各IyL(1nmoI/L )、用 ddH20 補足體系至 50 μ L。反應:95°C、2 min，然后 95°C、30s，55°C、30s，72°C、30s，共40個循環，最后72°C、5min延伸。同時設置6個濃度梯度，制作標準曲線。根據標準曲線，計算細胞株1、細胞株2和細胞株3中hMT mRNA和內參基因β-actin mRNA的相對含量。重復檢測3次。結果顯示細胞株3中hMT mRNA表達水平較細胞株1、細胞株2增高約16培(圖5)。
[0014]實施例四攜帶金屬硫蛋白基因臍帶間充質干細胞對重金屬Cd2+、Pb2+的耐受性將細胞株I =UMSCs ;細胞株2:空載腺相關病毒感染的UMSCs ;細胞株3:本發明獲得的攜帶金屬硫蛋白基因臍帶間充質干細胞，以3X104/ml細胞濃度結種至96孔板，每孔lOOul，置于5%C02，37°C細胞培養箱過夜，去除舊培養液，分別添加含有CdCl2 (終濃度25 μ m/L)、醋酸鉛(終濃度50 μ m/L)的培養液100 μ L，以添加新鮮培養液100 μ L為正常對照。置CO2孵箱中37°C培養I，2，3，4天，每孔加入MTS 15 μ L，培養4小時，震蕩5min，用酶標儀于490nm處測吸光度A值，繪制生長曲線。其結果說明，細胞株I，細胞株2的生長均受到50 μ m/L CdCl2,75 μ m/L醋酸鉛的抑制；而細胞株3對50 μ m/LCdCl2、75 μ m/L醋酸鉛具有顯著的耐受性(圖6)。
[0015]實施例五攜帶金屬硫蛋白基因臍帶間充質干細胞對D-半乳糖致衰老小鼠的抗衰老作用
本發明采用D-半乳糖致小鼠衰老模型評價UMSCs-hMT的抗衰老作用。將50只小鼠隨機分為5組，每組10只，分別為正常組、模型組、治療組1、治療組2、治療組3。治療組I在衰老模型制備成功后，經尾靜脈給予UMSCs 5X105，間隔3天，給予第二次注射；治療組2在衰老模型制備成功后，經尾靜脈給予空載腺相關病毒感染UMSCs 5X 105，間隔3天，給予第二次注射；治療組3在衰老模型制備成功后，經尾靜脈給予攜帶金屬硫蛋白基因臍帶間充質干細胞5X105，間隔3天，給予第二次注射；正常組、模型組均同時經尾靜脈注射給予等量生理鹽水。采用Gd-血紅素飽和法檢測血清中MT變化、端粒重復擴增-微孔板雜交法檢測腦組織端粒酶活性，可見治療組1、治療組2和治療組3小鼠的兩項指標均具有一定程度的升高，治療組3升高尤為顯著(圖7)。其結果說明，D-半乳糖致衰老模型小鼠經尾靜脈輸入攜帶金屬硫蛋白基因臍帶間充質干細胞能有效地延緩小鼠衰老進程。
[0016]實施例六攜帶金屬硫蛋白基因臍帶間充質干細胞對高鉛小鼠的促進排鉛作用本發明采用預防性高鉛小鼠模型評價攜帶金屬硫蛋白基因臍帶間充質干細胞的排鉛作用。將40只小鼠隨機分為4組，每組10只，分別為正常組、模型組、治療組1、治療組2、治療組3。正常組給予飲用水；模型組給予飲用lg/L醋酸鉛水溶液；治療組在給予飲用Ig/L醋酸鉛水溶液的同時，治療組I經尾靜脈給予UMSCs 5X 105，治療組2經尾靜脈給予空載腺相關病毒感染UMSCs 5X105,治療組3經尾靜脈給予攜帶金屬硫蛋白基因臍帶間充質干細胞5 X 15,正常組和模型組均經尾靜脈注射等量生理鹽水。經24小時，取適量血，原子吸收廣譜測定鉛含量。正常組小鼠血鉛含量平均約為0.04 μ g/g，模型組小鼠血鉛含量平均約為0.53 μ g/g,治療組I小鼠血鉛含量平均約為0.45 μ g/g,治療組2小鼠血鉛含量平均約為0.48 μ g/g,治療組3小鼠血鉛含量平均約為0.15 μ g/g，其結果說明，UMSCs-hMT對高鉛小鼠具有顯著的促進排鉛作用(圖8)。
【權利要求】
1.一種攜帶人金屬硫蛋白基因的臍帶間充質干細胞制備方法，其特征在于:包括如下步驟: (1)將金屬硫蛋白基因連接到腺相關病毒載體PAAV-MCS上，得到攜帶金屬硫蛋白基因的重組腺相關病毒載體pAAV-MCS-hMT，鑒定金屬硫蛋白基因已連接到腺相關病毒載體上； (2)利用磷酸鈣共沉淀法將重組腺相關病毒載體pAAV-MCS-hMT、包裝質粒、輔助質粒共轉染到AAV-293細胞中，培養至AAV-293細胞出現表型變化和毒性反應； (3)收集細胞懸液，采用反復凍融方法，收集含有重組腺相關病毒株rAAV-hMT的上清液，純化并測定rAAV-hMT毒株的滴度； (4)重組腺相關病毒rAAV-hMT感染臍帶間充質干細胞，得到攜帶有金屬硫蛋白基因的臍帶間充質干細胞。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于:所述步驟(3)獲得重組腺相關病毒株rAAV-hMT的步驟為:收集細胞懸液輪流放置于干燥的冰乙醇浴箱中冰凍和37°C水浴箱中融化，反復凍融4次，每次10分鐘，室溫下1000g轉速離心10分鐘，收集上清液，純化并測定毒株滴度。
3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于:所述步驟(4)重組腺相關病毒rAAV-hMT感染臍帶間充質干細胞的步驟為:將重組腺相關病毒rAAV-hMT按20M0I加入第2代對數生長期臍帶間充質干細胞培養液中，5%C02，37°C細胞培養箱培養24小時。
4.根據權利要求1至3任一項所述的方法，其特征在于:所述重組腺相關病毒rAAV-hMT 所用載體為 pAAV_MCS 質粒、pHelper 和 pAAV-RC 質粒。
5.根據權利要求1至4任一項所述的方法，其特征在于:所述攜帶人金屬硫蛋白基因臍帶間充質干細胞或其分泌液制備成用于氧自由基、重金屬等導致疾病或衰老治療的制品O
【文檔編號】A61P39/02GK104232585SQ201310251408
【公開日】2014年12月24日 申請日期:2013年6月24日 優先權日:2013年6月24日
【發明者】湛敏, 其他發明人請求不公開姓名 申請人:丁長才, 湛敏