一種間充質干細胞的保存液以及保存方法與流程

本發明涉及醫療技術領域，特別是涉及一種間充質干細胞的保存液以及保存方法。

背景技術：

間充質干細胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)具有多向分化的潛能，能分化成骨、脂肪軟骨等多種細胞；同時MSCs具有免疫調節、炎癥趨化、組織修復功能及低免疫原性等生物學特性；可廣泛用于骨損修復、骨髓重建、神經損傷修復和免疫調控等領域。MSCs可以從人或者動物的骨髓、胎盤、脂肪組織、臍帶血、肝臟、牙髓腔等組織器官中分離、培養，而MSCs普及應用的前提之一是如何體外方便、有效保存。

目前MSCs有三種保存方法：

一、MSC體外培養、傳代保存

MSC離體分離后，可以用適當的細胞培養液進行體外培養，然后將體外培養的細胞不間斷的進行傳代，在需要使用的時候收獲細胞備用。由于MSCs具有分化潛能，在培養過程中有可能發生分化，形成組織如骨頭、脂肪、軟骨等，因此用細胞培養、傳代的方法保存MSCs，可能導致MSCs出現不可預知的分化，進而發生功能改變，對后續的使用產生不利影響。

二、MSC體外深低溫冰凍保存

MSC離體分離后，用適當濃度的冷凍保護劑如甘油、二甲亞砜等，與MSCs充分混勻后，經過程控降溫程序，最終放到-196℃的液氮中保存，由此實現MSC的中長期保存。該方法需要液氮罐等特殊裝置，人員操作時有液氮灼燒風險；凍存過程中需加入冷凍保護劑，而使用前需要將冷凍保護劑有效去除，因此不利于后續使用；MSC深低溫凍存后復蘇過程中容易導致細胞丟失，損失大量細胞，不利于批量MSCs保存。

三、即用即取

只有在需要使用MSCs的時候，才進行離體分離。即采用不同的方法，從人體或者動物體內分離、得到MSCs后，立即使用，不將MSCs放到任何環境下保存。即用即取的方法雖然目前應用較為廣泛，可克服細胞分化和冰凍損失細胞的不利因素，但受到場地、操作條件等諸多限制，且實施過程中，需要完整的流程配合，極易造成MSCs的浪費和丟棄，從而成為MSCs推廣應用的障礙。

技術實現要素：

本發明的目的在于提供一條抗細胞分化、易于操作、低成本的適合實驗研究和臨床應用的大批量保存MSCs的方法。

為了實現上述目的，本發明采取的技術方案是：

一種間充質干細胞的保存液，其配方按重量百分比包括如下組分：枸櫞酸鈉2.63g/ml、枸櫞酸0.327g/ml、葡萄糖3.19g/ml、腺嘌呤0.0275g/ml、磷酸二氫鈉0.222g/ml和醫用純水余量。

一種間充質干細胞的保存方法，步驟如下：

①取部分細胞進行細胞計數，其余細胞離心去上清；以每毫升保存液保存106-107細胞的比例，用上述比例制備的保存液重懸細胞，輕柔充分混勻細胞和保存液；

②將細胞懸液轉移至無菌的離心管中，用封口膜密封；

③將離心管轉移至2-6℃冰箱中保存，每天至少觀察記錄冰箱溫度4次，保證冰箱溫度控制在2-6℃；

④保存期內的MSCs可隨時在無菌環境中取出，在2-6℃條件下低速離心棄上清，收集細胞，供體內外使用。

如上所述的一種間充質干細胞的保存方法，其中，所述間充質干細胞從人或小鼠的骨髓、脂肪、臍血中提取的。

如上所述的一種間充質干細胞的保存方法，其中，每毫升保存液可保存106-107個間充質干細胞。

如上所述的一種間充質干細胞的保存方法，其中，保存液最低保存該間充質干細胞的保存期限為14天以上。

如上所述的一種間充質干細胞的保存方法，其中，保存過程中用到的保存器皿為封閉式塑料或者玻璃器皿。

與現有技術相比，本發明產生的有益效果主要體現在：

(1)本發明的一種間充質干細胞的保存液以及保存方法，可使MSCs保存后存活率達到75％以上，高于液氮凍存深低溫方法的細胞得率；

(2)本發明的一種間充質干細胞的保存液以及保存方法，用本發明的保存液保存MSCs到14天以后，MSCs沒有向其他細胞分化，優于培養傳代保存方案；

(3)本發明的一種間充質干細胞的保存液以及保存方法，僅需要使用常見的2-6℃冰箱配置，易于操作，不需要添加液氮或者冷凍保護劑，人員操作時安全性較高，節省液氮罐所占空間；

(4)本發明的一種間充質干細胞的保存液以及保存方法，存儲方便，適于MSCs大規模儲存；

(5)本發明的一種間充質干細胞的保存液以及保存方法，方便運輸，也利于MSCs的中遠程轉運。

附圖說明

附圖1為MSCs在保存液中保存14天后，臺盼藍染色檢測死亡細胞的結果，顯微鏡放大倍率為100×，200×；

附圖2為MSCs在保存液中，隨保存時間的變化，細胞存活率的統計圖；

附圖3為MSCs在保存液中保存的第1天和第14天，碘化丙啶(propidium iodide，PI)檢測細胞存活率的流式圖。

具體實施方式

為了便于理解本發明的目的、技術方案及其效果，現將結合實施例對本發明做進一步詳細闡述。

如圖1所示，本發明的一種間充質干細胞的保存液，其配方按重量百分比包括如下組分：枸櫞酸鈉2.63g/ml、枸櫞酸0.327g/ml、葡萄糖3.19g/ml、腺嘌呤0.0275g/ml、磷酸二氫鈉0.222g/ml和醫用純水余量。

本發明的一種間充質干細胞的保存方法，步驟如下：

①取部分細胞進行細胞計數，其余細胞離心去上清；以每毫升保存液保存106-107細胞的比例，用上述比例制備的保存液重懸細胞，輕柔充分混勻細胞和保存液；

②將細胞懸液轉移至無菌的離心管中，用封口膜密封；

③將離心管轉移至2-6℃冰箱中保存，每天至少觀察記錄冰箱溫度4次，保證冰箱溫度控制在2-6℃；

④保存期內的MSCs可隨時在無菌環境中取出，在2-6℃條件下低速離心棄上清，收集細胞，供體內外使用。

本發明的一種間充質干細胞的保存方法，所述間充質干細胞從人或小鼠的骨髓、脂肪、臍血中提取的。

本發明的一種間充質干細胞的保存方法，每毫升保存液可保存106-107個間充質干細胞。

本發明的一種間充質干細胞的保存方法，保存液最低保存該間充質干細胞的保存期限為14天以上。

本發明的一種間充質干細胞的保存方法，保存過程中用到的保存器皿為封閉式塑料或者玻璃器皿。

本發明還提供了MSCs中長期保存后存活率的驗證，具體如下：

(1)以骨來源的MSCs為例，制備MSCs

①取8-12周齡的C57BL/6小鼠股骨和脛骨，手術刀片清理去除所有肌肉組織。骨頭放于研磨杯內研磨至骨髓釋放，加入PBS沖洗骨頭以去除骨髓，再次研磨和沖洗，直到骨頭全部變成白色。加入0.5％膠原酶混勻后，搖床上37℃消化1h，然后取70μm孔徑濾網，過濾消化后骨混合物，收集過濾液。離心，用PBS重懸后，進行細胞計數。

②用抗-CD45和抗-Ter119的免疫磁珠，按照試劑盒的方法對上述細胞懸液富集MSCs；

(2)MSCs的保存

①用1ml保存液重懸(1)中制備的MSCs，混勻，進行細胞計數。

②以每毫升保存液保存106-107細胞的比例，用保存液重懸細胞，輕柔充分混勻細胞和保存液；

③取20μl細胞懸液與等量的0.8％的臺盼藍(生理鹽水作為溶劑配置的)混勻，在3分鐘之內壓片，光學顯微鏡下計數未染色的細胞(為活細胞)，計算活細胞數量。

④其余細胞懸液轉移至無菌離心管中，用封口膜密封，置于2-6℃冰箱中保存。

(3)MSCs保存效果的檢測

①在保存的第1，4，7，14天，對細胞使用臺盼藍拒染法測定細胞活力。取0.8％的臺盼藍20μl與等量的細胞懸液混勻，在3分鐘之內壓片，光學顯微鏡下成像，并計數未染色的細胞(為活細胞)與染色細胞(染成藍色，為死細胞)，計算活細胞占細胞總數的百分數。結果如附圖1和2。

②在第1天和第14天，取100μl保存MSCs，加入1mlPBS混勻后，1500rpm離心5min，棄上清，加入流式緩沖液500μl,混勻。加入5μlPI(200μg/ml),2-8℃避光染色15min,在1h內流式檢測PI陰陽性細胞。PI嵌入核酸雙鏈中并可以發熒光。它不能進入活細胞，但是可以進入正在或者已經死亡的細胞。因此PI陽性細胞為死細胞，PI陰性細胞為活細胞。結果如附圖3。

上面結合實施例對本發明做了進一步的敘述，但本發明并不限于上述實施方式，在本領域的普通技術人員所具備的知識范圍內，還可以在不脫離本發明宗旨的前提下做出各種變化。