大熊貓白細胞介素7基因il-7免疫佐劑的構建方法
【專利摘要】本發明公開了一種大熊貓白細胞介素7基因IL-7免疫佐劑的構建方法，包括以下步驟：從大熊貓外周血中分離出淋巴細胞，通過刀豆蛋白A(ConA)刺激培養后，首次PCR擴增得到大熊貓白細胞介素7基因，并克隆到真核表達載體pCI-neo，構建了真核表達質粒pCI-IL-7，其表達的IL-7作為疫苗佐劑能顯著增強乙型腦炎病毒(JEV)核酸疫苗誘導的免疫應答，特別是體液免疫應答，能提高乙型腦炎病毒疫苗以及其他常規疫苗的免疫效果，控制疾病的發生與流行，保護大熊貓的健康。
【專利說明】大熊貓白細胞介素7基因IL-7免疫佐劑的構建方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物【技術領域】，尤其涉及的是一種大熊貓白細胞介素7(IL-7)基因IL-7免疫佐劑的構建方法。
【背景技術】
[0002]IL-7又名前B細胞生長因子、淋巴細胞生成素，是骨髓基質細胞和胸腺基質細胞產生的細胞因子，能促進淋巴細胞早期增值和分化和誘導巨噬細胞增值。在動物的脾臟、胸腺、骨髓和腎臟中都能檢測到IL-7。
[0003]IL-7是B細胞生長和極早期B細胞生存、分化、增殖因子。IL_7也能在某些因素(如:輻射或免疫抑制劑)所致的應激加快B細胞的恢復。IL-7能誘導不成熟的T細胞增殖和分化，誘導胸腺細胞中⑶4+、⑶8+、⑶3+、⑶2+、SCA-1+的細胞優勢擴增。IL-7也能引起外周⑶4+或⑶8+T細胞增殖，其中⑶45R0+的記憶T細胞增殖更明顯。IL-7還能誘導外周T細胞分泌IL-2，表達IL-2受體(IL-2R)和轉鐵蛋白受體，促進細胞分泌白細胞介素(L1-4)和粒細胞-巨噬細胞克隆刺激因子(GM-CSF)。
[0004]IL-7不僅對T、B淋巴細胞內環境的穩定性起重要作用，同時也對其他細胞譜系(如抗原遞呈細胞)的生存和分化起重要作用。L1-7還對巨噬細胞起作用，作用包括:直接誘導巨噬細胞表達IL-18和巨噬細胞炎癥蛋白1β ;誘導巨噬細胞產生IL-6、IL-1a、IL-1 β和TNF-a ;增強單核細胞在體外溶解靶細胞的能力。
[0005]IL-7的生物學活性決定了它的很多用途。IL-7可作為疫苗免疫佐劑，促進B細胞生長和分化，誘導不成熟的T細胞增殖和分化，增強疫苗對機體的刺激效應，提高保護力。IL-7還可作為免疫調節劑，誘導TNF- a及TNF- β分泌，抑制IL-4及IL-10合成，從而調節Thl/Th2 平衡。
[0006]IL-7在抗腫瘤免疫治療有潛在的價值。目前雖未見體外直接應用IL-7抑制腫瘤細胞增殖的報道，但IL-7體內應用則有一定的抗腫瘤活性。還有研究證明中國HIV/AIDS患者IL-7水平的升高，加速了艾滋病疾病進展，血漿IL-7含量可作為判斷HIV疾病進展的一個標志。
[0007]隨著基因克隆技術和生物信息學軟件使用的成熟和完善，基因克隆不再是難題。通過IL-7基因的克隆及高效表達，得到大量純化重組IL-7已經很容易成為現實，這將一步推動對IL-7生物活性的研究。目前對淋巴細胞生成的最初階段尚知之甚少，可以通過對多種動物IL-7基因進行克隆和比較分析，加深對其的認識。細胞因子作為一種新型的免疫佐劑，將會為動物疾病的免疫預防和免疫治療提供廣闊的應用前景。
【發明內容】
[0008]本發明所要解決的技術問題是針對現有技術的 不足提供一種大熊貓白細胞介素7基因IL-7免疫佐劑的構建方法。
[0009]本發明的技術方案如下:[0010]一種大熊貓白細胞介素7基因IL-7免疫佐劑的構建方法，包括以下步驟:
[0011] Al IL-7基因的PCR克隆
[0012]All IL-7基因的引物設計及合成
[0013]根據NCBI上公布的預測的熊貓IL-7基因序列，通過在線信號肽預測軟件找出分析出其信號肽，設計一對引物，擴增成熟的IL-7基因；
[0014]11:GAATTCACCATGGATTGTGATATTGAAGGTAAAGACG ；
[0015]12: GTCGACTTAATGCTCTTTAGAGCCCCTC ；
[0016]A12大熊貓外周血淋巴細胞RNA的提取；
[0017]A121外周血淋巴細胞的分離和培養；
[0018]通過下列方法進行刺激培養，增加細胞因子的轉錄翻譯:
[0019](I)采大熊貓靜脈血2ml加入肝素抗凝管；
[0020](2)輕輕搖動抗凝管，使血液與抗凝劑混勻，5min后加入2ml Hank’ s液，手動輕輕搖勻；
[0021](3)用毛細吸管吸取稀釋后的抗凝血，全部沿管壁緩慢加至另一含4ml淋巴細胞分離液的試管液面上，注意保持兩種液體界面清晰；
[0022](4)將試管平衡后置水平式離心機，40C，2000rpm離心IOmin ；
[0023](5)用毛細吸管仔細吸取血漿與分離液界面處淋巴細胞層至一刻度離心管內；
[0024](6)加入Hank’s液5ml,手動旋轉試管使液體混勻，2000rpm離心IOmin,棄上清；
[0025](7)用 5ml Hank，s 重懸，2000rpm 離心 IOmin,棄上清；
[0026](8)用5ml含10%血清的1640營養液重懸淋巴細胞后轉移至細胞瓶中，置370C CO2培養箱培養，半小時后加入刀豆蛋白conA，使其終濃度為7ug/ml ；
[0027](9)置37 °C CO2培養箱懸浮培養72小時；
[0028]A122 RNA 的提取；
[0029]A13 IL-7基因的擴增；
[0030]A2 pMD-1L-7 質粒的構建；
[0031]A21連接和轉化；
[0032]取pMD19-T載體和回收的IL_7的cDNA，于16°C連接過夜，然后將連接產物轉化到DH5a ；
[0033]A22pMD-1L-7重組質粒的鑒定；
[0034]將酶切鑒定為陽性的重組質粒送寶生物工程(大連)有限公司進行測列，將測序正確的質粒命名為pMD-1L-7 ；
[0035]A3 pC1-1L-7真核表達質粒的構建；
[0036]A31 IL-7基因的酶切回收；
[0037]用EcoR I和Sal I對pMD_IL_7進行雙酶切；酶切產物經I %的瓊脂糖凝膠電泳后，用膠回收試劑盒回收目的基因；
[0038]A32 pC1-neo載體的酶切回收
[0039]用EcoR I和SaL I對pC1-neo進行雙酶切；酶切產物通過I %瓊脂糖凝膠電泳后，用膠回收試劑盒回收5400bp左右的載體基因；
[0040]A33連接與轉化[0041]取酶切回收的pC1-neo載體片段和酶切回收的IL-7目的基因，于16°C連接過夜，然后通過熱激法轉化到DH5 α ；
[0042]Α34重組質粒的鑒定
[0043]將轉化好的菌擴大培養后，小量提取質粒，用EcoR I和Sal I對重組質粒進行雙酶切鑒定；用1%的瓊脂糖凝膠電泳，并在紫外燈下觀察電泳圖；將酶切鑒定為陽性的重組質粒送寶生物工程(大連)有限公司測序，將測序正確的質粒命名為pC1-1L-7。
[0044]本發明從大熊貓外周血中分離出淋巴細胞，通過刀豆蛋白A(ConA)刺激培養后，首次PCR擴增得到大熊貓白細胞介素7基因，并克隆到真核表達載體pC1-neo，構建了真核表達質粒PC1-1L-7，其表達的IL-7作為疫苗佐劑能顯著增強乙型腦炎病毒(JEV)核酸疫苗誘導的免疫應答，特別是體液免疫應答，能提高乙型腦炎病毒疫苗以及其他常規疫苗的免疫效果，控制疾病的發生與流行，保護大熊貓的健康。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0045]圖1為IL-7基因的擴增；1:IL-7擴增產物，M:DL2000 ；
[0046]圖2 為 pMD-1L-7 的酶切鑒定；1:pMD-1L_7 酶切產物，M:DL2000 ；
[0047]圖3為pC1-1L-7的雙酶切鑒定；1:pC1-1L_7酶切產物，M:DL2000 ；
[0048]圖4為小鼠JEV抗體的標準曲線；
[0049]圖5為小鼠IL-4抗體的標準曲線；
[0050]圖6為小鼠IFN- Y抗體的標準曲線；
【具體實施方式】
[0051]以下結合具體實施例，對本發明進行詳細說明。
[0052]1.1 pC1-1L-7免疫佐劑的構建
[0053]1.1.1 IL-7 基因的 PCR 克隆
[0054]1.1.1.1 IL-7基因的引物設計及合成
[0055]根據NCBI上公布的預測的熊貓IL-7基因序列(序列編號為ΧΜ_002924920.I)，通過在線信號肽預測軟件找出分析出其信號肽，設計一對引物，擴增成熟的IL-7基因。
[0056]11:GAATTCACCATGGATTGTGATATTGAAGGTAAAGACG (劃線部分是 EcoR I 酶切位點，加粗部分是Kozak序列)
[0057]12:GTCGACTTAATGCTCTTTAGAGCCCCTC (劃線部分是 Sal I 酶切位點)
[0058]引物送由寶生物工程(大連)有限公司合成，預計擴增片段約400bp。
[0059]1.1.1.2大熊貓外周血淋巴細胞RNA的提取
[0060]1.1.1.2.1外周血淋巴細胞的分離和培養
[0061]細胞因子在正常外周血的淋巴細胞中分泌量很少，即mRNA的含量較低，故通過下列方法進行刺激培養，增加細胞因子的轉錄翻譯:
[0062](I)采大熊貓靜脈血2ml加入肝素抗凝管；
[0063](2)輕輕搖動抗凝管，使血液與抗凝劑混勻(若出現凝集則不能繼續實驗)，5min后加入2ml Hank’ s液,手動輕輕搖勻；
[0064](3)用毛細吸管吸取稀釋后的抗凝血，全部沿管壁緩慢加至另一含4ml淋巴細胞分離液的試管液面上，注意保持兩種液體界面清晰；
[0065](4)將試管平衡后置水平式離心機，40C，2000rpm離心IOmin ；
[0066](5)用毛細吸管仔細吸取血漿與分離液界面處淋巴細胞層至一刻度離心管內；
[0067](6)加入Hank’s液5ml,手動旋轉試管使液體混勻，2000rpm離心IOmin,棄上清；
[0068](7)用 5ml Hank，s 重懸，2000rpm 離心 IOmin,棄上清； [0069](8)用5ml含10%血清的1640營養液重懸淋巴細胞后轉移至細胞瓶中，置370C CO2培養箱培養，半小時后加入刀豆蛋白(conA)，使其終濃度為7ug/ml ；
[0070](9)置37°C CO2培養箱懸浮培養72小時。
[0071]1.1.1.2.2 RNA 的提取
[0072]吹打混勻懸浮培養的細胞瓶中的液體，將其全部吸入滅菌的離心管中，2000rpm離心IOmin后用適當的無RNA酶水重懸，取200 μ L至EP管中后加入200 μ L裂解液，搖晃混勻，靜置約IOmin ;加入350 μ L Blue Buffer，輕輕翻轉混勻3-4次，70°C水浴2min, 12000轉，4攝氏度離心IOmin ;將裂解液上清轉移至新的EP管中；加入200 μ L95%乙醇顛倒混勻后，全部吸取到吸附柱中，靜置lmin，12000rpm，4°C離心Imin ;加入600 μ L洗滌液，12000轉，4攝氏度離心Imin ;按說明書配制DNA酶I,每個吸附柱中加入50 μ L配制好的DNA酶I，室溫作用20min ;加入200 μ L終止液，12000轉，4攝氏度離心Imin ;加入600 μ L洗滌液，12000轉，4攝氏度離心Imin ;加入250 μ L洗滌液，12000轉，4攝氏度離心Imin ;倒去收集管中液體后空載離心2min ;加入100 μ L無核酸酶水后靜置幾分鐘后12000轉，4攝氏度離心Imin即得到mRNA模板。以上操作均應在超凈工作臺中無風條件下進行。
[0073]1.1.1.3 IL-7 基因的擴增
[0074]1.1.1.3.1 mRNA 的反轉錄
[0075]用上一步驟中所得mRNA為模板，加入反轉錄試劑，按表1所示。將PCR管放入PCR儀，經37°C反轉錄15min ;85。C滅活5s。
[0076]表1反轉錄體系
[0077]
【權利要求】
1.一種大熊貓白細胞介素7基因IL-7免疫佐劑的構建方法，其特征在于，包括以下步驟: Al IL-7基因的PCR克隆 All IL-7基因的引物設計及合成 根據NCBI上公布的預測的熊貓IL-7基因序列，通過在線信號肽預測軟件找出分析出其信號肽，設計一對引物，擴增成熟的IL-7基因；
11:GAATTCACCATGGATTGTGATATTGAAGGTAAAGACG ；
12:GTCGACTTAATGCTCTTTAGAGCCCCTC ； A12大熊貓外周血淋巴細胞RNA的提取； A121外周血淋巴細胞的分離和培養； 通過下列方法進行刺激培養，增加細胞因子的轉錄翻譯: (1)采大熊貓靜脈血2ml加入肝素抗凝管；(2)輕輕搖動抗凝管，使血液與抗凝劑混勻，5min后加入2mlHank’s液，手動輕輕搖勻； (3)用毛細吸管吸取稀 釋后的抗凝血，全部沿管壁緩慢加至另一含4ml淋巴細胞分離液的試管液面上，注意保持兩種液體界面清晰； (4)將試管平衡后置水平式離心機，4°C，2000rpm離心IOmin； (5)用毛細吸管仔細吸取血漿與分離液界面處淋巴細胞層至一刻度離心管內；(6)加入Hank’s液5ml,手動旋轉試管使液體混勻，2000rpm離心IOmin,棄上清； (7)用5ml Hank，s 重懸，2000rpm 離心 IOmin,棄上清； (8)用5ml含10%血清的1640營養液重懸淋巴細胞后轉移至細胞瓶中，置37°CCO2培養箱培養，半小時后加入刀豆蛋白conA,使其終濃度為7ug/ml ； (9)置370C CO2培養箱懸浮培養72小時； A122 RNA的提取； A13 IL-7基因的擴增； A2 pMD-1L-7質粒的構建； A21連接和轉化； 取PMD19-T載體和回收的IL-7的cDNA，于16 °C連接過夜，然后將連接產物轉化到DH5a ； A22 pMD-1L-7重組質粒的鑒定； 將酶切鑒定為陽性的重組質粒送寶生物工程(大連)有限公司進行測列，將測序正確的質粒命名為pMD-1L-7 ； A3 pC1-1L-7真核表達質粒的構建； A31 IL-7基因的酶切回收； 用EcoR I和Sal I對pMD_IL_7進行雙酶切；酶切產物經I %的瓊脂糖凝膠電泳后，用膠回收試劑盒回收目的基因； A32 pC1-neo載體的酶切回收 用EcoR I和Sal I對pC1-neo進行雙酶切；酶切產物通過I %瓊脂糖凝膠電泳后，用膠回收試劑盒回收5400bp左右的載體基因；A33連接與轉化 取酶切回收的pC1-neo載體片段和酶切回收的IL-7目的基因，于16°C連接過夜，然后通過熱激法轉化到DH5a ； A34重組質粒的鑒定 將轉化好的菌擴大培養后，小量提取質粒，用EcoR I和Sal I對重組質粒進行雙酶切鑒定；用1%的瓊脂糖凝膠電泳，并在紫外燈下觀察電泳圖；將酶切鑒定為陽性的重組質粒送寶生物工程(大連)有限 公司測序，將測序正確的質粒命名為pC1-1L-7。
【文檔編號】A61P31/14GK103589746SQ201310362836
【公開日】2014年2月19日 申請日期:2013年8月16日 優先權日:2013年8月16日
【發明者】李德生, 朱玲, 張和民, 王承東, 古鋒, 劉驍 申請人:四川臥龍國家級自然保護區管理局, 四川農業大學