Btrc基因的應用方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于腫瘤分子生物學領域，具體設及BTRC基因用于制備預測鼻咽癌復發 和轉移，W及防止鼻咽癌復發和轉移的制劑的應用方法。
【背景技術】
[0002] 鼻咽癌（化so地aryngealCarcinoma,NPC)是我國南方地區常見的頭頸部惡性腫 瘤，由鼻咽粘膜上皮發生惡性轉化而來，大多數為低分化鱗狀細胞癌，惡性程度高且發病部 位隱蔽，特別是發生在咽隱窩和鼻咽頂部的患者早期癥狀不明顯，因而難W早期發現，誤診 誤治率較高；另外鼻咽癌極易發生轉移，初診患者頸部淋己結轉移率高達80%。放射治療 是目前鼻咽癌臨床上最常用的治療手段，60~70 %的患者能取得較好的療效，但仍有20~ 30%的患者會出現復發和轉移。復發和轉移是臨床上導致鼻咽癌患者死亡的主要因素之 一，且放化療對治療鼻咽癌的復發、轉移效果不理想，因此，篩選新的鼻咽癌早期轉移及預 后判斷的分子標記物，對于鼻咽癌的臨床治療有著重要的指導意義，同時相比較傳統的放 化療手段，生物治療的方法更適合復發和轉移鼻咽癌的治療，其中基因療法對防治鼻咽癌 的復發、轉移具有更重要而廣闊的臨床應用前景，篩選鼻咽癌基因治療的祀點也同樣意義 重大。
[0003] 我們通過基因忍片技術，篩選到了BTRC基因（GenebankGene10:8945 ;參考序列： NM033637. 3)在鼻咽癌中表達下調。迄今為止有關BTRC與鼻咽癌發生發展中的作用的關 系及其在鼻咽癌病人的早期篩查、輔助診斷或者療效預測等方面均沒有文獻報道。我們通 過研究表明，BTRC在鼻咽癌組織中的表達水平與鼻咽癌的侵襲轉移及預后密切相關，鼻咽 癌組織中BTRC基因表達水平較低的患者更容易復發和轉移，因而生存時間較BTRC基因表 達水平高的患者更短。表明BTRC基因可W作為鼻咽癌輔助診斷、療效預測及預后判斷等的 分子標記，針對BTRC設計專用巧光實時定量PCR引物、原位雜交探針及免疫組織化學檢測 試劑盒等，用于檢測鼻咽癌組織中BTRC的表達水平有望為臨床上對鼻咽癌進行復發和轉 移的預測提供參考。
[0004] 此外，我們在鼻咽癌細胞中轉染人工合成的BTRC基因干擾序列（siRNA)W抑制 BTRC基因的表達，證實在鼻咽癌細胞株中下調BTRC基因的表達可W促進鼻咽癌細胞的 侵襲轉移；通過設計并構建BTRC基因的過表達載體，成功地在鼻咽癌細胞中表達BTRC基 因，可W有效地抑制鼻咽癌細胞的侵襲與轉移能力；通過一系列研究，申請人進一步證實 了BTRC基因編碼一個名為β-TrCP化eta-transducinrepeatcontainingE3ubiquitin proteinligase)的E3 泛素蛋白連接酶巧3ubiquitinproteinligase)，P-TrCP是細 胞內蛋白經泛素化途徑降解過程中的關鍵酶之一，可較特異地調控它的底物β-catenin 和Snail經泛素化途徑降解，從而維持β-catenin和Snail運兩個蛋白在細胞中的含量。 β-catenin、Snail是細胞上皮-間質轉換（epithelial-mesenchymaltransition,EMT) 過程中的關鍵調控因子，而上皮-間質轉換又是腫瘤細胞發生侵襲轉移的最為關鍵的第一 步。因此，申請人通過研究證實了鼻咽癌細胞中BTRC表達下調，導致其編碼的β-TrCP蛋 白量減少，β-TrCP的底物β-catenin和Snail的降解減慢，造成β-catenin和Snail在 細胞內聚集，推動了鼻咽癌細胞的上皮-間質轉換，使鼻咽癌細胞具備更強的侵襲與轉移 能力，從而表現為鼻咽癌患者的復發轉移，最終導致患者死亡。在鼻咽癌細胞中通過基因工 程的手段重新表達BTCR，則可W明顯地抑制鼻咽癌細胞的侵襲與轉移能力。因此，BTRC基 因W及其下游包括β-catenin和Snail在內的細胞上皮-間質轉換相關信號通路又可W 成為鼻咽癌基因治療的潛在祀點，特別是BTRC過表達載體在鼻咽癌的基因治療中具有重 要的應用前景。將BTRC基因過表達載體負載到多聚賴氨酸修飾的娃納米顆粒上制成納米 基因轉運體，多聚賴氨酸修飾的娃納米顆粒可保護BTRC基因過表達載體免受核酸酶降解， 延長作用時間，且有更高的轉染效率。進而為制備防治鼻咽癌的復發和轉移的制劑提供新 的途徑。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的是提供BTRC基因的應用方法。
[0006] BTRC基因的應用方法，用于制備預測鼻咽癌復發和轉移的制劑。
[0007] 所述的BTRC基因的表達與鼻咽癌復發和轉移成負相關。
[0008] 所述的預測鼻咽癌復發和轉移的制劑包括：PCR檢測試劑、原位雜交檢測試劑或 免疫組織化學試劑。
[0009] PCR檢測試劑為巧光實時定量PCR試劑。
[0010] 巧光實時定量PCR試劑所用的引物包括：
[0011] BTRCforward, 5' -CCCCTTCTCGAACATACACCT-3'，
[0012] BTRCreverse, 5'-AGTCTCAAAGCCCTGCTCCT-3'
[0013] GAP畑forward, 5> -AACGGATTTGGTCGTATTGG-3>，
[0014] GAPDHreverse, 5' -TTGATTTTGGAGGGATCTCG-3,。
[0015] 原位雜交檢測試劑的寡核巧酸探針及陽性對照的寡核巧酸探針，序列如下：
[0016] BTRC探針 1 :5' -GTCTAAGTGAATTCTTCTCTGGTATTATCT-3'
[0017] BTRC探針 2 :5' -GTACTTGTGTTCCATACCTTTATAGTTCTA-3'
[0018] BTRC探針 3 :5' -ATCTCCAATTAGATTCTATTGTCTCAATGT-3'
[0019] GAP畑探針 1 :5' -CCACTTTACCAGAGTTAAAAGCAGCCCTGG-3'
[0020] GAP畑探針 2 :5' -CAGTAGAGGCAGGGATGATGTTCTGGAGAG-3'
[0021] GAP畑探針 3 :5' -GTCAGAGGAGACCACCTGGTGCTCAGTGTA-3'。
[0022] BTRC基因的應用方法，還能用于制備防止鼻咽癌復發和轉移的制劑。具體是用于 制備BTRC基因表達產物β-TrCP的底物β-catenin和Snai1的降解的制劑。更具體是用于 制備抑制上皮-間質轉換制劑。該制劑促進BTRC基因的表達能使上皮細胞的標志物Z0-1、 E-ca化erin和Claudin-1的表達升高，而間質細胞的標志物ZEB1、N-ca化erin、Vimentin 及Slug的表達降低。
[0023] 本發明研究表明，BTRC在鼻咽癌組織中的表達水平與鼻咽癌的侵襲轉移及預后成 負相關，鼻咽癌組織中BTRC基因表達水平較低的患者更容易復發和轉移，因而生存時間較 BTRC基因表達水平高的患者更短。表明BTRC基因可W作為鼻咽癌輔助診斷、療效預測及預 后判斷等的分子標記，針對BTRC設計專用巧光實時定量PCR引物、原位雜交探針及免疫組 織化學檢測試劑盒等，用于檢測鼻咽癌組織中BTRC的表達水平有望為臨床上對鼻咽癌進 行復發和轉移的預測提供參考。
[0024] 本發明還證實在鼻咽癌細胞株中下調BTRC基因的表達可W促進鼻咽癌細胞的侵 襲轉移；通過設計并構建BTRC基因的過表達載體，成功地在鼻咽癌細胞中表達BTRC基因， 可W有效地抑制鼻咽癌細胞的侵襲與轉移能力。進而為制備防治鼻咽癌的復發和轉移的制 劑提供新的途徑。
【附圖說明】
[00巧]圖1為利用基因忍片技術從6例正常鼻咽上皮組織和10例鼻咽癌組織中篩選得 到的差異表達基因圖譜；
[0026] 共篩選得到差異表達基因2461個，其中在鼻咽癌中表達上調的基因與1677個，在 鼻咽癌中下調的基因有784個；N代表正常鼻咽上皮組織，T代表鼻咽癌組織。
[0027] 圖2為基因忍片數據中BTRC基因在正常鼻咽上皮組織和鼻咽癌組織中的表達情 況，BTRC基因在鼻咽癌組織中的表達明顯下調（P= 0. 001);
[0028]N代表正常鼻咽上皮組織，T代表鼻咽癌組織。
[0029] 圖3為利用巧光實時定量PCR技術驗證了BTRC基因在正常鼻咽上皮組織和鼻咽 癌組織中的表達情況，BTRC基因在鼻咽癌組織中的表達明顯下調（P<0. 05);
[0030]N代表正常鼻咽上皮組織（共9例），T代表鼻咽癌組織（共28例）。
[0031] 圖4為免疫組織化學方法檢測BTRC在鼻咽癌及正常鼻咽上皮中的表達情況；
[003引正常鼻咽上皮（Non-tumorNP巧中BTRC表達水平較高（positive)，而在106例鼻 咽癌（NPC)中有48例檢測到BRTC的低表達化OW)，其余58例為高表達Oii曲）。
[0033] 圖5為原位雜交檢測BTRC在鼻咽癌及正常鼻咽上皮中的表達情況；
[0034] 原位雜交的結果與免疫組織化學結果具有很高的一致性。
[003引圖6為鼻咽癌中BTRC的表達與鼻咽癌患者預后的關系；
[0036] 鼻咽癌中BTRC的表達與鼻咽癌患者的預后密切相關，BTRC高表達化i曲）的患 者不論無病生存時間值isease化eesurvival,DFS，左）還是總的生存時間（Overall survival,0S，右）都要明顯長于BTRC低表達(X〇w)的患者。
[0037] 圖7為在鼻咽癌細胞Η肥2、5-8F和C666-1中導入BTRC過表達載體度TRC0巧和 RNA干擾序列（siBTRC)后，實時巧光定量PCR方法檢測了鼻咽癌細胞中BTRC的表達情況 (mRNA水平），導入BTRC過表達載體后，BTRC基因的表達顯著升高（左），而導入RNA干擾 序列后，BTRC基因的表達顯著降低（右），NC為陰性對照（negativecontrol)。
[0038] 圖8為在鼻咽癌細胞Η肥2、5-8F和C666-1中導入BTRC過表達載體度TRC0巧和 RNA干擾序列（siBTRC)后，Westernbloting方法檢測了鼻咽癌細胞中BTRC的表達情況 (蛋白水平），導入BTRC過表達載體后BTRC基因的表達顯著升高（左），而導入RNA干擾序 列后BTRC基因的表達顯著降低（右），NC為陰性對照（negativecontrol)。
[0039] 圖9為在鼻咽癌細胞Η肥2、5-8F和C666-1中導入BTRC過表達載體度TRC0巧和 RNA干擾序列（SiBTRC)后，細胞穿膜（transwell)實驗證實，人為促進BTRC的表達后，能穿 過基質膠膜的鼻咽癌細胞數目顯著降低，表明細胞侵襲能力減弱