一種含人Rad51C啟動子的載體及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明涉及一種含人Rad51C啟動子的載體及其應用，包括Rad51C啟動子序列和編碼具有腫瘤治療作用的效應蛋白的核酸序列，Rad51C啟動子序列如SEQ?IDNo：1所示，編碼具有腫瘤治療作用的效應蛋白的核酸序列的轉錄過程由Rad51C啟動子調控；本發明還公開了該核酸序列在治療腫瘤藥物中的應用。與現有技術相比，本發明提供了一種含人Rad51C啟動子的核酸序列，并通過分子克隆的手段將Rad51C啟動子和編碼DTA的開放閱讀框整合構成的質粒載體轉染進入細胞，能夠明顯殺傷腫瘤細胞，而對正常細胞基本無影響。
【專利說明】一種含人Rad51C啟動子的載體及其應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種載體及其應用，尤其是涉及一種含人Rad51C啟動子的載體及其應用。
【背景技術】
[0002]腫瘤治療的目的在于能夠選擇性地殺傷或者清除惡性增殖細胞而不對正常細胞造成傷害。在2000年，有文獻報道根據端粒酶hTER和hTERT在腫瘤細胞中具有活性而在正常細胞中沒有活性的特點，利用hTER和hTERT的轉錄調節序列來調控外源毒性基因在膀胱癌細胞中的表達，從而選擇性殺傷腫瘤細胞。隨后Christopher等人利用重組酶蛋白Rad51在腫瘤細胞中的高表達的 特點，也成功實現了在體內體外，轉錄水平上靶向抗腫瘤的治療。
[0003]重組酶Rad51是大腸桿菌RecA的同源蛋白質，它通過介導DNA鏈配對以及鏈交換而參與DNA的同源重組修復。在人類中Rad51有5種家族成員XRCC2、XRCC3、Rad51B /Rad51Ll、Rad51C / Rad51L2、Rad51D / Rad51L3，它們對于形成 DNA 損傷誘導的 Rad51foci的組裝是必須的。它們形成兩個復合體，輔助Rad51進行DNA雙鏈斷裂中的同源重組修復，并且依賴于BRCA-1和BRCA-2途徑輔助。這一同源同組修復過程還需要其他的蛋白Rad52，Rad54，Rad55，Rad57，RPA的幫助。因此這些蛋白質也有可能具有與Rad51相同的表達特異性，也存在潛在的靶向抗腫瘤的應用。
【發明內容】
[0004]本發明的目的就是為了克服上述現有技術存在的缺陷而提供一種含人Rad51C啟動子的載體及其應用。
[0005]本發明的目的可以通過以下技術方案來實現:
[0006]一種含人Rad51C啟動子的載體，包括Rad51C啟動子序列和編碼具有腫瘤治療作用的效應蛋白的核酸序列，所述的Rad51C啟動子序列如SEQ ID No:1所示,與序列相同或者具有90%相似性的序列均為該專利的保護范圍。
[0007]所述的編碼具有腫瘤治療作用的效應蛋白的核酸序列的轉錄過程由Rad51C啟動子調控。
[0008]所述的Rad51C啟動子序列為人類的Rad51C蛋白的啟動子序列。
[0009]所述的具有腫瘤治療作用的效應蛋白為有毒蛋白。
[0010]所述的有毒蛋白包括白喉毒素蛋白A鏈(DTA)、蓖麻毒蛋白、凋亡家族蛋白caspase3、caspase6、caspase7、caspase8。白喉毒素蛋白 A鏈(DTA)是ADP-核糖轉移酶，能夠抑制真核生物蛋白合成，具有高毒性和廣毒性，可以通過組織特異性表達殺傷腫瘤細胞；蓖麻毒蛋白(ricin)是蓖麻種子中的一種毒蛋白，它由分子量分別為32KD和34KD的A、B兩條鏈組成，分別為效應鏈和連接鏈，是真核細胞核糖體失活蛋白，可以抑制多種腫瘤細胞的蛋白質合成,具有很強的細胞毒性；凋亡蛋白家族的成員caspase3、caspase6、caspase7、caspase8是能夠引起細胞程序性死亡的蛋白酶。也可以應用于特異性殺傷腫瘤細胞。[0011 ] 作為優選，所述的有毒蛋白為白喉毒素蛋白A鏈。當有毒蛋白為白喉毒素蛋白A鏈時，該載體的序列如SEQ ID No:2所示。
[0012]一種含人Rad51C啟動子的載體在治療腫瘤藥物中的應用。
[0013]通過腫瘤細胞中特異性高表達的Rad51C的啟動子驅動有毒蛋白DTA在腫瘤細胞中的高表達而針對性地殺傷腫瘤細胞。DTA的開放式閱讀框序列如SEQ IDNo:3所示。
[0014]與現有技術相比，本發明提供了一種含人Rad51C啟動子的核酸序列，并提供了該核酸序列在治療腫瘤藥物中的應用。將Rad51C啟動子和編碼DTA的開放閱讀框整合構成的質粒載體轉染進入細胞，能夠明顯殺傷腫瘤細胞，而對正常細胞基本無影響。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0015]圖1-1為Rad51、Rad51C、Rad51D和Rad52的mRNA在14株細胞中的表達水平分析結果;
[0016]圖1-2為Rad51B、Rad51C、Rad51D和Rad52的mRNA在正常細胞系和腫瘤細胞系的表達水平統計學差異分析結果；
[0017]圖2-1 為 Western blot 結果圖；
[0018]圖2-2為Rad51C蛋白質和Actin蛋白質的表達條帶進打量化，并用內參進打標準化分析結果；
[0019]圖2-3為Rad51C在正常細胞系和腫瘤細胞系的表達水平Mann-whitney檢驗分析
結果;
[0020]圖3-1為pRad5IC-EGFP質粒構建流程圖；
[0021]圖3-2為pRad5IC-Luc質粒構建流程圖；
[0022]圖3-3為pRad5IC-DTA質粒構建流程圖；
[0023]圖4-1 為 pRad5IC-EGFP 質粒的圖譜；
[0024]圖4-2為pRad51C_EGFP質粒中EGFP在14株細胞中的表達情況；
[0025]圖4-3為對正常細胞組和腫瘤細胞組中的EGFP的表達進行差異分析結果；
[0026]圖4-4為pRad51C_Luc質粒的圖譜；
[0027]圖4-5為pRad51C_Luc質粒中Luc在14株細胞中的表達情況；
[0028]圖4-6為對正常細胞組和腫瘤細胞組中的Luc的表達進行差異分析結果；
[0029]圖5-1為pRad5IC-DTA質粒的圖譜；
[0030]圖5-2為pRad51C_DTA質粒轉染以后對細胞存活率的影響。
【具體實施方式】
[0031]下面結合附圖和具體實施例對本發明進行詳細說明。
[0032]實施例
[0033]一、Real-time-PCR(實時定量 PCR)
[0034]通過實時定量PCR的方法比較Rad51的同系物在正常細胞和腫瘤細胞中的表達情況。
[0035]Rad51 的同系物包括 Rad51B、Rad51C、Rad51D、Rad52。
[0036]其中正常細胞組:WIT和MRT是肺成纖維細胞，MJT是皮膚成纖維細胞，HMECUHMEC2、HMEC3、HMEC4是乳腺上皮細胞，腫瘤細胞組=Hela是人類宮頸癌細胞，GP2-293則是人胚腎細胞，HT1080是人類纖維肉瘤細胞，MCF-7、MDA-MB-231、HCC1954、T47D則是人乳腺
上皮癌細胞。
[0037]實時定量PCR具體方法如下:
[0038]取對數生長期的細胞,用Tr1-reagent (sigma)裂解細胞,按照使用說明提取RNA,用Nanodrop檢測濃度和質量,隨后取I μ gRNA,與隨機引物、gDNAremover、反轉錄酶及相應的buffer (緩沖液)等(北京全式基因，AT311)混合，25°C孵育10分鐘，42°C孵育30分鐘，85°C加熱5分鐘使酶失活，得到cDNA并檢測濃度，稀釋后進行Real time PCR反應。針對Rad51B、Rad51C、Rad51D 和 Rad52 設計引物(見表 I)，Real time PCR 反應采用 50ng cDNA與相應的引物，與Takara的SYBERGreen試劑盒按照比例相混合，ABI7500系統檢測。每個基因對應的Ct值都用內參基因GAPDH校準，得到相應的表達量。
[0039]Rad51的同系物在正常細胞和腫瘤細胞中的表達情況如圖1_1與圖1_2所示，圖1-1是Rad51B、Rad51C、Rad51D和Rad52的mRNA在上述14株細胞中的表達水平。圖1_2是對Rad51B、Rad51C、Rad51D和Rad52的mRNA在正常細胞系和腫瘤細胞系的表達水平的比較，使用Mann-whitney進行統計學差異分析。
[0040]由實驗結果可以看到，Rad51B、Rad51C、Rad51D和Rad52在腫瘤細胞組中的表達水平普遍高于正常細胞組，通過Mann-whitney檢驗,發現Rad51C的表達在腫瘤細胞組上調明顯，與正常細胞組相比，統計學差異極其顯著(p〈0.01)。因而選擇Rad51C為研究目標進行
下一步實驗。
[0041]表1Real time-PCR 引物
[0042]
【權利要求】
1.一種含人Rad5ic啟動子的載體，其特征在于，包括Rad51C啟動子序列和編碼具有腫瘤治療作用的效應蛋白的核酸序列，所述的Rad51C啟動子序列如SEQ ID No:1所示。
2.根據權利要求1所述的一種含人Rad51C啟動子的載體，其特征在于，所述的編碼具有腫瘤治療作用的效應蛋白的核酸序列的轉錄過程由Rad51C啟動子調控。
3.根據權利要求1所述的一種含人Rad51C啟動子的載體，其特征在于，所述的Rad51C啟動子序列為人類的Rad51C蛋白的啟動子序列。
4.根據權利要求1所述的一種含人Rad51C啟動子的載體，其特征在于，所述的具有腫瘤治療作用的效應蛋白為有毒蛋白。
5.根據權利要求4所述的一種含人Rad51C啟動子的載體，其特征在于，所述的有毒蛋白包括白喉毒素蛋白A鏈、蓖麻毒蛋白、凋亡家族蛋白caspase3、caspase6、caspase7、caspase8。
6.根據權利要求5所述的一種含人Rad51C啟動子的載體，其特征在于，所述的有毒蛋白為白喉毒素蛋白A鏈。
7.根據權利要求6所述的一種含人Rad51C啟動子的載體,其特征在于,該載體的序列如 SEQ ID No:2 所示。
8.—種如權利要求1~7任一所述的含人Rad51C啟動子的載體在治療腫瘤藥物中的應用。
【文檔編號】A61P35/00GK103952440SQ201310415502
【公開日】2014年7月30日 申請日期:2013年9月12日 優先權日:2013年9月12日
【發明者】許艷, 曹艷, 毛志勇 申請人:同濟大學