小鼠Miwi啟動子,其載體及應用的制作方法

專利名稱：小鼠Miwi啟動子,其載體及應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及基因表達調控領域，更具體地說，本發明涉及一種在小鼠雄性生殖細 胞中特異表達的小鼠基因啟動子。
背景技術：
Argonaute 蛋白質家族的成員包含 PAZ(Piwi Argonaut and Zwille)和 PIWI 兩個 結構域。Argonaute蛋白通過其PAZ結構域與小RNA的3’端發生作用，通過PIWI結構域與 小 RNA 的 5'端相互作用(Song JJ,et al. The crystalstructure of the Argonaute2 PAZ domain reveals an RNA binding motif inRNAi effector complexes. Nat Struct Biol, 2003,10 1026-1032 ；Yan KS,et al. Structure and conserved RNA binding of the PAZ domain. Nature, 2003,426 468-474 ；Song JJ, et al. Crystal structure of Argonaute andits implications for RISC slicer activity. Science,2004, 305 1434-1437 ；Takada S, Rivas FV, et al. Purified Argonaute2 and an siRNA formrecombinant human RISC. Nat Struct Mol Biol, 2005,12 =340-349) 并在小RNA的指導下尋找目標位點，從而引起 基因沉默。根據Argonaute蛋白家族氨基酸序列相似性，Ago/Piwi家族可分為三個亞家 族。第一，Argonautes (Ago)亞家族；第二，Piwi蛋白亞家族；第三個亞家族包括線蟲中的 Sago-1 禾口 Sago_2。小鼠Piwi 亞家族的成員包括 MIWI，MI LI/PIWIL2 和 MIWI2/PIWIL4，小鼠 Miwi、 Mili和Miwi2都是雄性生殖細胞發育過程中特異表達的基因，但其表達時間有所不同。 Miwi從減數分裂時期的粗線期精母細胞開始表達持續到圓形精子細胞時期；Mili從原始 生殖細胞遷入生殖嵴后不久即胚胎期12. 5天左右開始表達，一直持續到圓形精子細胞時 期；相對于Miwi和Mili來說，Miwi2的表達時期很短，只在胚胎期15. 5天到出生后3天 的精原細胞中表達。Piwi亞家族都能與一類小RNA結合，稱為piRNA，在粗線期與Miwi和 Mili相互作用的piRNA稱為粗線期piRNA，在粗線期之前與Mili相互作用的piRNA稱為前 粗線期PiRNA。Satomi Kuramochi-Miyagawa等人在2001年最早克隆到小鼠Miwi基因，并對其 表達譜進行了研究，發現Miwi只在小鼠睪丸組織中有表達，原位雜交顯示其表達位于減數 分裂的粗線期(Kuramochi-Miyagawa S, et al. Two mousepiwi-related genes :miwi and mili.Mech Dev，2001，108 :121-133)。2002年，Wei Deng,Haifan Lin等人也對小鼠Miwi 基 因進行了克隆和表達分析，他們克隆到4. 06kb的小鼠Miwi基因cDNA，包括191bp的5，UTR 區，2. 59kb的開放讀碼框，和1. 17kb的3，UTR區，并通過原位雜交和Miwi-GFP Knockin小 鼠發現MiwiRNA最早出現于出生后12天(12dpp)，即偶線期精母細胞開始出現的時候，并 在出生后14天(14dpp)開始大量出現。其表達一直持續到圓形精子細胞時期(Deng ff, et al. miwi, a murine homolog of piwi, encodes acytoplasmic protein essential for spermatogenesis. Dev Cell, 2002, 2 :819_830)。在 Miwi 基因 Knockout 的小鼠中，其精子 發生被阻滯在圓形精子細胞期，同時不能生成長型精子細胞。
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然而尚沒有關于Miwi基因組織特異性表達轉錄調控機制的研究。始于20世紀80年代初的轉基因動物技術，是指通過重組DNA技術，將外源基因導 入動物體內，外源基因穩定整合在染色體基因組上并傳給下一代。用這種方法可建立轉基 因動物模型以研究外源基因在整體動物中的表達調控規律；可改變動物基因型使其表現型 更符合人類需要，也可用轉基因動物生產人類所需的生物活性物質。轉基因動物自80年代初轉基因小鼠的問世開始，轉基因技術體系成為遺傳學研 究中繼本世紀初的基因連鎖分析、60年代的體細胞遺傳和70年代的基因克隆之后第四代 技術，推動了生命科學的發展。現在，轉基因動物不單單是分子生物學中研究基因基本調控 信息的重要工具，在器官移植、生物反應器和育種學上也起到越來越重要的作用。1985年 Harmmer和Berm首次用顯微注射技術獲得1頭轉基因豬，其與同窩非轉基因豬比較，生長速 度顯著提高，飼料利用率提高17%，胴體脂肪明顯減少。2004年，日美聯手利用基因工程手 段培育出對瘋牛病(牛海綿狀腦病，BSE)具有免疫力的牛，這種轉基因牛不攜帶普里昂蛋 白或其他傳染性蛋白。越來越多的轉基因經濟動物表明轉基因將成為人類培育新型高效生 產力經濟動物的重要手段。隨著轉基因技術在科研、醫療、畜牧業、農業等領域中越來越廣泛的應用，對指導 外源基因在體內表達的啟動子元件的要求也越來越高，迫切需要開發各類組織特異性表達 的啟動子，而不是在體內廣譜表達的啟動子。

發明內容
本發明的目的是提供一種小鼠Miwi啟動子，該啟動子能夠驅動目的基因在雄性 生殖細胞中特異表達；本發明提供的小鼠Miwi啟動子為研究生殖相關的基因功能提供方 便，并為建立基因治療技術以治療男性不育等疾病提供了手段。本發明的另一個目的是提供含有小鼠Miwi啟動子的載體和宿主細胞。本發明的再一個目的是提供小鼠Miwi啟動子的用途。在本發明的第一方面，本發明人鑒定出小鼠Miwi基因的轉錄起始位點。在圖1.A 中詳細列出了小鼠Miwi基因全基因序列和功能位點，方框表示的A即為轉錄起始位點， 該位置記為+1，本發明中所有相關序列的位置都是相對該轉錄起始位點的相對位置，按 照以下方法確定其相對位置，本發明確定的轉錄起始位點為+1，其5’上游的核苷酸依次 為-1，-2，_3，……，3，端下游核苷酸依次為+2，+3，+4，……。在本發明中，發明人提供了一種分離的小鼠Miwi啟動子，該啟動子的核苷酸序列 如 SEQ ID NO 1 所示。較佳的，該啟動子核酸序列在(l)SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列中-97 -93區域為五個核苷酸CCAAT組成 的序列，且在(2) SEQ ID N0:1所示的核苷酸序列中_82 -77區域為六個核苷酸CACGTG組成 的序列。在-97 -93區域的CCAAT五個核苷酸是轉錄因子NFY結合的CCAAT box, 在-82 -77區域的CACGTG六個核苷酸是轉錄因子USF結合的E box。在本發明的第二方面，提供一種載體，該載體含有小鼠Miwi啟動子，其啟動子核
4苷酸序列如SEQ ID NO 1所示。在另一優選例中，提供的載體還含有由Miwi啟動子驅動的目的基因，更佳的，目 的基因是熒光素酶基因或熒光蛋白基因。在本發明的第三方面，提供一種宿主細胞，該宿主細胞含有所述的載體。在本發明的第四方面，提供小鼠Miwi啟動子的用途，所述的啟動子可驅動目的基 因在細胞中表達的應用。較佳的，目的基因是熒光素酶基因或熒光蛋白基因。在另一優選例中，所述的啟動子驅動目的基因在雄性生殖細胞中從粗線期精母細 胞到圓形精子細胞時期特異表達中的應用。本發明的其它方面由于本文的公開內容，對本領域的技術人員而言是顯而易見 的。本發明的優點在于提供了一種新的，驅動目的基因在細胞中特異表達啟動子。本發明的啟動子可以 指導外源基因在小鼠精子發生過程中從粗線期精母細胞時期到圓形精子細胞時期特異表 達。為利用轉基因技術研究雄性生殖提供了手段，同時該技術也能夠應用于條件性基因敲 除中，指導ere重組酶在粗線期精母細胞到圓形精子細胞特異表達，從而特異的敲除這類 細胞中的基因。為進一步研究人類男性生殖，治療男性不育等疾病奠定了基礎。


圖1.確定Miwi基因啟動子轉錄起始位點的序列及電泳圖(A)方框所示A為本實驗確定的轉錄起始位點，標記為+1TSS，MIWIGSP1和 MIWIGSP2分別為5RACE引物。⑶第1道為DNA marker，第2道為第一輪RACE產物的PCR電泳圖，第3道為RACE 巢式PCR電泳圖。圖2. Miwi基因啟動子驅動熒光素酶基因表達載體的構建示意3.不同長度Miwi啟動子驅動熒光素酶基因表達載體轉染宿主細胞的熒光素酶 活性柱狀圖黑色柱狀為轉染COS 7細胞，灰色柱狀為轉染GC-1細胞，橫坐標為相對熒光素酶活性。圖4. Miwi啟動子突變載體的熒光素酶活性柱狀圖左側方框和圓圈分別代表ccaat box和E box，空心為野生型，實心為突變型；黑 色柱狀為轉染COS 7細胞的結果，灰色柱狀為轉染GC-1細胞的結果，pGL3-BasiC為陰性對 照，橫坐標為相對熒光素酶活性。圖5.構建Miwi基因啟動子驅動EGFP表達的轉基因載體示意6. Miwi基因啟動子驅動EGFP表達載體轉染細胞熒光圖A為COS 7經藍光激發的綠色熒光照片，B為COS 7細胞的明場照片。圖7. Miwi-EGFP轉基因小鼠F1代小鼠睪丸切片的熒光圖A為4#轉基因小鼠F1代雄性小鼠睪丸切片熒光照，B為9#轉基因小鼠F1代雄性 小鼠睪丸切片熒光照。圖8. Miwi-EGFP轉基因小鼠多種組織切片的熒光圖，及各組織中檢測EGFP蛋白存在的 western blot 圖。(A)a, c, e, g，i，k分別為藍光激發轉基因小鼠睪丸、心、肝、脾、肺、腎組織切片的 熒光照片；b，d，f，h，j，1分別為a，c, e, g，i，k對應的明場照片；(B)western blot檢測小鼠睪丸、心、肝、脾、肺、腎組織中EGFP蛋白的存在；1,2, 3，4，5，6，分別表示小鼠睪丸、心、肝、脾、肺、腎的蛋白樣品，beta-act in為對照。圖9. Miwi-EGFP轉基因小鼠睪丸切片免疫組化圖A，B，E分別為用anti-Miwi抗體檢測內源性Miwi的表達，用anti-EGFP抗體檢測 轉基因小鼠中EGFP的表達，用anti-EGFP抗體檢測正常小鼠中EGFP的表達；C，D，F分別為 A，B，E的放大，相對于A，B, E中小方框的部分；SG代表精原細胞，SE代表支持細胞，PSC代 表粗線期精母細胞，RS代表圓形精子細胞，ES代表長形精子細胞。
具體實施例方式本發明人經過深入客觀的研究，首次從小鼠基因組中分離到一種核酸，該核酸位 于小鼠Miwi基因的上游，將其作為啟動子元件，可以指導目的基因的表達。所述的核酸包 含了指導Miwi基因在小鼠雄性生殖細胞中從粗線期精母細胞到圓形精子細胞特異表達所 需的調控元件，從而可用于研究小鼠精子發生過程中特定基因的表達調控機制及其功能。 在此基礎上完成了本發明。如本文所用，所述的“啟動子”或“啟動子元件”是指一種核酸序列，其通常存在于 目的基因編碼序列的上游(5’端)，能夠指導核酸序列轉錄為mRNA。一般的啟動子或啟動 子元件提供RNA聚合酶和正確起始轉錄所必需的其它轉錄因子識別位點。在本文中，所述 的啟動子或啟動子元件包括啟動子的變體，通過定點突變等來獲得。啟動子及其指導的基因表達本發明人在研究過程中，首次從小鼠Miwi基因的上游克隆到一段可良好地指導 外源基因表達的啟動子核酸序列，利用該啟動子來指導報告基因的表達，可良好地模擬小 鼠Miwi基因的內源表達情況。在本發明的實施例中，本發明人證明了利用所述的啟動子指 導EGFP的表達能夠完全模擬內源Miwi的表達，說明該段核酸序列包含了指導Miwi在小鼠 精子發生過程中從粗線期精母細胞到圓形精子細胞時期特異表達所需的所有調控元件，從 而改變了目前現有技術中具體體內對Miwi基因有調控作用的核酸序列未知的現狀。因此本發明提供一種分離的啟動子核酸序列，所述的核酸具有SEQ ID N0:1所示 的序列，所述的核酸可作為指導目的基因表達的啟動子元件。本發明的啟動子可以被可操作地連接到目的基因上，該目的基因相對于啟動子而 言可以是外源的。所述的目的基因通常可以是一種結構性核酸序列；所述的目的基因優選 編碼具有特定功能的蛋白，例如某些具有重要性或功能的蛋白；或者所述目的基因是在轉 錄或表達后可以發揮指示作用的基因，如報告基因。例如所述的目的基因包括但不限于熒光素酶基因、綠色熒光蛋白基因。本發明的啟動子還可以被可操作地連接到被改進的目的基因序列上，該目的基因 相對于啟動子是外源(異源)的。所述的目的基因可以被改進來產生各種期望的特性。例 如，目的基因可以被改進來表達白喉毒素，人工構建的鋅指核酸酶，ere重組酶等。此外，啟動子和目的基因可以設計成下調特定基因。這一般是通過將啟動子連接到目的基因序列上來實現，該序列為該基因的siRNA。本領域的普通技術人員熟悉這種反義 技術。任何核酸序列可以以這種方式被調節。本發明的啟動子和目的基因序列可被構建到新的重組載體中。所述的重組載體一般包括(從5’到3’方向)引導目的基因轉錄的啟動子，和目 的基因，如果需要，所述的重組載體還可以包括3’轉錄終止子，3’多聚核苷酸化信號，其他 非翻譯核酸序列，轉運和靶向核酸序列、抗性選擇標記、增強子或操縱子。用于制備重組載體的方法是本領域技術人員所熟知的。屬于“表達載體”指本領 域熟知的細菌質粒、噬菌體、酵母質粒、哺乳動物細胞、病毒或其他載體。總之，只要其能夠 在宿主體內復制和穩定存在，任何質粒和載體都是可以被采用的。優選的，所述的表達載體 是真核表達載體。本領域的技術人員熟知的方法能用于構建含有本發明所述的啟動子和/或目的 基因序列的表達載體。這些方法包括體外DNA重組技術、DNA合成技術、體內重組技術等。 表達載體還包括翻譯起始用的核糖體結合位點和轉錄終止子。此外，表達載體優選地包含一個或多個選擇性標記基因，以提供用于選擇轉化的 宿主細胞的表型形狀，所述的標記基因如氨芐青霉素抗性、卡那霉素抗性、新霉素抗性等。重組載體中除了含有本發明的啟動子，還可含有一種或多種其他啟動子。所述的 其他啟動子例如是組織特異性的、組成性的或誘導型的。作為本發明的實例，所述的載體是pGL3-BasiC，其本身含有編碼熒光素酶基因的 序列。通過改造，即利用pGL3-BasiC上的多克隆位點，可將本發明的啟動子區域構建到熒 光素酶編碼基因的5’端，轉化宿主細胞，啟動子將激活熒光素酶基因的表達，所述啟動受到 啟動子各順式作用元件的調控，模擬了基因在體內被激活轉錄的狀況。作為本發明的實例，所述的載體是pEGFP-1，其本身含有編碼綠色熒光蛋白基因的 序列。通過改造，即利用PEGFP-1上的多克隆位點，可將本發明的啟動子區域構到綠色熒光 蛋白編碼基因的5’端，轉化宿主細胞，啟動子將激活綠色熒光蛋白基因的表達，所述啟動受 到啟動子各順式作用元件的調控，模擬了基因在體內被激活轉錄的狀況。包含上述適當的啟動子和目的基因的載體，可以用于轉化適當的宿主細胞，或轉 化入受精卵或胚胎內，以使其能夠表達蛋白。宿主細胞可以是原核細胞，如細菌細胞；或是低等真核細胞，如酵母細胞；或是高 等真核細胞，如植物細胞。代表性例子有大腸桿菌，酵母，動物細胞等。受精卵可以是兩棲 類動物的受精卵或胚胎，如非洲爪蟾的受精卵或胚胎。作為本發明的實例，所述的宿主細胞為GC-1或COS 7細胞。GC-1為小鼠精原細胞 系，COS 7是來源于非洲綠猴腎成纖維細胞并經SV40病毒基因轉化的細胞系。用重組DNA轉化宿主細胞可用本領域技術人員熟知的常規技術進行。當宿主細胞 為原核生物如大腸桿菌時，使用CaCl2制備感受態細胞，所用的步驟在本領域眾所周知。當 宿主細胞為真核細胞時，可使用脂質體轉染法等。制備轉基因小鼠的原核注射、胚胎移植等方法也是本領域已知的。在本發明的實例中，在所述的啟動子指導下，可以使熒光素酶(Luciferase)基因 和綠色熒光蛋白(EGFP)基因良好的表達。因此可見，本發明的啟動子在基因轉錄調控的研 究中具有重要的應用價值。
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在本發明的實例中，利用所述的啟動子指導綠色熒光蛋白表達的載體制備轉基因 小鼠，結果表明，所述的啟動子可以指導的EGFP的表達模式與內源的Miwi基因的表達模式 非常相似，這說明本發明人得到的Miwi基因啟動子中包含了指導Miwi基因在小鼠雄性生 殖細胞中從粗線期精母細胞到圓形精子細胞時期特異表達所需的所有重要順式作用元件。本發明的優點在于提供了一種新的，驅動目的基因在細胞中特異表達啟動子。本發明的啟動子可以 指導外源基因在小鼠精子發生過程中從粗線期精母細胞時期到圓形精子細胞時期特異表 達。為利用轉基因技術研究雄性生殖提供了手段，同時該技術也能夠應用于條件性基因敲 除中，指導ere重組酶在粗線期精母細胞到圓形精子細胞特異表達，從而特異的敲除這類 細胞中的基因。為進一步研究人類男性生殖，治療男性不育等疾病奠定了基礎。下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明 而不用于限制本發明的范圍。
5’一RAG!所用引物如下
MIWIGSP l(SEQ[D NO2)5’ C．TGATCGTCGTGGTCCAGCA3’
MIWIGSP2(SE(ID NO3)5’ CCAGTCAG(．TCAGGTGTTCA3’
SMAR~’Ⅳ弓!物(SE(ID NO4)
5’ AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGGCCATTACGGCCGGG3’
5’一RAG!反應體系如下
IOXP(R bulfer2．5 u l
25ram Mg(121．5-2．o u l
SMAR~’Ⅳ弓!物(10 u M)l u l
MIWIGSP2(5 u M)l u l
cIN／P(各2mM)2>1
SMAR／(DNA1>]
．Fac3酶(2U／’ 1)o．5 u l
去離子水15．0-15．5 u l
擴增條件94℃，5分鐘，然后開始循環(94℃，30秒一65℃，40秒一72℃，t20秒)共34個循環，72℃延伸5分鐘，PCR結束后，取5 u l n9 PcR產物電泳檢測；
(4)NeS七一5’一RAG!
NeS七一5’一RAG反應體系如下
10XP(R bulfer2．5 u l
25mM Mg(121．5-2．o u l
SMAR~’Ⅳ弓!物(10 u M)l u l
MIWIGSPl(5 u M)l u l
cIN／P(各2mM)2>1
稀釋lo倍的5’RACE!產物l u l
．Fac3酶(2U／’ 1)o．5 u l
去離子水15．0-15．5 u l
擴增條件94℃，5分鐘，然后開始循環(94℃，30秒一65℃，40秒一72℃，9秒)共34個循環，72Z一延伸5分鐘，PCR結束后，取5 u l的PCR產物電泳檢測。
通過5’RACE!實驗確定小鼠Miwi基因啟動子轉錄起始位點在基因組上位于Miwi基因編碼區起始密碼子上游2871bp的腺嘌呤A上。如圖l，+。[TSS為本發明確認的轉錄起始位點。在圖1．A中列出了小鼠Miwi基因轉錄起始位點附近的基因組序列及5’RACE!所用引物在基因組上的相對位置，方框表示[]~A HIJ為轉錄起始位點，該位置記為+l，本發明中所有相關序列的位置都是相對該轉錄起始位點的相對位置，按照以下方法確定其相對位置，本發明確定的轉錄起始位點為+l，其5’上游的核苷酸依次為一l，一2，一3，……，3’端下游核苷酸依次為+2，+3，+4，……。在圖1．A中MIWIGSPl，和MIWIGSP2分別為5RACI王引物，Intr(’nl表示第一個內含子，其長度為
分別將質粒pGL3-5Ml ；pGL3-5M2 ；pGL3_5M3 ；pGL3_5M4 ；pGL3_5M5 ；pGL3_5M6 ； PGL3-5M7 ；pGL3-5M8與內參pRT_TK共轉染COS 7和GC-1細胞，并測定熒光素酶活性，結果 如圖 3 所示。5M1 (-467 +181)，5M2 (-206 +181)，5M3 (-166 +181)，5M4 (-122 +181)， 5M5 (-106 +181)，5M6(-92 +181)，5M7 (-76 +181)，5M8 (-11 +181)分別表示不同 長度的Miwi基因啟動子片段連接熒光素酶報告基因的載體，數字表示該片段相對與本發 明確定的轉錄起始位點的位置，轉錄起始位點為+1。pGL3-BasiC為陰性對照。棕色柱狀圖 為轉染COS 7細胞的結果，藍色柱狀圖為轉染GC-1細胞的結果。結果顯示在GC-1細胞系 和COS 7細胞系中，5M1 5M5都能驅動熒光素酶基因的表達，而5M6 5M8幾乎不能驅動 熒光素酶基因的表達，說明在引物5M5與5M6之間，即-106 -92之間存在對Miwi啟動子 轉錄活性不可缺少的轉錄因子結合位點。5M5片段即-106 +181為Miwi基因的核心啟動 子。實施例4.在核心啟動子區域進行點突變確定對轉錄活性具有重要影響的轉錄因 子結合位點的確定為了對核心啟動子區域重要轉錄因子結合位點進行驗證，我們以PGL3-5M4構建 了 CCAAT box、第一個E box (以下簡稱El box)、第二個E box (以下簡稱E2 box)的突變 載體以及El box和E2 box雙突變的載體，分別命名為pGL3-5M4_Cmut、pGL3-5M4_Elmut、 pGL3-5M4-E2mut、pGL3-5M4-El/E2mut。構建突變的引物序列如下表突變載體名稱構建該突變載體所用的引物pGL3-5M4-Cmut (SEQ ID NO 14)5’ -CCACCCACGTGGCAGTTCCTCAGGGCCCAGCACG-3，(SEQ ID NO: 15)5， -CGTGCTGGGCCCTGAGGAACTGCCACGTGGGTGG-3，pGL3-5M4-Elmut (SEQ ID NO: 16)5， -ACAAAACCGCCACCTCTAGTGCAGCCAATCAGGG-3，(SEQ ID NO: 17)5’ -CCCTGATTGGCTGCACTAGAGGTGGCGGTTTTGT-3’pGL3-5M4-E2mut (SEQ ID NO: 18)5’ -CAATCAGGGCCCAGTCTAGTTCCACCTCGCCGTT-3’(SEQ ID NO: 19)5， -AACGGCGAGGTGGAACTAGACTGGGCCCTGATTG-3’pGL3-5M4-El/E2mut 構建 pGL3-5M4_El/E2mut 突變載體時以 pGL3-5M4_Elmut 為模板，利用pGL3-5M4-E2mut的突變引物進行二次突變。構建突變載體的PCR反應體系 構建突變載體的PCR反應條件94°C，5分鐘，然后進行(94°C，40秒一60°C， lmin — 68°C，5min)共18個循環，最后72°C延伸10分鐘。PCR反應后，直接在PCR反應體系中加入1微升Dpn I，混勻后37°C水浴孵育1小 時。Dpn I消化完畢后可以直接用于轉化，挑克隆鑒定突變重組子。將構建好的突變質粒分別轉染GC-1和COS 7細胞，同時轉入pRT-TK質粒作為 內參，24個小時之后測定熒光素酶的活性，通過計算螢火蟲熒光素酶與海腎熒光素酶活性 的比值，分析突變后啟動子的活性。見圖4，5M4 (-122 +181)為野生型Miwi啟動子連 熒光素酶報告基因的載體，CCAAT mut為5M4上ccaat (-97 -93)突變為ttcca的突變 載體，Elmut為5M4上cacgtg(_107 -102)突變為tctagt的突變載體，E2mut為5M4上 cacgtg(-82 -77)突變為 tctagt 的突變載體，El/E2mut 為 5M4 上 cacgtg(-107 -102) 突變為tctagt，同時CaCgtg(-82 -77)突變為tctagt的突變載體。數字表示該片段相對 與本發明確定的轉錄起始位點的位置。pGL3-BasiC為陰性對照。左側方框和圓圈分別代表 ccaatbox和E box，空心為野生型，實心為突變型。黑色柱狀為轉染COS 7細胞的結果，灰 色柱狀為轉染GC-1細胞的結果。橫坐標為相對熒光素酶活性。結果表明CCAAT box突變之后，與pGL3-5M4相比，其啟動子活性降低了 60%左 右；Elbox突變之后，對其啟動子活性沒有任何影響；而E2box突變之后，PGL3-5M4的啟動 子活性幾乎完全喪失。實施例5構建Miwi基因核心啟動子驅動EGFP表達的轉基因載體使用5，端引物 pmiwi5E(SEQ ID NO :20) (5，-CCGGAATTCCACAAAACCGCCACCCACGT G-3，)，和 3，端引物 p miwi3B(SEQ IDN0 21) (5，-GTTGGATCCCCTGATCGTCGTGGTCCAGC-3，)， 以KM小鼠鼠尾基因組DNA為模板，擴增出Miwi基因啟動子-122 +181區域。PCR體系如下 PCR 程序94°C 5min，94°C 30s — 66 °C 30s — 72 °C lmin 共進行 35 個循環，最后 72 °C 5min，4°C 保存。將上述PCR片段使用EcoRI/BamHI雙酶切，膠回收，T4連接酶連入經EcoRI/BamHI 雙酶切的pEGFP-1載體中，命名為pMiwi-EGFP，如圖5，將-122 +181 (相對與本發明確定 的Miwi基因轉錄起始位點)區域共303bp的Miwi基因啟動子區域克隆到pEGFP-1載體的 EcoRI與BamHI酶切位點之間，該303bp的Miwi啟動子序列包括位于_97 -93區域(SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列中第26到第30個堿基)的CCAAT box，和位于-82 -77區域 (SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列中第41到第46個堿基)的E2 box。+1顯示本研究中所 確定的轉錄起始位點。使用Hindlll線性化pMiwi-EGFP，純化回收，用作制備轉基因小鼠的載體。實施例6. Miwi基因啟動子驅動EGFP表達載體轉染細胞將所構建的Miwi啟動子(-122 +181)驅動EGFP表達的轉基因表達載體轉染 COS 7細胞進行驗證。如圖6，A為COS 7經藍光激發的綠色熒光照片，B為COS 7細胞的 明場照片。結果表明在COS 7細胞中，Miwi啟動子(-122 +181)可以驅動外源基因EGFP 的表達。實施例7.制備轉基因小鼠，并檢測EGFP的表達以Hindlll線性化的Miwi-EGFP，通過原核注射制備轉基因小鼠。共得到兩個陽性 小鼠(4#和9#)。如圖7，A為4#轉基因小鼠F1代雄性小鼠睪丸切片熒光照，B為9#轉基因小鼠F1 代雄性小鼠睪丸切片熒光照。通過對4#和9#轉基因小鼠F1代小鼠睪丸切片的熒光觀察 發現，4#和9#轉基因小鼠F1代的睪丸中都有綠色熒光蛋白的存在，并且只存在與曲精小管 中。進一步的熒光觀察和western blot實驗證明，在4#和9#小鼠的其它組織中沒 有EGFP蛋白的存在，如圖8. A，a, c, e, g, i, k分別為藍光激發轉基因小鼠睪丸、心、肝、脾、 肺、腎組織切片的熒光照片；b，d，f，h，j，1分別為a，c, e, g，i，k對應的明場照片。其中只 有睪丸組織中觀察到綠色熒光。如圖8.B，western blot檢測小鼠睪丸、心、肝、脾、肺、腎 組織中EGFP蛋白的存在。1，2，3，4，5，6，分別表示小鼠睪丸、心、肝、脾、肺、腎的蛋白樣品， beta-actin為對照。結果顯示只有睪丸中檢測到EGFP的存在。
由于轉基因小鼠冰凍切片直接觀察熒光很難區分EGFP表達的細胞類型，因此我 們使用EGFP的抗體進行了轉基因小鼠睪丸切片的免疫組化實驗，如圖9，A，B, E分別為用 anti-MIWI抗體檢測內源性Miwi的表達，用anti_EGFP抗體檢測轉基因小鼠中EGFP的表 達，用anti-EGFP抗體檢測正常小鼠中EGFP的表達；C, D，F分別為A，B, E的放大，相對于 A，B，E中小方框的部分。SG代表精原細胞；SE代表支持細胞；PSC代表粗線期精母細胞；RS 代表圓形精子細胞；ES代表長形精子細胞。內源性的Miwi蛋白從粗線期開始表達持續到 圓形精子細胞時期(如圖9A，C)，我們同樣觀察到MIWI啟動子驅動的EGFP在粗線期到圓 形精子細胞時期表達(如圖9B，D)。
權利要求
一種小鼠Miwi啟動子，其特征在于，該啟動子的核苷酸序列如SEQ ID NO1所示。
2.一種含有權利要求1所述啟動子的載體。
3.根據權利要求2所述的載體，其特征在于，該載體還含有由所述啟動子驅動的目的基因。
4.根據權利要求3所述的載體，其特征在于，所述目的基因為熒光蛋白基因或熒光素酶基因。
5.一種用權利要求2、3或4所述的任何一種載體轉化的宿主細胞。
6.根據權利要求5所述的宿主細胞，其特征在于，宿主細胞是雄性生殖細胞。
7.權利要求1所述的啟動子驅動目的基因在細胞中表達的應用。
8.根據權利要求6所述的應用，其特征在于，所述的啟動子驅動目的基因在雄性生殖 細胞中從粗線期精母細胞到圓形精子細胞時期特異表達中的應用。
全文摘要
本發明提供了一種新的小鼠Miwi啟動子，含有小鼠Miwi啟動子的載體，宿主細胞以及小鼠Miwi啟動子的用途。小鼠Miwi啟動子可用于指導外源基因在雄性生殖細胞中特異表達，為研究生殖相關的基因功能提供方便，并為建立基因治療技術以治療男性不育等疾病提供了手段。
文檔編號C12N5/10GK101864419SQ201010162278
公開日2010年10月20日 申請日期2010年4月27日 優先權日2010年4月27日
發明者侯宇, 周榮家, 程漢華 申請人:武漢大學