禾本科來源的變應原性已降低并保持t-細胞反應性的1類變應原的變體的制作方法

禾本科來源的變應原性已降低并保持t-細胞反應性的1類變應原的變體的制作方法
【專利摘要】本發明涉及禾本科來源的變應原性已降低并保持T-細胞反應性的1類變應原的變體。本發明還涉及禾本科（白菖蒲）的1類變應原的變體的制備和用途，該1類變應原的特征在于與已知野生型變應原相比，其IgE反應性已降低，同時基本上保持了與T-淋巴細胞的反應性。這些低變應原性的變應原變體可被用于對草花粉變態反應患者的特異性免疫治療（脫敏作用）或用于對草花粉變態反應的預防性免疫治療。
【專利說明】禾本科來源的變應原性已降低并保持T-細胞反應性的1類變應原的變體
[0001]本申請是申請日為2005年7月11目的中國專利申請200580024464.5“禾本科來源的變應原性已降低并保持T-細胞反應性的I類變應原的變體”的分案申請。
【技術領域】 [0002]本發明涉及禾本科(白菖蒲)的I類變應原的變體的制備和用途，該I類變應原的特征在于與已知野生型變應原相比，其IgE反應性已降低，同時基本上保持了與T-淋巴細胞的反應性。這些低變應原性的變應原變體可被用于對草花粉變態反應患者的特殊免疫治療(脫敏作用)或用于對草花粉變態反應的預防性免疫治療。
[0003]本發明的一種優選實施方案涉及梯牧草(貓尾草)花粉來源的主要變應原Phl pi的變體。
【背景技術】
[0004]I型變態反應對全世界均有意義。工業化國家有高達20%的人口患有諸如過敏性鼻炎、結膜炎或支氣管哮喘的疾病。這些變態反應均是由多種來源，諸如植物花粉、螨、貓或狗釋放并存在于空氣中的變應原(氣源性變應原)引起的。在這些I型變態反應患者中，高達40%的患者依次表現出與草花粉變應原的特異性IgE反應性(Freidhoff et al.，1986，J.Allergy Clin.1mmunol.78:1190-2002)。
[0005]觸發I型變態反應的物質是蛋白質、糖蛋白或多肽。這些變應原通過粘膜被吸收后，可與致敏的人類個體內肥大細胞表面結合的IgE分子反應。2個IgE分子通過I個變應原進行的彼此交聯導致效應細胞釋放介質(例如組胺、前列腺素)和細胞因子，從而導致了相應的臨床癥狀。
[0006]根據單個變應原分子與變態反應患者的IgE抗體反應的相對頻率，可區分主要和次要變應原。
[0007]以梯牧草(貓尾草)為例，迄今已鑒別的主要變應原為Phl pi (Petersen et al.，1993,J.Allergy Clin.1mmunol.92:789-796)、Phl p5(Matthiesen and Lwenstein，1991，Clin.Exp.Allergy21:297-307 ； Petersen et al.,1992,Int.Arch.Allergy Immunol.98:105-109)、Phl p6 (Petersen et al.,1995, Int.Arch.Allergy Immunol.108，49-54)、Phlp2 / 3 (Dolecek et al.，1993，FEBS335(3)，299-304)、Phl p4 (Haavik et al.，1985，Int.Arch.Allergy App1.1mmunol.78:260-268 ；Valenta et al.，1992，Int.Arch.AllergyImmunol.97:287-294, Fischer et al.,1996, J.Allergy Clin.1mmunol.98:189-198)和Phl pl3 (Suck et al., 2000, Clin.Exp.Allergy30:324-332 ；Suck et al., 2000, Clin.Exp.Allergy30:1395-1402)。
[0008]梯牧草(貓尾草)內，占優勢的主要變應原為Phl pi和Phl p5o由于禾本科成員來源的主要變應原彼此具有高度同源性，因而具有非常相似的生化和免疫學特性，這些相關蛋白被集中分為I類和5類變應原。[0009]I類變應原可與95%以上的草花粉變態反應患者體內的IgE抗體反應，因而是草花粉中占優勢的主要變應原。
[0010]I類變應原是分子量約為32kDa的糖蛋白，位于花粉粒的細胞質內。花粉粒與上呼吸道粘膜的接觸以及花粉粒被雨潤濕后均可導致這些變應原的快速釋放。亞細胞微粒形式的I類變應原的快速釋放能夠滲透進入下呼吸道，從而觸發嚴重的哮喘發作。
[0011]業已鑒別了貓尾草(Laffer et al.,1994, J.Allergy Clin.Tmmunol.94:689-698)、黑麥草(Perez et al.，1990，J.Biol.Chem.265:16210-16250)、絨毛草(Schrammet al., 1997, J.Allergy Clin.1mmunol.1999:781-787)、草地早熟禾(Sturaro u.Viotti,1998，NCBI GenBank, Acc.N0.AJ131850)、狗牙根(Smith et al.，1996，J.Allergy Clin.1mmunol.98:331-343)、喜濕篇草(Suphioglu et al.,1995, Clin.Exp.Allergy25:853-865)和水稻(Xu et al.，1995，Genel64:255-259)來源的 I 類變應原的 cDNAs。
[0012]除了對這些序列最初的描述，與原始序列在各個位置處存在差異的其它I類變應原序列也已被公開在數據庫中。這些同種型也被認為是其它的草花粉變應原。
[0013]正因為它們的同源性，白菖蒲(禾本科)的I類變應原與人IgE抗體具有高交叉反應性(Laffer et al., 1996,Mol.1mmunology33:417-426) ?該免疫學交叉反應性基于非常相似的氨基酸序列，如梯牧草(貓尾草)的I類變應原Phl Pl與圖1中選定物種來源的I類分子的序列比較所示。
[0014]該禾本科來源的其它I類變應原中的同源序列區同時存在本文在低變應原性變體的構建中所述的Phl pi氨基酸序列缺失的序列區域，及其側翼序列區域。此外，該禾本科的I類變應原的半胱氨酸的數目以及周圍的序列區域不變。正因為這些序列同源性，禾本科的I類變應原被劃分在β -蘋果青霉素的蛋白質家族內(Cosgrove D.J.,2000Nature407:321-6)。
[0015]有效治療變態 反應的傳統方法是特異性免疫療法或脫敏作用(Fiebig，1995，Allergo J.4(6):336-339:Bousquet et al., 1998, J.Allergy Clin.Tmmunol.102(4):558-562)，即將天然變應原提取物以遞增劑量皮下注射進患者體內。但該方法卻有導致變態反應或者甚至過敏性休克的風險。為了將這些風險減至最小，人們應用了類變應原形式的創新制劑。與上述未經處理的提取物相比，這些制劑是IgE反應性已顯著降低，但仍保持了 T-細胞反應性的化學改良變應原提取物。這些T-細胞表位在脫敏作用中對上述變應原制劑的治療作用至關重要(Fiebig，1995，Allergo J.4(7):377-382)。
[0016]采用重組法制備的變應原實現更高程度的治療優化是可能的。通過重組法制備的高純度變應原的成分明確的混合物，如果與患者的各個致敏模式相符，便可取代天然變應原來源的提取物，因為后者除含有多種變應原外，還含有相當大量具有免疫原性而非變應原性的附屬蛋白質。
[0017]經過特異性突變的重組變應原，即其中的IgE表位被特異性缺失，而脫敏療法所必需的T-細胞表位并未受損的重組變應原，使利用重組表達產物可能實現安全脫敏的現實前景得以出現(Schramm et al.，1999, J.1mmunol.162:2406-2414)。
[0018]對脫敏作用而言，一個不同的概念則基于下述事實，即保護性免疫應答被誘導，尤其是被具有阻斷作用的IgG4抗體誘導。依照該假設，業已描述了重組Phl pi片段，并認為其適用于誘導保護性IgG4應答(Ball et al.，1999，FASEB J.13:1277-1290)。該概念與具有降低的IgE反應性并保持T-細胞反應性的低變應原性變應原變體的概念完全不同。
[0019]通過治療影響變態反應患者體內被擾亂的T輔助細胞平衡的另一種可能性是采用編碼相關變應原的可表達DNA進行治療(免疫治療性DNA接種)。業已通過注射變應原編碼DNA，在嚙齒動物體內試驗證實了其對免疫應答的變應原特異性影響(Hsu et al.，1996，Nature Medicine2(5):540-544)。
[0020]本發明的目標在于提供禾本科的新型I類變應原的變體，并可在蛋白質和DNA水平根據其降低的IgE活性和基本上保持的T-細胞反應性對其進行區分，從而使其適用于治療和預防性特異免疫療法和免疫治療性DNA接種。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0021]圖1:禾本科物種的Phl p1-同源氨基酸序列(由eDNA序列推導的成熟蛋白序列):草地早熟禾(Poa P)絨毛草(Hol I)、黑麥草(Lol P)、狗牙根(Cyn d)、水稻(Ory s)和喜濕觀草(Pha a),蛋白質序列根據美國國立生物技術信息中心(NCBI, Bethesda, USA)的“GenBank”數據庫的cDNA序列推導而得，編號方式:成熟蛋白的氨基酸位置，下劃線突出顯示的:與Phl pi序列不同的氨基酸，黑框:半胱氨酸
[0022]圖2:已加工的Phl pi野生型蛋白和變體Phl plNoCys、Phl plWt (野生型)的氨基酸序列比對:蛋白質序列根據cDNA序列(位于Bethesda的美國國立生物技術信息中心(NCBI)的“GenBank”數據庫登錄號為Z27090)推導而得，編號方式:成熟蛋白的氨基酸位置，黑色突出顯示:蛋白Phl plNoCys中絲氨酸對半胱氨酸的氨基酸取代
[0023]圖3:低變應原性變體 Phl plNoCys、Phl plNoCys Λ 213-220 和 PhlPlNoCysA 1-6,115-119,213-220的氨基酸序列比對，作為實例描述，編號方式:氨基酸位置，下劃線突出顯示的:缺失
[0024]圖 4:對重組變體 Ph`l PINoCys, Phl pINoCys Δ 213-220 和 Phl pINoCys Δ 1-6,115-119,213-220 的 SDS-PAGE 和身份檢驗
[0025]A: SDS-PAGE
[0026]B:利用aPhl pi抗體(Allergopharma)進行的蛋白質印跡
[0027]1.標記蛋白
[0028]2.nPhl pi *
[0029]3.rPhl plWt (-組氨酸-標志)*
[0030]4.標記蛋白
[0031]5.Phl plNoCys (+組氨酸-標記)
[0032]6.Phl plNoCys D213-220 (+組氨酸-標記)
[0033]7.Phl PINoCys D1-6，115-119，213-220 (+組氨酸-標記)
[0034]8.標記蛋白
[0035]*還原樣品(二硫蘇糖醇)
[0036]圖 5:檢驗 Phl plNoCys、Phl plNoCys Λ 213-220 和 Phl plNoCys Λ 1-6，115-119，213-220在非變性條件下的IgE結合能力的條帶檢驗
[0037]DrPhl plfft
[0038]2)Phl plNoCys[0039]3)Phl pINoCys D213—220
[0040]4)Phl pINoCys Dl-6，115-119，213-220
[0041]5)rPhl plfft
[0042]TP:總蛋白著色
[0043]P:臨床確定為草花粉變態反應患者的血清
[0044]圖6:通過采用4個草花粉變態反應患者(P)的代表性血清樣品進行EAST抑制試驗，對 Phl plNoCys、Phl plNoCys Λ 213-220 和 Phl plNoCys Λ 1-6，115-119，213-220 的降低的IgE反應性的確定
[0045]圖7:通過采用4個草花粉變態反應患者(P)的嗜堿性粒細胞進行的嗜堿性粒細胞活化試驗對Phl plNoCys的低變應原性的確定
[0046]圖8:通過采用4個草花粉變態反應患者(P)的嗜堿性粒細胞進行的嗜堿性粒細胞活化試驗對Phl PlNoCysA 213-220的低變應原性的確定
[0047]圖9:通過采用4個草花粉變態反應患者(P)的嗜堿性粒細胞進行的嗜堿性粒細胞活化試驗對Phl plNoCys Λ 1-6，115-119，213-220的低變應原性的確定
[0048]得到上述變體的工作是以Phl Pl為模型變應原進行的。由圖1所示序列比對可清楚地知道由于I類變應原之間的高同源性，即使起點為另一個I類變應原，也可獲得相同的結果。
[0049]因此，一定也可以假定上下文提供的結果也適用于黑麥來源的Seccl，或言之利用Sec Cl也可以獲得這些結果，盡管該I類變應原的序列尚未知。
[0050]因此，本發明涉及禾本科的I類變應原的變體，其特征在于與已知野生型變應原相比，其IgE反應性已降低，但仍保持了與T-淋巴細胞的反應性。這些I類變應原優選貓尾草、黑麥草、草地早熟禾、絨毛草、狗牙根、水稻和喜濕Il草來源的Phl pUPoa PUHolpl、Lol PI > Cyn dl、0ry si 和 Pha al。更優選的是 Phl pl、Poa pl、Hol pl、Lol pi 或 Phaal,尤其優選的是Phl pi。
[0051]構建I類變應原的低變應原性變體的起點是野生型Phl pi的cDNA，其是借助于特異性引物通過聚合酶鏈反應(PCR)從貓尾草花粉的總cDNA中分離獲得(“GenBank”登錄號為 Z27090 ；NCBI, Bethesda, USA) (SEQ ID N01)。
[0052]氨基酸序列SEQ ID N02由野生型Phl pi的cDNA序列推導而得。
[0053]由240個氨基酸構成的Phl pi以其天然形式被糖基化，與所有的I類變應原一樣
(參見圖1)----特征在于成熟分子中存在7個半胱氨酸。除了 Cyn dl和Ory si,這
7個半胱氨酸在所有I類變應原中的氨基酸位置均為41、57、69、72、77、83和139 (Petersenet al.，1995, J.Allergy Clin.Tmmunol95:987-994)。
[0054]業已在大腸桿菌中表達獲得非糖基化蛋白形式的Phl pi。該重組野生型蛋白(rPhl plwt)可與草花粉變態反應患者來源的IgE抗體反應,該IgE抗體具有與天然純化Phl pi (nPhl pi)的反應性(Petersen et al., 1998, Clin.Exp.Allergy28:315-321) ?
【具體實施方式】
[0055]低變應原性Phlpl變體的制備和表征
[0056]由上述rPhl plwt cDNA開始,制備了通過遺傳工程修飾的重組Phl pi變體。[0057]重組變體Phl plNoCys (SEQ ID N04)的氨基酸序列含有7個絲氨酸殘基，而不是野生型中存在的7個半胱氨酸(圖2)。變體Phl plNoCys充當了構建多種缺失突變體的起點。這些缺失突變體均已缺失了編碼Phl plNoCys的cDNA中長度為15_90bp的單個片段，或這些片段的組合，導致在大腸桿菌中表達的蛋白質的多肽鏈中相應缺失了氨基酸1-6、1-30、92-104、115-119、175-185 和 213-220，從而獲得:Phl pINoCys Δ 1-6 (SEQ ID N05 和
6)、Phl plNoCysA 1-30 (SEQ ID N07 和 8)、Phl plNoCys Δ 92-104 (SEQ ID N09 和 10)、PhlplNoCys Λ 115-119 (SEQ ID NOll 和 12)、Phl plNoCys Δ 175-185 (SEQ ID NO 13 和 14)、PhlPlNoCysA 213-220 (SEQ ID N015和 16)，以及Phl plNoCys Λ 1-6，115-119，213-220 (SEQ IDN017 和 18)。
[0058]這些重組蛋白在大腸桿菌內以組氨酸融合蛋白的形式被表達。用該類型的融合蛋白進行免疫學表征。
[0059]首先，將重組變體固定在硝酸纖維素膜上后，考察它們被代表性血清集合中IgE抗體結合的能力，和被草花粉變態反應患者來源的個體血清中IgE抗體結合的能力(條帶檢驗)。在該方法中，驚訝地觀察到IgE抗體與Phl plNoCys的結合減少了。該結果通過IgE抑制試驗(EAST)得到證實，該試驗考察了未固定蛋白與溶液中的IgE抗體的IgE結合能力。
[0060]因此，本發明尤其涉及位于相應于成熟Phl pi蛋白氨基酸位置41、57、69、72、77、83和139上的半胱氨酸已被除去或被另一種氨基酸取代后獲得的I類變應原變體。尤其優選的是Phl pl、Poa pl、Hol pl、Lol pi或Pha al的相應變體,更優選的是Phl pi的變體。
[0061]如果上述7個半胱氨 酸中的至少2個被除去而未被取代，或被另一種氨基酸取代，便可使上述變體與IgE抗體的結合減少。但優選的是所有7個半胱氨酸均被絲氨酸取代。
[0062]在效應細胞上膜結合IgE的交聯及其體外活化期間，Phl plNoCys的降低的IgE結合能力對功能性作用的影響是通過采用草花粉變態反應患者來源的嗜堿性粒細胞進行的活化試驗考察的。與rPhl plwt相比,Phl plNoCys顯示對嗜堿性粒細胞的活化顯著較低，因此在功能上其變應原性也降低了。
[0063]通過相同方法，根據IgE結合能力(條帶檢驗，EAST)和功能作用(嗜堿性粒細胞活化)考察了以Phl PlNoCys為基礎制備的多種缺失突變體。令人驚訝的是，這些缺失突變體表現出了尤其強的低變應原性特性。
[0064]因此，本發明還涉及下述I類變應原變體，即一任選地，除了上述半胱氨酸已被除去或替代后所獲變體之外---與野生型變應原相比，在相應于成熟Phl Pl蛋白一級序列的氨基酸位置1-6，1-30,92-104,115-119，175-185和213-220的至少一個區域或多個區域的組合缺失后所獲得的I類變應原變體。
[0065]此處尤其優選的是I類變應原Phl pl、Poa pl、Hol pl、Lol pi和Pha al的相應缺失突變體。非常優選的是相應的Phl pi變體。
[0066]根據上述特定優選性，本發明同樣涉及下述I類變應原變體，即僅缺失相應于成熟Phl Pl序列的氨基酸213-220或同時還缺失氨基酸1_6和115-119后獲得的I類變應原變體。此處更優選的變應原為Phl pU Poa pU Hol p1、Lol pi和Pha al, Phl pi尤其優選。[0067]特異性免疫療法的功效所基于的低變應原性Phl pi變體的T-細胞反應性是通過采用草花粉變態反應患者來源的Phl Pl-特異性T-淋巴細胞進行的增殖試驗體外檢驗的。該修飾變應原顯示基本上保持了 T-細胞反應性，從而使低變應原性Phl Pl變體能夠被應用于免疫治療中。
[0068]根據本發明的變應原變體可借助于遺傳工程方法從克隆DNA序列開始制備獲得。但原理上，也可能涉及到對天然變應原提取物的化學修飾(Fiebig, 1995,Allergo J.4(7),377-382)。
[0069]在本專利申請所述I類變應原的變異之外，在不同位置上的進一步修飾例如，為了增強低變應原性——當然也是可能的。這些修飾可以是，例如，氨基酸插入、缺失和交換、蛋白裂解為片段、蛋白或其片段與其它蛋白或肽的融合。本發明還涉及編碼上述變應原變體的DNA分子，含有該DNA分子的重組表達載體以及由該DNA分子或該表達載體轉化的宿主生物。合適的宿主生物可以是原核或真核、單或多細胞生物，諸如細菌或酵母。根據本發明，優選宿主生物為大腸桿菌。
[0070]本發明還涉及通過培養上述宿主生物并從培養物中分離相應的變應原變體以制備本發明所述變應原變體的方法。
[0071]本發明還涉及上述變應原變體、DNA分子和表達載體作為藥物的特性。
[0072]此外，本發明還涉及被用于治療變態反應，或用于免疫治療接種患有變態反應的患者，和/或預防這種變態反應的藥物組合物，其中禾本科的I類變應原參與所述變態反應的觸發，該藥物組合物含有至少一種上述變應原變體或相應的DNA分子或相應的表達載體，并進一步任選地含有活性化合物和/或佐劑。
[0073]如果藥物組合物屬于第二種類型(含有至少一個DNA分子或表達載體)，這些組合物優選地還含有氫氧化鋁或含有免疫刺激性CpG的寡核苷酸，或二者的組合。
[0074]就本發明的用途 而言，藥物組合物可作為治療劑被應用在人類或獸醫學中。合適的賦形劑是適合腸胃外給藥并不與本發明所述I類變應原變體反應的有機或無機物質。適合腸胃外應用的尤其指溶液，優選油或水性溶液，此外還包括懸液、乳濁液或植入物。本發明的變應原變體還可能是凍干的，且所獲得的凍干物被用于，例如制備注射用制劑。所述組合物可能是已滅菌的和/或含有佐劑，諸如潤滑劑、防腐劑、穩定劑和/或潤濕劑、乳化劑、調節滲透壓的鹽、緩沖物質和/或多種其它活性化合物。
[0075]此外，通過例如，使合適配方的本發明變應原變體吸附在氫氧化鋁上，可獲得緩釋制劑。
[0076]最后，本發明涉及根據本發明的至少一種變應原變體或DNA分子或表達載體在制備用于治療變態反應或用于免疫治療接種患有變態反應的患者和/或預防這種變態反應的藥物中的用途，其中禾本科的I類變應原參與所述變態反應的觸發。
[0077]下文以具有上述遺傳工程修飾的低變應原性Phl Pl變體為例描述了變體Phl P INoCys,Phl plNoCys Λ 213-220 和 Phl plNoCys Λ 1-6，115-119，213-220 (圖 3)的制備以及它們的免疫學特征。
[0078]重組Phl pi變體的表達和純化
[0079]這些重組蛋白是作為組氨酸融合蛋白(表達載體pProExHT ； Invitrogen,Carlsbad,USA)在大腸桿菌(菌株JM109)中表達的。rPhlplwt和變體首先是通過N-末端組氨酸殘基與Ni2+螯合基質(固定化金屬離子親和層析，IMAC)的特異性結合并接著通過制備型凝膠過濾(尺寸排阻層析，SEC)而得以純化的。洗脫蛋白的純度是通過SDS-PAGE和分析性SEC監測的(圖4a)。純化蛋白的身份是通過與Phl p1-特異性單克隆抗體的結合證實的(圖4b)。
[0080]對重組Phl pi變體降低的IgE結合性的證實
[0081]證實變態反應患者血清來源的特異性IgE在膜結合試驗蛋白上的IgE反應性的一種簡單試驗方法是條帶檢驗。
[0082]為實現該目的，使試驗物質在非變性條件下以相同的濃度和量并排結合在硝酸纖維素膜上。一組這樣的膜條帶可平行地與不同變態反應患者來源的血清一起溫育。完成洗滌步驟后，通過由抗人IgE /堿性磷酸酶偶聯物促進的顯色反應，使特異性結合的IgE抗體顯現在膜上。
[0083]通過以上述修飾Phl Pl分子為例，本文描述了利用各草花粉變態反應患者來源的血清針對 Phl plNoCys、Phl plNoCys Λ 213-220 和 Phl plNoCys Λ 1-6，115-119，213-220 進行條帶檢驗的結果(圖5)。
[0084]只有從具有抗天然Phl pi的強IgE滴度的變態反應患者來源的血清可被采用。從這些患者獲得的IgE抗體同樣可與重組的相當的rPhl plwt反應。
[0085]從結果清楚可知的是與其同野生型變應原Phl pi的結合程度相比，所有患者血清的Phl Pl特異性IgE抗體與重組變體Phl PlNoCys的結合程度均降低了。
[0086]正如以變體Phl plNoCysA213-220為例所述的內容，通過另外除去某些序列片段，還可進一步降低IgE結合能力。與未經修飾的重組野生型蛋白相比，變體PhlPlNoCysA 213-220顯示其與 變態反應患者來源的所有試驗血清的IgE結合能力均非常顯著地降低了。從利用草花粉變態反應患者血清P14，針對變體Phl plNoCys Λ 1-6，115-119，213-220試驗的結果清楚可知，將許多缺失修飾組合可進一步地使Phl pi與某些血清來源IgE抗體的IgE結合能力降低(圖5)。
[0087]由上清楚可知取代半胱氨酸和缺失特定序列片段均可降低Phl pi分子的IgE結合能力。
[0088]與條帶檢驗形成對比，EAST抑制試驗(酶變應原吸附試驗)使我們能夠考察溶液中的變應原/ IgE相互作用，可通過固定化到膜上以基本上排除試驗物質的表位被干擾遮蔽的可能性。
[0089]EAST抑制試驗以如下方法進行。用變應原包被微量滴定板，此處的變應原為nPhlPi。洗滌除去未結合的變應原分子后，用牛血清白蛋白封閉板以阻斷隨后的非特異性結合。變態反應患者的個體血清或代表性的個體血清集合(血清集合)來源的IgE抗體以合適的稀釋度與變應原包被的微量滴定板一起溫育。變應原結合的IgE抗體的量是借助于抗hlgE /堿性磷酸酶偶聯物與底物的反應以生成有色終產物并通過光度測定法而得以確定的。
[0090]IgE抗體的結合被可溶性變應原或待檢驗物質(重組修飾變應原)以底物特異性方式抑制，該抑制與濃度成函數關系。
[0091]本文以上述修飾Phl Pl分子為例，對其與參考分子nPhl pi進行比較，顯示了針對 Phl plNoCys、Phl plNoCys Λ 213-220 和 Phl plNoCys Λ 1-6，115-119，213-220 的試驗結果O
[0092]圖6所示采用草花粉變態反應患者來源的4個個體血清進行的代表性IgE抑制試驗顯示，即使采用高濃度的變體Phl P INoCys (高達5μ g / ml),也僅實現未修飾天然變應原nPhl pi的最大抑制作用的大約20-50%。該較低的最大抑制作用說明IgE表位喪失。
[0093]與變體Phl plNoCysA213_220 和 Phl plNoCys Λ 1-6，115-119，213-220 對應的曲線證實這些Phl Pl變體甚至具有更低的IgE結合能力。采用單個變異不能檢測到抑制作用，或僅檢測到非常低水平的抑制作用(最大抑制作用的0-20% )。
[0094]與條帶檢驗的結果一致，該EAST抑制試驗可證實插入另外的特異性缺失可進一步降低Phl pi的IgE結合能力。
[0095]通過嗜堿性粒細胞活化試驗對重組Phl pi變體的低變應原性的測定
[0096]變應原性的功能性降低是通過嗜堿性粒細胞活化試驗體外測定的。該嗜堿性粒細胞活化實驗是將草花粉變態反應患者的肝素化全血與多個濃度的試驗物質一起溫育。變應原性物質被嗜堿性粒細胞的Fe ε Rl結合的IgE抗體特異性結合，從而導致了 Fe ε Rl分子的交聯。
[0097]該變應原誘導的，IgE促進的Fe ε RI交聯導致了嗜堿性粒細胞的活化。該活化是這些效應細胞的變應性反應的第一步。后繼的信號轉導致使效應細胞的脫粒，從而觸發體內的變應原性反應。
[0098]在體外，變應原誘導的嗜堿性粒細胞活化可通過與IgE受體交聯的信號轉導偶聯的表面蛋白(CD203c)的表達的定量而得以確定(Kahlert et al.,2003, Cl1.，Exp.Allergy33:1266-72)。細胞上表達的CD203c蛋白數量和細胞集合中活化細胞的百分比是通過下述方法以高靈敏度測定的`，即借助于熒光標記的單克隆抗體與表面標記的結合并接著通過熒光活化的流式細胞計量術進行分析。此處所應用的參考物質是純化天然Phlpi (nPhl pi),與試驗物質平行。本文以上述修飾Phl pi分子為例顯示了與Phl plNoCys、Phl plNoCysA213-220 和 Phl plNoCys Λ 1-6，115-119，213-220 對應的試驗結果。
[0099]圖7所示曲線顯示了變體Phl plNoCys與4個臨床確定為變態反應患者來源的嗜堿性粒細胞的代表性試驗結果。通過該活化曲線中的偏移便可清楚變體Phl plNoCys相對于野生型nPhl pi的變應原性效力的降低。
[0100]與條帶檢驗和IgE抑制試驗的結果一致，變體Phl PlNoCys Λ 213-220和PhlPlNoCysA 1-6，115-119，213-220的試驗結果顯示了相對變應原性效力的更大程度的降低，如圖8和9的代表性曲線所示。
[0101]盡管有最大比例的嗜堿性粒細胞已被試驗物質濃度范圍為ΙΟΟ-ΙΟΟΟρΜ的天然變應原活化，采用修飾變應原 Phl plNoCysA213-220 和 Phl plNoCysA 1-6，115-119，213-220時仍未或僅檢測到極低的嗜堿性粒細胞活化。
[0102]正如根據曲線的A50值計算的結果，與參考nPhl pi (A50:已活化嗜堿性粒細胞的數量達到最大數量的50%時的變應原濃度)相比，變體Phl plNoCys Λ 213-220的變應原性效力降低了約100-1000倍，變體Phl plNoCys Λ 1-6，115-119，213-220的變應原性效力則被降低了 1000倍以上。
[0103]低變應原性Phl pi變體的T-細胞反應性
[0104]T輔助淋巴細胞可與特定變應原肽片段(大約12-25個氨基酸)反應,該變應原肽片段通過抗原呈遞細胞(APCs)中的酶促降解而形成，并在合適的肽被包含進APCs表面上的單個MHC Il類分子之后被呈遞到T-細胞。T輔助淋巴細胞的變應原特異性活化是增殖和功能性分化(THl和TH2)的前提。在脫敏期間采用變應原或變應原衍生物的治療對該變應原特異性T-淋巴細胞的影響被認為是治療效力的關鍵。
[0105]為考察T細胞反應性，通過采用nPhl pi或rPhl plwt分子刺激的常規方法建立了草花粉變態反應患者來源的寡克隆T-細胞系。在增殖試驗中，采用了參考變應原nPhl pi和rPhl plwt和經過修飾的重組Phl pi變體刺激多個T-細胞系。增殖率是通過常規方法摻入[3H]-胸腺核苷酸測定的。
[0106]本文以上述修飾Phl pi分子為例顯示了 Phl plNoCys、Phl plNoCys Λ 213-220和Phl plNoCys Λ 1-6，115-119，213-220 的增殖試驗結果。
[0107]表1所列采用8個草花粉變態反應患者來源T-細胞系的試驗結果顯示以重組變應原變體刺激T-淋巴細胞增殖是可能的。與未經修飾的天然和重組野生型變應原相比，PhlPINoCys, Phl plNoCys Δ 213-220 和 Phl plNoCysA 1-6,115-119，213-220 的 T-細胞反應性僅輕微降低，這證實了關鍵T-細胞表位的保留。
[0108]表1:通過采用Phl pi反應性T-細胞系(TCLs)進行的增殖試驗對PhlplNoCys、Phl plNoCysA213-220 和 Phl plNoCys Λ 1-6，115-119，213-220 的 T-細胞反應性的測定
【權利要求】
1.Phl Pl變體，其特征在于與已知野生型變應原相比，其IgE反應性降低，并基本保持了 T-淋巴細胞反應性，并且，相應于圖1中所示成熟Phl pi蛋白的氨基酸位置41、57、69、72、77、83和139上的半胱氨酸缺失。
2.權利要求1的Phlpi變體，其特征在于相應于圖1中所示成熟Phl pi蛋白的氨基酸位置41、57、69、72、77、83和139上的半胱氨酸被另一種氨基酸取代。
3.權利要求2的Phlpi變體，其特征在于相應于圖1中所示成熟Phl pi蛋白的氨基酸位置41、57、69、72、77、83和139上的半胱氨酸被絲氨酸取代。
4.權利要求1-3的任一項的Phlpi變體，其特征在于與野生型變應原相比，相應于圖1中所示成熟Phl pi蛋白一級序列中氨基酸1-6、1-30、92-104、115-119、175-185和213-220的至少一個區域或多個區域的組合缺失。
5.權利要求1-3的任一項的Phlpi變體，其中相應于圖1中所示成熟Phl pi序列的氨基酸213-220缺失。
6.權利要求4的Phlpi變體，其中相應于圖1中所示成熟Phl pi序列的氨基酸1-6、115-119 和 213-220 缺失。
7.權利要求1-3的任一項的Phlpi變體，其特征在于它們通過重組遺傳工程方法獲得。
8.編碼權利要求1-7的任一項的Phlpi變體的DNA分子。
9.重組表達載體，含有權利要求8的DNA分子。
10.由權利要求8的DNA分子或權利要求9的表達載體轉化的宿主生物，所述宿主生物是細菌或酵母。
11.制備權利要求1-7的任一項的PhlPl變體的方法，包括培養權利要求10的宿主生物，并從培養物中分離相應的Phl pi變體。
12.權利要求1-7的任一項的Phlpi變體在制備藥物中的用途。
13.用于預防和治療變態反應的藥物組合物，含有至少一種權利要求1-7的任一項的Phl Pl變體，其中禾本科物種的I類變應原參與所述變態反應的觸發。
14.權利要求13的藥物組合物，其含有其它活性化合物和/或佐劑。
15.至少一種權利要求1-7的任一項的Phlpi變體在制備用于預防和治療變態反應的藥物中的用途，其中禾本科物種來源的I類變應原參與所述變態反應的觸發。
16.權利要求8的DNA分子在制備藥物中的用途。
17.權利要求9的重組表達載體在制備藥物中的用途。
18.用于對患有變態反應的患者進行免疫治療性DNA接種和/或預防這種變態反應的藥物組合物，其中禾本科的I類變應原參與所述變態反應的觸發，所述組合物含有至少一種權利要求8的DNA分子或至少一種權利要求9的表達載體。
19.權利要求18的藥物組合物，其含有其它活性化合物和/或佐劑。
20.至少一種權利要求8的DNA分子或至少一種權利要求9的表達載體在制備用于對患有變態反應的患者進行免疫治療性DNA接種和/或預防這種變態反應的藥物中的用途，其中禾本科的I類變應原參與所述變態反應的觸發。
【文檔編號】A61K38/16GK103467583SQ201310439265
【公開日】2013年12月25日 申請日期:2005年7月11日 優先權日:2004年7月21日
【發明者】H.菲比格, M.沃爾德, A.南迪, H.卡勒特, B.韋伯, O.克羅姆維爾 申請人:默克專利股份公司