CDKL1基因及其siRNA和應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種分離的CDKL1基因小分子干擾核糖核酸的標靶DNA，其中所述標靶DNA是序列如SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:2，SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4中任意一條所示的DNA，還公開了一種抑制CDKL1基因表達的小分子干擾核糖核酸和編碼該siRNA的重組載體以及CDKL1基因沉默的細胞系及其應用。本發明提供的siRNA序列既能夠特異性抑制CDKL1基因的表達，又可用于制備或篩選抗癌癥的藥物。本發明所得siRNA對研究CDKL1基因對腫瘤原發性耐藥性、腫瘤增殖和遷移的影響機制以及惡性腫瘤的臨床非手術治療具有重要的意義。
【專利說明】CDKL1基因及其siRNA和應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物【技術領域】，特別涉及一種CDKL1基因的小分子干擾核糖核酸標靶 DNA，抑制⑶KL1基因表達的siRNA的核苷酸序列、編碼所述siRNA的重組載體及其在制備 和篩選抗癌的藥物中的用途。
【背景技術】
[0002] 膽囊癌是膽道系統中最常見的惡性腫瘤，占消化系統惡性腫瘤的第五位，早期膽 囊癌無特異性的臨床表現，大多數患者發現時已處于進展期，進展期膽囊癌手術后的預后 很差，5年存活率僅為5%。導致膽囊癌患者術后生存期短的主要原因在于術后的復發和轉 移。目前臨床上沒有可以用于判斷膽囊癌患者術后轉移的分子靶標，也沒有可以用于治療 腫瘤細胞轉移的潛在的靶向藥物治療靶點。
[0003] CDKL1 (cyclin-dependentkinase-likel(CDC2_relatedkinase))是細胞周期 蛋白依賴性激酶樣蛋白1。該蛋白最早在1992年被報道，Meyerson等設計了針對cdc2 蛋白的保守序列的簡并引物，通過PCR的方法，從cDNA文庫中鑒定出7個新的cdc2相 關激酶（cdc2relatedkinase)。其中一個被稱為KKIALRE的分子后來被命名為CDKL1(M Meyerson,GHEnders，CLWu,LKSu，CGorka，CNelson,EHarlow,LHTsai:Afamilyof humancdc2_relatedproteinkinases.EMB0J1992, 11:2909-17)。
[0004] 關于⑶KL1分子的功能，目前了解地非常少。已有報道Cdc2在細胞周期中，調控 細胞進入S期（MPacek，TAProkhorova,JCWalter:Cdkl:unsungheroofSphase?Cell Cycle2004, 3:401-3)，盡管和cdc2的結構具有較高的相似性，但是到目前為止CDKL1是否 參與細胞周期調控仍然未知。通過對CDKL1結構的分析，CDKL1含有一個保守的MAP激酶 雙憐酸化結構域（MAPkinasedualphosphorylationmotif)。該分子可以被表皮生長因 子（epidermalgrowthfactor,EGF)激活且整個過程不需要磷酸化。另外，通過對于腦內 CDKL1的免疫組化實驗研究，發現該分子主要是一個分布在膠質內的蛋白，它的主要功能可 能是影響膠質細胞生成（SHYen,AKenessey，SCLee,DWDickson:Thedistributionand biochemicalpropertiesofaCdc2-relatedkinase,KKIALRE,innormalandAlzheimer brains.JNeurocheml995, 65:2577-84)。
[0005] RNA干擾現象（RNAinterference,RNAi)是細胞內自主產生的生物進化過程中一 項保守的防御機制。siRNA被認為是RNA干擾的主要效應物，已成為一種通過抑制目的基因 的表達來研究哺乳動物基因功能的有效工具。直接轉染合成的siRNA能特異性抑制動物細 胞內同源基因的表達，但是細胞內siRNA很容易降解，因此這種方法不能實現穩定的RNA干 擾。慢病毒載體在動物細胞內感染效率高，免疫原性低，且既能感染分裂期的細胞又能感染 非分裂期的細胞。由于病毒載體的這些特性，慢病毒介導RNA干擾能在各類動物細胞內長 期穩定地表達siRNA，抑制基因表達，因此該方法具有高效、穩定、特異性強、適用范圍廣的 特定，已成為RNA干擾技術的主要研究工具。RNA干擾技術在生物醫藥上的應用為臨床腫瘤 的應用基礎研究增加了強有力的手段。
【發明內容】
[0006] 因此，本發明要解決的技術問題就是針對目前臨床上腫瘤病人的預后很差，手術 后生存期很短，同時缺乏有效的預測腫瘤原發耐藥的分子診斷標記物和治療腫瘤原發耐藥 的分子靶點的問題，提供一種有效抑制CDKL1基因表達的siRNA分子，所述siRNA分子作用 的標靶DNA及其在制備或篩選抗腫瘤藥物中的應用。
[0007] 本發明解決上述技術問題采取的技術方案之一是：一種分離的CDKL1基因小分子 干擾核糖核酸標靶DNA，其中所述標靶DNA是：
[0008] (1)⑶KL1編碼基因上的連續15?27個核苷酸組成的DNA;
[0009] (2)序列如SEQIDN0:1，SEQIDN0:2，SEQIDN0:3 和SEQIDN0:4 中任意一條 所示的DNA;或
[0010] (3)與（1)或（2)所述的DNA在嚴緊雜交條件下雜交的多核苷酸組成的DNA，或者 與其互補的DNA。
[0011] 本發明所述分尚的⑶KL1基因小分子干擾核糖核酸標祀DNA分子，較佳地由⑶KL1 基因編碼區上的連續10?30個核苷酸構成，更佳地為15?27個核苷酸組成的DNA;最佳 地是如序列表中SEQIDN0:1、SEQIDN0:2、SEQIDN0:3和SEQIDN0:4中任意一條所示 的DNA分子。
[0012]本發明所述DNA為本領域常規的DNA，其制備方法較佳地為：從天然存在的核酸序 列中提取或通過人工合成得到該DNA分子。
[0013] 其中所述雜交條件根據測量雜交時所用條件的嚴緊性程度來分類。嚴緊性程度 可以核酸結合復合物或探針的解鏈溫度Tm為依據，或者以雜交液的鹽或離子強度條件為 依據。所述雜交較佳地在標準條件下進行，可根據"分子克隆"中描述的方式進行：Cold SpringHarborLaboratoryPress，分子生物學中的通用方案（CurrentProtocolsin MolecularBiology)。所述多聚核苷酸雜交更佳地可以按照如下步驟進行，將一個載有被 轉錄的待測DNA或RNA分子的膜與一個標記探針在雜交緩沖液中進行雜交。雜交緩沖液的 組成為〇.lwt%SDS、5wt%硫酸右旋糖苷、加入1/20的稀釋抑制劑以及2?8XSSC。20XSSC 為3M氯化鈉和0. 3M的檸檬酸組成的溶液。雜交溫度為50?70°C。在培養幾個小時或過 夜后，用清洗緩沖液清洗膜。清洗溫度較佳地為室溫，優選為雜交溫度。清洗緩沖液的組成 較佳地為6XSSC+0. 1%SDS(wt)溶液，優選為5XSSC+0. 1%SDS(wt)。當用這種清洗緩沖液 將膜清洗后，就可以通過在DNA或RNA分子內被雜交的探針上的標記來識別DNA或RNA分 子。
[0014] 本發明解決上述技術問題采取的技術方案之二是：本發明所述標靶DNA在篩選抗 腫瘤藥物中的應用。
[0015] 其中所述腫瘤為本領域常規腫瘤，較佳地為膽囊癌。其中所述的應用較佳地為，本 發明所述標靶DNA在篩選抗癌藥物的藥物靶點中的用途。
[0016] 其中所述藥物靶點是本領域常規藥物靶點，所述藥物靶點是指藥物在體內的作用 結合位點。合理化藥物設計（rationaldrugdesign)可以依據生命科學研究中所揭示的 包括酶、受體、離子通道、核酸等潛在的藥物作用靶位，或其內源性配體以及天然底物的化 學結構特征來設計藥物分子，以發現選擇性作用于靶點的新藥。通過藥物靶點的選擇和利 用，可以提高篩選抗腫瘤藥物的效率，縮短抗腫瘤藥物研究的周期。
[0017] 本發明解決上述技術問題采取的技術方案之三是：一種重組載體，其中所述重組 載體包含如上所述的標靶DNA或包含序列如SEQIDN0:5,SEQIDN0:6,SEQIDN0:7和 SEQIDN0:8中任意一條所示的DNA分子。
[0018] 其中所述的標靶DNA的制備方法為：人工合成的DNA分子或通過PCR等技術從基 因組中擴增分離到所述DNA分子。本發明所述的重組載體較佳地包含SEQIDN0:5，SEQID N0:6，SEQIDN0:7和SEQIDN0:8中任意一條所示序列的DNA。
[0019] 其中所述的重組載體選自本領域常規的載體。所述重組載體較佳地為由病毒衍生 的載體，所述的病毒衍生的載體較佳地為慢病毒載體、腺病毒載體、腺病毒相關載體、皰疫 病毒載體或痘苗病毒載體，最佳地為慢病毒載體。慢病毒載體能使編碼siRNA的DNA整合 到宿主細胞的基因組中，得以產生特定基因被特異性阻抑的細胞系，某些病毒載體可用于 體內轉化細胞，從而可直接操縱體內和整個生物的基因表達。
[0020] 其中所述慢病毒載體是指以人類免疫缺陷型病毒（HIV)為基礎，通過去除env、 Vif、Vpr、Vpu等毒性基因改造而來的病毒載體。該病毒載體用水泡口炎病毒G糖蛋白來代 替HIV-1的包膜進行包裝，宿主范圍廣，能增加病毒的滴度。慢病毒載體的毒性基因已被刪 除并被外源基因取代，屬于假型病毒，并且該病毒感染細胞后不能再感染其它細胞，生物安 全性高。慢病毒載體對分裂細胞和非分裂細胞均具有感染能力，并可以在體內較長期穩定 的表達。本發明所用的慢病毒載體為本領域常規的慢病毒載體，較佳地為PFH1UGW載體。
[0021] 本發明解決上述技術問題采取的技術方案之四是：一種抑制⑶KL1基因表達的小 分子干擾核糖核酸，其中所述的siRNA包括正義RNA片段和反義RNA片段，所述正義RNA片 段包含如上所述標靶DNA編碼的RNA分子，所述正義RNA片段和反義RNA片段能夠互補形 成雙鏈RNA分子。
[0022] 本發明所述siRNA是本領域常規的siRNA，所述siRNA是一種寡聚RNA分子(長度 一般在21?25核苷酸)，siRNA分子的主要功能是激發與之互補的目標mRNA的沉默。
[0023] 本發明所述siRNA包括正義RNA片段和反義RNA片段，所述正義RNA片段和反義 RNA片段通過彼此間互補堿基的互補配對作用形成雙鏈RNA區域。當正義RNA片段和反義 RNA片段位于不同的RNA鏈時，形成雙鏈RNA分子；當正義RNA片段和反義RNA片段位于同 一條RNA鏈時，則形成具有頸環結構的單鏈RNA分子。本發明所述的小分子干擾核糖核酸 長度較佳地為8?50個核苷酸，其正義片段和反義片段之間互補的堿基對較佳地為15? 18個堿基對。
[0024] 本發明所述siRNA較佳地為：序列表中SEQIDN0:5,SEQIDN0:6,SEQIDN0:7 和SEQIDN0:8任意一條所示的DNA分子或其互補序列所編碼的RNA序列，其中所述互補 〇嫩分子的序列較佳地為序列表中5￡〇10勵:9,5￡〇10勵：10,5￡〇10勵：11和5￡〇10 N0:12所示，所述的siRNA較佳地為互補形成雙鏈的RNA分子或單鏈的RNA分子。
[0025] 本發明中所述的核糖核酸分子（RNA)或者脫氧核糖核酸分子（DNA)通過人工合成 的方式或者通過從基因組擴增的方式獲得，其方法均為本領域常規使用的方法。
[0026] 本發明所述siRNA較佳地包括：人工合成的雙鏈干擾RNA(dsRNA)，轉染細胞后在 細胞內通過Dicer酶系統加工獲得的siRNA;通過人工合成直接獲得的siRNA;或通過構建 相應的慢病毒載體，轉染靶細胞后，在標靶細胞內持續表達獲得的siRNA。
[0027] 本發明解決上述技術問題采取的技術方案之五是：一種慢病毒顆粒，其中所述慢 病毒顆粒包含本發明所述的重組載體。
[0028] 所述慢病毒顆粒（Lentivirus)是以HIV-1 (人類免疫缺陷I型病毒）為基礎發展 起來的基因治療載體。與一般的逆轉錄病毒載體不同，慢病毒顆粒對分裂細胞和非分裂細 胞均具有感染能力。
[0029] 所述慢病毒顆粒的制備方法為本領域常規方法。所述制備方法較佳地包括：將 siRNA干擾的目的片段構建到慢病毒載體中，然后與包裝載體共轉染到真核細胞中，所述 真核細胞較佳地為293T細胞，經過培養后進行慢病毒的回收純化，即得包裝好的慢病毒顆 粒。
[0030] 本發明解決上述技術問題采取的技術方案之六是：一種CDKL1基因沉默的細胞模 型，所述細胞模型包含本發明所述的慢病毒顆粒。
[0031] 本發明所述細胞模型較佳地為真核細胞，更佳地為腫瘤細胞，最佳地為膽囊癌細 胞系SGC-996。本發明所述的CDKL1基因沉默的細胞模型的制備方法較佳地為利用上述慢 病毒顆粒轉染真核細胞。
[0032] 其中所述的轉染方法為本領域常規方法，較佳地為DEAE-葡聚糖法，磷酸鈣法，陽 離子脂質體法，陽離子聚合物法，病毒介導法，生物顆粒傳法(基因槍粒子轟擊法)，顯微注 射法或電穿孔法，本發明所述轉染的方法更佳地為磷酸鈣法。將包裝好的慢病毒顆粒轉染 到細胞系中，進行篩選，得到穩定遺傳的基因沉默細胞模型。
[0033] 本發明的細胞模型的培養方法為本領域常規培養方法，所述培養方法較佳地包括 以下步驟：用10%血清的DMEM培養基，在37°C、含5%C02的細胞培養箱中進行培養，用含 20%血清、10%01^0的01^11培養基作為凍存液凍存細胞，用含0.25%胰酶和0.02°/(￡0了八的 細胞消化液進行消化。
[0034] 本發明解決上述技術問題采取的技術方案之七是：本發明所述的CDKL1基因沉默 的細胞模型在篩選抗癌癥藥物中的應用。
[0035] 所述CDKL1基因沉默的細胞模型在篩選抗腫瘤藥物中的應用較佳地包括以下步 驟：
[0036] (1)使候選藥物與⑶KL1基因沉默的腫瘤細胞接觸；
[0037] (2)檢測腫瘤細胞的數目；
[0038] (3)選擇使腫瘤數目下降的候選藥物。
[0039] 本發明利用未進行⑶KL1基因沉默的普通腫瘤細胞作為對照組。根據本發明，所 述的腫瘤細胞較佳地為膽囊癌細胞系SGC-996。利用本發明建立的細胞模型可進行腫瘤原 發耐藥性機制以及腫瘤增殖和擴增方面的研究。
[0040] 本發明解決上述技術問題采取的技術方案之八是：本發明所述的小分子干擾核糖 核酸在制備抗癌癥藥物中的應用。
[0041] 本發明所述應用較佳地是將小分子干擾核糖核酸作為一種抗癌藥物的靶向藥物。 本發明所述應用較佳地為一種藥物組合物，所述藥物組合物至少包括一種本發明所述的小 分子干擾核糖核酸作為活性成分和一種藥學上可接受的載體。
[0042] 其中所述的藥物組合物制備方法為本領域常規的方法，所述制備方法較佳地為： 將本發明所述siRNA作為活性成分，與藥學上可接受的載體制成各種劑型。其中所述的載 體是本領域常規的藥用載體，如填充劑、稀釋劑和賦形劑等。在各種制劑中，活性成分的重 量含量較佳地為〇. 1%?99. 9%，優選的重量含量為0. 5?90%。
[0043] 其中所述癌癥為本領域常規的癌癥，較佳地為膽囊癌。
[0044] 本發明所用的原料或試劑除特別說明之外，均市售可得。
[0045] 相比于現有技術，本發明的有益效果如下：本發明設計了針對⑶KL1基因RNA 干擾靶點序列，構建相應的⑶KLlshRNA表達載體，其siRNA能夠顯著下調⑶KL1基因 在mRNA水平和蛋白水平的表達。使用慢病毒作為基因操作工具，能夠將RNA干擾載體 pHllUGW-⑶KLl-siRNA靶向高效導入腫瘤細胞，顯著降低⑶KL1基因的表達水平，進而提高 所述腫瘤細胞的化療藥物敏感性，使原發耐藥腫瘤細胞株的增殖能力、致瘤能力和擴散能 力都顯著降低，是腫瘤特別是膽囊癌的潛在臨床非手術治療方式之一。
[0046] 本項專利的申請獲得了如下基金的資助：國家自然科學基金（81172026， 81272402,81172029);上海優秀學科帶頭人項目（11XD1403800) ;863國家科技重大專項 (2012AA022606);中國博士后基金（2012M511107);上海市博士后基金（12R21415300);上海 交通大學醫工交叉項目（YG2011ZD07);上海市科委政府間國際合作項目（12410705900)和 上海市科委醫學引導項目（12401905800)。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0047] 圖1為praiUGW質粒圖譜。
[0048] 圖2用攜帶siRNA的慢病毒感染膽囊癌細胞后的定量PCR結果圖。
[0049] 圖3用攜帶siRNA的慢病毒感染膽囊癌細胞后的Western結果圖。
[0050] 圖4為細胞增殖實驗MTT檢測結果圖。
[0051] 圖5為體外克隆形成實驗結果圖。
[0052] 圖6為轉移小室實驗細胞計數結果圖。
[0053] 圖7為轉移小室實驗檢測吸光值結果圖。
【具體實施方式】
[0054] 實施例1針對⑶KL1設計siRNA序列
[0055] 本發明提供了四條針對CDKL1基因的siRNA作用標靶序列，其序列見表1。
[0056] 表1⑶KL1基因的siRNA作用標靶序列
[0057]
【權利要求】
1. 一種分離的CDKL1基因小分子干擾核糖核酸標靶DNA，其特征在于，所述CDKL1基因 小分子干擾核糖核酸標靶DNA是： (1) ⑶KL1編碼基因上的連續15?27個核苷酸組成的DNA ; (2) 序列如 SEQ ID N0:1，SEQ ID N0:2，SEQ ID N0:3 和 SEQ ID N0:4 中任意一條所示 的DNA ;或 (3) 與（1)或（2)所述的DNA在嚴緊雜交條件下雜交的多核苷酸組成的DNA，或者與其 互補的DNA。
2. 權利要求1所述的CDKL1基因小分子干擾核糖核酸標靶DNA在篩選抗癌癥的藥物中 的應用。
3. 如權利要求2所述的應用，其特征在于，所述癌癥為膽囊癌。
4. 一種重組載體，其特征在于，所述重組載體包含如權利要求1所述的CDKL1基因小 分子干擾核糖核酸標靶〇嫩或包含如序列表中3￡〇10勵:5,3￡〇10勵:6,3￡〇10勵:7和 SEQ ID N0:8任意一條所示的DNA分子。
5. -種抑制CDKL1基因表達的小分子干擾核糖核酸，其特征在于，所述的小分子干擾 核糖核酸包括正義RNA片段和反義RNA片段，所述正義RNA片段包含權利要求1所述標靶 DNA編碼的RNA分子，所述正義RNA片段和反義RNA片段能夠互補形成雙鏈RNA分子。
6. -種慢病毒顆粒，其特征在于，其包含如權利要求4所述的重組載體。
7. -種CDKL1基因沉默的細胞模型，其特征在于，其包含如權利要求6所述的慢病毒顆 粒。
8. 如權利要求7所述的CDKL1基因沉默的細胞模型在篩選抗癌癥的藥物中的應用。
9. 權利要求5所述的抑制CDKL1基因表達的小分子干擾核糖核酸在制備抗癌癥的藥物 中的應用。
10. 如權利要求8或9任一項所述的應用，其特征在于，所述癌癥為膽囊癌。
【文檔編號】A61K48/00GK104342440SQ201310326922
【公開日】2015年2月11日 申請日期:2013年7月30日 優先權日:2013年7月30日
【發明者】劉穎斌, 談竹君, 李茂嵐, 吳向嵩, 翁昊, 束翌俊, 包潤發, 丁倩, 曹陽 申請人:上海交通大學醫學院附屬新華醫院