一種基因疫苗載體、其制備方法及應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種基因疫苗載體、其制備方法及應用，該基因疫苗載體是磷酸酶催化小分子多肽形成的超分子水凝膠，所述小分子多肽的結構式如式（I）所示：，其中，m=1時，n=0、1、2或3；n=1時，m=1、2或3。該基因疫苗載體負載DNA后的免疫原性強、負載量大、沒有明顯毒性并可注射免疫。本發明的基因疫苗載體制備條件溫和并且過程簡單。
【專利說明】一種基因疫苗載體、其制備方法及應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及生物醫藥領域，尤其涉及一種基因疫苗載體、其制備方法及應用。
【背景技術】
[0002] 人類免疫缺陷病毒（Human Immunodeficiency Virus，HIV)已經引起超過3 千萬人的死亡，發展一種高效的疫苗防止HIV的感染成為人們迫切的需要。除此之外， 譬如乙肝、丙肝以及流感等傳統的疫苗的效率很低并會引來潛在的風險，所以安全的替 代物如基因疫苗引起廣泛的注意。基因疫苗十分安全并且可以產生長期的細胞免疫 和體液免疫應答，但是基因疫苗的免疫原性很低，需要通過一種載體輸送到體內增強 免疫應答。已有的載體包括高分子、脂質體以及納米或微米顆粒等。高分子如聚醚酰 亞胺（Polyetherimide，PEI)具有較大的毒性（Lim，M.H.，et al. (2007). Accounts of chemical research40(l) :41-51);脂質體的抗原負載量比較小（Malmsten，M. (2006). Soft matter2 (9) :760-769.);納米或微米顆粒如二氧化硅小球或微乳液制備復雜，在制備過程 中存在的有機溶劑、高剪切力及超聲等條件易使DNA活性下降（Ando, S.，et al. (1999). Journal of Pharmaceutical Sciences88(I) : 126-130 ；ffalter, E. , et al. (1999). Journal of Controlled Release61(3) :361-374 ；Gemeinhart,R.A.,et al. (2005). Biotechnology Progress21 (2) :532-537.)。水凝膠雖然具有比較好的生物相容性，但是傳統的水凝膠不 可直接注射使用，需要原位成膠用于載藥，雖然可局部釋藥，但是未反應的單體會造成毒性 (Altunbas，A.，et al. (2011).Biomaterials32(25):5906-5914·)。因此，如何找到一種安 全、高效負載、制備簡單且不降低疫苗活性、可注射的基因疫苗載體仍然是一個挑戰。
[0003] 超分子水凝膠是由分子量小于2000的小分子通過自組裝在水溶液中形成的水凝 膠（Aida，T.，et al. (2012).Science335(6070):813-817·)。這種水凝膠成膠方法多樣， 可快速對pH、離子強度及溫度等進行響應，形成水凝膠（Hartgerink, J. D.，et al. (2002). Proceedings of the National Academy of Sciences99 (8) :5133-5138.)。在這些方法 中，酶催化的成膠反應具有獨特的優點，具有高選擇性，可在生理條件下或者溫和條件下快 速成膠，從而避免了 DNA 生物活性的降低（Yang, Z.，et al. (2008) .Accounts of chemical research41 (2) :315-326.)。此外超分子水凝膠可以多種方式注射到體內，皮下或腹腔給動 物注射超分子水凝膠均沒有顯示出急性或長期毒性（Yang, Z.，et al. (2006). Journal of the American Chemical Societyl28 (9):3038-3043. )〇
[0004] 中國專利申請（申請號為：200910229186. 7)涉及一系列用于生成穩定小分子水凝 膠的多肽衍生物的合成方法，但是沒有涉及這種小分子水凝膠的應用。
【發明內容】
[0005] 本發明人通過大量實驗和創造性勞動，制得了一種基因疫苗載體，并證實該基因 疫苗載體負載DNA后的免疫原性強、負載量大、沒有明顯毒性并可注射免疫。本發明的基因 疫苗載體制備條件溫和并且過程簡單。本發明可通過肌肉注射、皮內注射或皮下注射的方 式對人或動物進行HIV、乙肝、丙肝和流感病毒等病毒的免疫。
[0006] 本發明采用以下技術方案：
[0007] 在第一方面，本發明提供一種基因疫苗載體，其是磷酸酶催化小分子多肽形成的 超分子水凝膠，所述小分子多肽的結構式如式（I)所示：
[0008]
【權利要求】
1. 一種基因疫苗載體，其特征在于，所述基因疫苗載體是磷酸酶催化小分子多肽形成 的超分子水凝膠，所述小分子多肽的結構式如式（I)所示：
其中，m=l時，n=0、l、2 或 3 ;n=l時，m=l、2 或 3。
2. 根據權利要求1所述的基因疫苗載體，其特征在于，所述小分子多肽的結構式如式 (II)所示：
根骷儀利安豕i玫^所還的*囚沒田頊1平，兵狩他仕卞，所還塒酸職刃側a王塒酸職玫 酸性磷酸酶。
4. 一種權利要求1至3任一項所述的基因疫苗載體的制備方法，其特征在于，包括以下 步驟： (a) 使用Tris緩沖液作為溶劑配置磷酸酶溶液； (b) 使用PBS緩沖液作為溶劑配置小分子多肽溶液，調節pH5?9 ; (c) 將所述磷酸酶溶液加入所述小分子多肽溶液，混合均勻，至所述小分子多肽的濃度 (w/v)為0. 8%。以上，靜置以形成超分子水凝膠，即所述基因疫苗載體。
5. 根據權利要求4所述的基因疫苗載體的制備方法，其特征在于，所述步驟（a)中，所 述Tris緩沖液為50mMTris-HCl+lmMMgCl2溶液，所述磷酸酶為堿性磷酸酶，所述堿性磷 酸酶的濃度為2U/iiL; 所述步驟（b)中，所述小分子多肽的結構式如所述式（II)所示，所述小分子多肽溶液 的濃度為2%。，用Na2C03調節pH至9 ; 所述步驟（c)中，所述磷酸酶溶液與所述小分子多肽溶液的體積比為3 :100,所述靜置 為室溫靜置lOmin以上。
6. -種負載有DNA的基因疫苗載體，其特征在于，包括權利要求1至3任一項所述的基 因疫苗載體及所述基因疫苗載體負載的DNA。
7. 根據權利要求6所述的負載有DNA的基因疫苗載體，其特征在于，所述DNA包含HIV、 乙肝、丙肝和流感病毒中一種或至少兩種病毒的蛋白質編碼序列。
8. -種權利要求6或7所述的負載有DNA的基因疫苗載體的制備方法，其特征在于，包 括以下步驟： (1) 使用Tris緩沖液作為溶劑配置磷酸酶溶液； (2) 使用PBS緩沖液作為溶劑配置小分子多肽溶液，調節pH5?9,并加入所述DNA; (3) 將所述磷酸酶溶液加入所述小分子多肽溶液，混合均勻，至所述小分子多肽的濃度 (w/v)為0. 8%。以上，靜置以形成超分子水凝膠，即所述負載有DNA的基因疫苗載體。
9. 一種權利要求6或7所述的負載有DNA的基因疫苗載體作為基因疫苗的應用。
10. 根據權利要求9所述的應用，其特征在于，所述應用具體為將所述負載有DNA的 基因疫苗載體作為基因疫苗，通過肌肉注射、皮內注射或皮下注射的方式對人或動物進行 HIV、乙肝、丙肝和流感病毒中一種或至少兩種病毒的免疫。
【文檔編號】A61P31/14GK104274839SQ201310271890
【公開日】2015年1月14日 申請日期:2013年7月1日 優先權日:2013年7月1日
【發明者】蔣興宇, 田月, 楊志謀, 王懷民, 邵一鳴 申請人:國家納米科學中心