一種降低納米遞藥材料體內外毒性藥物復合物及其制備方法

一種降低納米遞藥材料體內外毒性藥物復合物及其制備方法
【專利摘要】本發明屬生物【技術領域】，涉及種降低納米遞藥材料體內外毒性藥物復合物及其制備方法。本發明采用生物技術手段降低納米遞藥材料體內外毒性，通過采用生物技術手段干預細胞自噬調控納米材料的體內外毒性，減少納米材料的不良副作用，從而提高納米材料應用的安全性。本發明具體提供了自噬干預手段包括但不限于自噬干預藥物（化合物/多肽）、自噬相關基因、自噬相關信號通路蛋白阻斷劑與納米材料組合而成的復合物。
【專利說明】一種降低納米遞藥材料體內外毒性藥物復合物及其制備方法

【技術領域】
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[0001]本發明屬生物【技術領域】，涉及調控納米遞藥材料體內外毒性的方法，具體涉及一種降低納米遞藥材料體內外毒性的藥物復合物及其制備方法和用途，更具體地講，是提供一種利用生物技術手段干預細胞自噬進行調控納米遞藥材料的體內外毒性。

【背景技術】
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[0002]現有技術公開了有關納米材料主要包括納米顆粒、納米線、納米薄膜、納米管和納米固體材料等，由于這類材料尺寸處于原子簇和宏觀物體交界的交匯區域，納米醫藥材料具有普通宏觀材料所不具備的物理化學特性，因而廣泛應用于藥物遞送、疾病診斷、組織工程、治療藥物開發等領域(McCarthy JR, WeisslederR.Multifunct1nal magnetic nanoparticles for targeted imaging and therapy.Adv Drug Deliv Rev2008;60:1241-1251.Petros RA，DeSimone JM.Strategies inthe design of nanoparticles for therapeutic applicat1ns.Nat Rev DrugDisCOV2010;9:615-627.)。作為理想的藥物遞送材料，納米醫藥材料被廣泛用于病毒感染、腫瘤治療等研究中(Mukerjee A, Ranjan APj Vishwanatha JK.Combinatorialnanoparticles for cancer diagnosis and therapy.Curr Med Chem2012;19:3714-3721.Wang Bj Navath RS，Menjoge AR,Balakrishnan B，Bellair R，Dai H，RomeroRjet al.1nhibit1n of bacterial growth and intramn1tic infect1n ina guinea pig model of chor1amn1nitis using PAMAM dendrimers.1nt JPharm2010;395:298-308.)。
[0003]實踐顯示，盡管納米醫藥材料在藥物遞送領域具有廣泛的應用前景，但其仍存在一定的安全性問題。因此納米遞藥材料在分子、細胞、器官及生物個體水平引發的特殊生物學效應被廣泛研究，如研究發現碳納米管在生物體內可產生R0S，引起氧化應激反應、脂質過氧化反應、線粒體損傷及細胞形態改變(Lanone S，Andujar P, KermanizadehA, Boczkowski J.Determinants of carbon nanotube toxicity.Adv Drug DelivRev.2013 ;do1:10.1016/j.addr.2013.07.019.);聚乳酸聚乙醇酸共聚物(PLGA)對肺表皮細胞具有細胞毒性，可引起線粒體功能損傷，誘發強烈的免疫反應，誘導炎性細胞因子的釋放(Grabowski N，Hillaireau H, Vergnaud J，Santiago LA, Kerdine-Romer S，PallardyM，Tsapis N，Fattal E Toxicity of surface-modified PLGA nanoparticles towardlung alveolar epithelial cells.1nt J Pharm.2013;454(2):686-94.);聚乙烯亞胺(PEI)陽離子納米顆粒對人正常支氣管表皮細胞具有細胞毒性(Zhang H，Xia T, MengH，Xue M，George S，Ji Zj Wang X，Liu Rj Wang M，France B，Rallo Rj Damoiseaux R，CohenYj Bradley KA，Zink JIj Nel AE Differential express1n of syndecan-lmediatescat1nic nanoparticle toxicity in undifferentiated versus differentiated normalhuman bronchial epithelial cells.ACS Nan0.201126; 5:2756-69.);樹枝狀大分子聚合物可引起急性肺損傷，導致血液斑塊形成，影響血小板的功能(Li C，Liu H, Sun Y, WangH，Guo F，Rao S，Deng Jj et al.PAMAM nanoparticles promote acute lung injury byinducing autophagic cell death through the Akt-TSC2_mT0R signaling pathway.J Mol Cell B1l2009;1:37-45.Jones CF，Campbell RA, Brooks AE，Assemi S，TadjikiSj Thiagarajan G，Mulcock C，et al.Cat1nic PAMAM dendrimers aggressively initiateblood clot format1n.ACS Nano2012;6:9900-9910.Jones CF，Campbell RA, FranksZj Gibson CCj Thiagarajan G，Vieira-de-Abreu A，Sukavaneshvar S，et al.Cat1nicPAMAM dendrimers disrupt key platelet funct1ns.Mol Pharm2012;9:1599-1611.)。為了保證納米醫藥材料在準確投遞藥物的同時減少其對正常器官組織的不良作用，目前多采用化學修飾手段將納米遞藥材料與具有靶向性的多肽、化合物等結合，使納米遞藥材料具有專一靶向性。研究人員發現膽堿衍生物修飾的多枝狀左旋聚賴氨酸納米材料可實現腦革巴向基因藥物遞送(Li J, Zhou L, Ye D, Huang S，Shao K, Huang R, Han L, etal.Choline-derivate-modified nanoparticles for brain-targetinggene delivery.Adv Mater2011 ;23:4516-4520.);基質金屬蛋白酶2可剪切肽、酸激活受體特異性肽配體修飾后的納米遞藥材料均可有效實現腫瘤祀向(Huang S，Shao K, Liu Y, Kuang Y, LiJj An S，Guo Y，et al.Tumor-targeting and microenvironment-responsive smartnanoparticles for combinat1n therapy of antiang1genesis and apoptosis.ACSNano2013; 7:2860-2871.Han L，Guo Y，Ma H，He X，Kuang Y，Zhang N，Lim E，et al.AcidActive Receptor-Specific Peptide Ligand for In Vivo Tumor-Targeted Delivery.Small2013.do1: 10.1002/smll.201300279.);此外，豆蔻酸修飾后的聚乙烯亞胺/DNA納米材料可用于神經膠質瘤的靶向基因治療，RGDyK修飾的脂質體也可用于神經膠質瘤的靶向分子治療(Li Jj Gu B，Meng Qj Yan Zj Gao H，Chen X，Yang X，et al.The use of myristicacid as a ligand of polyethylenimine/DNA nanoparticles for targeted genetherapy of gl1blastoma.Nanotechnology2011;22:435101.Li C，Shen Jj Wei Xj XieC，Lu W.Targeted delivery of a novel palmitylated D—peptide for antigl1blastomamolecular therapy.J Drug Target2012; 20:264-271.) □然而，納米遞藥材料引發特殊生物學效應的機制目前仍不清楚，作用機制的不明確給納米遞藥材料的大規模走向市場安全應用帶來了巨大的挑戰。
[0004]近年來大量研究發現細胞自噬與納米遞藥材料的不良反應密切相關。已有的前瞻性初步研究發現多種納米遞藥材料都能誘導細胞自噬，但目前僅局限于現象的研究，對于深入的分子機理研究了解較少(Man N，Yu Lj Yu SHj Wen LP.Rare earth oxidenanocrystals as a new class of autophagy inducers.Autophagy.2010;6:310-1.Hussain Sj Garantz1tis S.1nterplay between apoptotic and autophagy pathwaysafter exposure to cerium d1xide nanoparticles in human monocytes.Autophagy.2013do1:10.4161/aut0.22266.)。
[0005]細胞自噬(autophagy)是原核和真核生物中進化保守的對細胞內物質進行周轉的重要過程，負責講解細胞內長壽蛋白及損傷的細胞器等，是維持細胞內環境穩定的重要手段(Levine B, Kroemer G.Autophagy in the pathogenesis of disease.Cell2008; 132:27-42.) 0細胞自噬的主要特征是雙層膜結構的形成，其發生與mTORCl的抑制，自噬相關蛋白(Atgs)的表達及相關信號通路的激活密切相關(Corradetti MN, GuanKL.Upstream of the mammalian target of rapamycin:do all roads pass throughmT0R?0ncogene2006;25:6347-6360.He C, Kl1nsky DJ.Regulat1n mechanisms andsignaling pathways of autophagy.Annu Rev Genet 2009;43:67-93.)? 細胞自曬(autophagy)又叫II型程序性死亡(type II programmed cell death),是真核生物體內常見的“自我消化”(cellular degradat1n)的現象，能分解細胞內受損或多余的細胞器和蛋白產生核苷酸，氨基酸等小分子物質供細胞合成新的蛋白質，并能維持細胞內微環境的穩定。近年來隨著分子生物學及基因技術的發展和對細胞自噬的深入認識，發現其與多種疾病，尤其是腫瘤的發展關系密切。根據細胞內底物運送到溶酶體腔內方式的不同，哺乳動物細胞自卩遼可分為三種方式:大自曬(macroautophagy)、小自卩遼(microautophagy)和分子伴侶介導的自卩遼(chaperone-mediated autophagy, CMA)。主要概述的大自卩遼(以下簡稱自曬)與腫瘤發展及治療關系最為密切(Sridhar S, Botbol Y, Macian F，et al.Autophagyand disease:always two sides to a problem.J Pathol.2012;226(2):255-73.)。自噬是胞漿大分子物質和細胞器在雙層膜包囊泡中大量降解的生物學過程。該過程大致能分為4個階段:1.在饑餓、缺氧、藥物干擾等某些因素的刺激下，自噬泡的雙層膜結構開始逐漸形成并包圍在被降解物的周圍。2.自噬泡完全成型并將要被降解的物質完全隔離于細胞質。3.自噬體與溶酶體融合形成自噬溶酶體。4.自噬溶酶體最終被溶酶體中的水解酶溶解，降解產物可以在細胞內再循環利用。(Martinez-Borra J, Lopez-LarreaC.Autophagy and self-defense.Adv Exp Med B1l.2012; 738:169-84.)。自卩遼能對細胞對外部環境改變及各種刺激產生應激反應。細胞在生長條件下能發生較低水平的自噬，稱基礎自噬。然而，一旦受到外界的刺激，如饑餓、缺氧、高溫、高細胞密度或是生長因子剝奪等，細胞自噬的水平將會迅速上調。如在營養物質缺乏的情況下，細胞自噬能分解體內壞死細胞器產生氨基酸等供細胞合成新的蛋白質，維持細胞的存活(①Piacentini M, D’ElettoM，Falasca Lj et al.Transglutaminase2at the crossroads between cell death andsurvival.Adv Enzymol Relat Areas Mol B1l.2011;78:197-246 ;② Cook KLj ShajahanAN，Clarke R.Autophagy and endocrine resistance in breast cancer.Expert RevAnticancer Ther.2011; 11 (8): 1283-94.；(3) Wirawan Ej Vanden Berghe T，Lippens S，etal.Autophagy: for better or for worse.Cell Res.2012;22(I):43-61.)0
[0006]研究還顯示，自噬能降解折疊錯誤的蛋白質、損傷的細胞器等，延緩機體衰老的發生。集體衰老相關疾病一神經退行性疾病可以被歸類為蛋白構象錯誤疾病，一般是由于大量折疊錯誤的蛋白質在細胞內堆積從而引發細胞毒性而造成的。研究表明，大量衰老性疾病，如神經退行性疾病和惡性腫瘤都與細胞自噬密切相關(① Martinez-Borra Jj Lopez-Larrea C.Autophagy and self-defense.Adv Exp MedB1l.2012;738:169-84.;② Caballero B, Coto-Montes A.An insight into the roleof autophagy in cell responses in the aging and neurodegenerative brain.Histol Histopathol.2012;27(3):263-75.；③ Mendelsohn AR, Larrick JW.Rapamycinas an antiaging therapeutic?:targeting mammalian target of rapamycin to treatHutchinson-Gilford progeria and neurodegenerative diseases.Rejuvenat1nRes.2011:14(4):437-41.)。
[0007]細胞自噬在生物體的發育和分化過程中起了重要作用。據報道，自噬基因缺失或者突變的線蟲生長發育缺陷、衰老加速并縮短壽命；并且自噬也參與果蠅變態的發生。此外自曬在哺乳動物成年個體組織器官發育和分化中也起了重要作用(Mizushima N, KomatsuΜ.Autophagy:renovat1n of cells and tissues.Cell.2011;147 (4):728-41.)。
[0008]此外作為程序性細胞死亡的一種，細胞自噬能通過多種途徑直接或是間接導致細胞死亡。(Denton D, Nicolson S，Kumar S.Cell death by autophagy: facts and apparentartefacts.Cell Death Differ.2012;19(I):87-95.)。
[0009]細胞在一些特定的條件下，由于一系列因素的影響導致了各類基因突變從而導致的細胞各類遺傳性狀及功能改變。這類改變可能將具有正常功能和特性的細胞轉變為具有分裂迅速、抗凋亡等惡性特征的細胞即癌細胞。研究表明，腫瘤的發生與發展和自噬的關系極為密切。
[0010]一般來說，由于細胞自噬有利于細胞的存活，因此無論在正常細胞或是腫瘤細胞中，自噬都普遍被保留下來，并且在一般情況下都維持著基礎自噬。但是自噬究竟是抑制還是促進腫瘤細胞的發生發展目前尚沒有定論。自噬初期可以作為腫瘤發生的一種抑制因素，一些已知的腫瘤抑制因子，例如PTEN、TSCl和TSC2能激活自噬，并且對自噬的抑制可使蛋白降解減少，合成代謝增加，最終導致原癌細胞持續增殖。大多數腫瘤細胞(如肝、胰腺、乳腺癌等)盡管癌變前自噬能力各有不同，但是在癌變之后其自噬能力均減弱。自曬缺乏可引起自曬底物p62積聚，通過NF-κ B信號途徑引起腫瘤形成(TrocoliA,Djavaher1-Mergny M.The complex interplay between autophagy and NF- κ Bsignaling pathways in cancer cells.Am J Cancer Res.2011; I (5):629-49.)。然而在腫瘤生長到一定程度時，尤其是當腫瘤內還沒有形成足夠的血管為其擴增提供營養時，腫瘤細胞也可以通過自噬來克服營養缺乏和低氧的環境得以生存。研究表明，在缺乏血清或氨基酸的情況下約3h，HeLa細胞中的自噬部分從4%上升到37%。這也說明了在營養缺乏等條件下自卩遼也是腫瘤細胞的一種自我保護的機制(Baldwin AS.Regulat1n of celldeath and autophagy by IKK and NF-κ B:critical mechanisms in immune funct1nand cancer.Tmmunol Rev.2012;246(I):327-45.) ?
[0011]越來越多的證據表明，細胞自噬影響很多關鍵的細胞過程，如程序性細胞死亡、細胞增殖、炎癥反應和固有免疫功能等，因此，細胞自噬可能在納米遞藥材料的安全應用中起決定性作用。研究發現富勒烯能夠在細胞內產生ROS并誘導細胞自噬，可促進化療藥物阿霉素和順鉬殺傷腫瘤細胞的能力(Zhang Q, Yang W，Man N, Zheng F，Shen Y, Sun Κ, LiY, et al.Autophagy-mediated chemosensitizat1n in cancer cells by fullereneC60nanocrystal.Autophagy2009; 5:1107-1117.);此外,基因運輸載體陽離子脂質體，納米膠束等納米遞藥材料均能誘導細胞自曬，其具體機制仍有待進一步研究(Man N, ChenY,Zheng F，Zhou W，Wen LP.1nduct1n of genuine autophagy by cat1nic lipids inmammalian cells.Autophagy2010;6:449-454.Halamoda Kenzaoui B, Chapuis BernasconiC, Guney-Ayra S, Juillerat-Jeanneret L.1nduct1n of oxidative stress, lysosomeactivat1n and autophagy by nanoparticles in human brain-derived endothelialcells.B1chem J2012;441:813-821.)。
【發明內容】
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[0012]本發明的目的是一種調控納米遞藥材料體內外毒性的方法，具體涉及通過制備細胞自噬干預藥物與納米遞藥材料的復合物，實現通過干預細胞自噬降低納米材料體內外毒性，減少納米材料的副作用和不良反應，提高納米材料應用的安全性。尤其涉及一種降低納米遞藥材料體內外毒性藥物復合物及其制備方法。
[0013]本發明提供了通過自噬干預手段與納米材料聯合作用，制得降低納米遞藥材料體內外毒性藥物復合物，所述自噬干預手段包括但不限于自噬干預藥物(化合物/多肽)、自噬相關基因、自噬相關信號通路蛋白阻斷劑與納米材料組合而成的復合物。
[0014]更具體的，本發明的種降低納米遞藥材料體內外毒性藥物組合物由納米材料與細胞自噬干預藥物組成。
[0015]本發明中，所述納米遞藥材料包括但不局限于樹枝狀大分子(PAMAMDendrimers)，聚乳酸聚乙二醇酸共聚物(PLGA)，碳納米管，聚乙烯亞胺(PEI )，量子點。
[0016]本發明中，所述細胞自噬干預藥物包括但不限于3-甲基腺嘌呤、氯喹、羥基氯喹、渥曼青霉素、LY294002、放線菌酮、巴伐洛霉素Al等細胞自噬抑制劑、雷帕霉素、海藻糖等細胞自噬激活劑，自噬相關基因的siRNA，shRNA。
[0017]本發明中，所述復合物的形成方法包括但不限于藥物與納米材料之間離子相互作用、化學鍵形成反應、物理結合和生物反應。
[0018]本發明中，所述復合物以選自以下一組中的形式進行配方:具體包括但不限于固體、溶液、分散劑、膠束、乳劑、脂質體、納米微球等。
[0019]本發明中，所述復合物中的組成成分序貫使用能減輕納米材料的體內和體外毒性,增強納米材料的安全性。
[0020]在本發明的實施例中，公開了一種細胞自噬干預藥物如氯喹與納米遞藥材料如樹枝狀大分子形成復合物或序貫使用的方法。正常的BALB/C雌鼠通過腹腔注射樹枝狀大分子(PAMAM dendrimers)可引起納米材料中毒反應,具體表現為體重急劇減輕,肝功能損傷，細胞自噬水平提高。采用細胞自噬抑制劑干預樹枝狀大分子誘導的細胞自噬，可明顯減輕樹枝狀大分子對正常BALB/C雌鼠的毒性及肝損傷。
[0021]本發明還提供了細胞自噬干預藥物與納米遞藥材料復合物的用途，具體為:包括但不限于藥物遞送、醫學影像、疾病診斷、腫瘤治療。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0022]圖1、PAMAM樹枝狀大分子引起人肝細胞生長抑制。
[0023]圖2、PAMAM樹枝狀大分子引起人肝細胞發生細胞凋亡。
[0024]圖3、PAMAM樹枝狀大分子引起人肝細胞線粒體膜電位降低。
[0025]圖4、PAMAM樹枝狀大分子引起人肝細胞細胞自噬體形成。
[0026]圖5、PAMAM樹枝狀大分子引起人肝細胞自噬相關熒光產生。
[0027]圖6、PAMAM樹枝狀大分子引起人正常肝細胞LC3-1I表達量增加。
[0028]圖7、3-甲基腺嘌呤抑制細胞自噬削弱PAMAM引起的肝細胞生長抑制。
[0029]圖8、3-甲基腺嘌呤抑制細胞自噬削弱PAMAM引起的肝細胞LC3-1I表達減少。
[0030]圖9、氯喹抑制細胞自噬削弱PAMAM引起的肝細胞生長抑制。
[0031]圖10、氯喹抑制細胞自噬削弱PAMAM引起的肝細胞LC3-1I表達增加。
[0032]圖11、NAC抑制活性氧削弱PAMAM引起的肝細胞生長抑制。
[0033]圖12、NAC抑制活性氧削弱PAMAM引起的肝細胞LC3-1I表達增加。
[0034]圖13、氯喹可明顯削弱PAMAM樹枝狀大分子引起的動物體重降低。
[0035]圖14、氯喹可明顯削弱PAMAM樹枝狀大分子引起的動物肝重降低。
[0036]圖15、氯喹可明顯削弱PAMAM樹枝狀大分子引起的動物肝損傷。
[0037]圖16、氯喹抑制細胞自噬削弱樹枝狀大分子引起的肝臟關鍵酶指標異常。
[0038]圖17、抑制細胞自噬可明顯削弱量子點引起的腎細胞生長抑制。
[0039]圖18、抑制細胞自噬可明顯削弱PAMAM引起的神經細胞的生長抑制。

【具體實施方式】
[0040]以下結合附圖并通過具體實施例進一步說明但不限定本發明。
[0041]實施例1、樹枝狀大分子對人肝細胞具有細胞毒性
[0042]人正常肝細胞HL7702，肝癌細胞SMMC7721，HepG2用不同濃度的PAMAMdendriemrs (12.5 μ g/ml-100 μ g/ml)處理24小時，以未處理的細胞為陰性對照采用MTT法測定相對細胞活力，實驗結果如圖1所示；采用Annexin V/PI對細胞進行染色,采用流式細胞儀對細胞凋亡情況進行檢測，實驗結果如圖2所示；采用JC-1對下次報進行染色，采用流式細胞儀對線粒體膜電位的崩塌情況進行檢測，實驗結果如圖3所示。
[0043]實施例2、樹枝狀大分子誘導人肝細胞發生細胞自噬
[0044]人正常肝細胞HL7702，肝癌細胞SMMC7721，HepG2用100 μ g/ml的樹枝狀大分子處理24h后，進行石蠟包埋、切片、染色，在透射電子顯微鏡下觀察細胞亞顯微結構，結果如圖4所示，給藥組細胞內有大量的典型的雙層膜結構自噬體，而對照組則未發現。
[0045]人正常肝細胞HL7702，肝癌細胞SMMC7721，HepG2用100 μ g/ml的樹枝狀大分子處理24h后，采用Cyto-1D細胞自噬檢測熒光染料進行染色，在激光共聚焦顯微鏡下觀察，結果如圖5所示，給藥組細胞和雷帕霉素作用組細胞可觀察到明顯的綠色熒光，而對照組綠色熒光強度很弱。
[0046]人正常肝細胞HL7702，肝癌細胞SMMC7721，HepG2細胞用100 μ g/ml的樹枝狀大分子處理不同時間后，將離心收集到的細胞用PBS洗I次，用RIPA試劑盒裂解細胞，并定量后按照每個泳道20 μ g進行蛋白電泳后轉膜至PVDF膜上，用5%脫脂牛奶封閉lh，分別加入LC3b和β -actin抗體，于4°C孵育12h。TBST洗膜后加入二抗室溫孵育1.5h，用ECL顯色液顯色。人正常肝細胞HL7702，肝癌細胞SMMC7721，HepG2細胞經過樹枝狀大分子處理不同時間或不同濃度處理后，通過Western Blot的檢測，實驗結果如圖6所示,與對照組相t匕，給予樹枝狀大分子細胞的LC3 II的表達水平增強。
[0047]實施例3、3_甲基腺嘌呤抑制細胞自噬削弱樹枝狀大分子引起的肝細胞生長抑制
[0048]人正常肝細胞HL7702 用不同濃度的 PAMAM dendriemrsC 12.5 μ g/ml-100 μ g/ml)處理24小時，給藥前3h加入3-甲基腺嘌呤處理細胞，24h后采用MTT法測定各組的細胞活力。實驗結果如圖7所示，3-甲基腺嘌呤預處理可明顯削弱樹枝狀大分子引起的肝細胞的生長抑制。將離心收集到的細胞用PBS洗I次，用RIPA試劑盒裂解細胞，并定量后按照每個泳道20yg進行蛋白電泳后轉膜至PVDF膜上，用5%脫脂牛奶封閉lh，分別加入LC3b和β -actin抗體，于4°C孵育12h。TBST洗膜后加入二抗室溫孵育1.5h，用ECL顯色液顯色。實驗結果如圖8所示。實施例4、氯喹抑制細胞自噬削弱樹枝狀大分子引起的肝細胞生長抑制
[0049]人正常肝細胞HL7702 用不同濃度的 PAMAM dendriemrsC 12.5 μ g/ml-100 μ g/ml)處理24小時，給藥前3h加入3-甲基腺嘌呤處理細胞，24h后采用MTT法測定各組的細胞活力。實驗結果如圖9所示，3-甲基腺嘌呤預處理可明顯削弱樹枝狀大分子引起的肝細胞的生長抑制。將離心收集到的細胞用PBS洗I次，用RIPA試劑盒裂解細胞，并定量后按照每個泳道20yg進行蛋白電泳后轉膜至PVDF膜上，用5%脫脂牛奶封閉lh，分別加入LC3b和β -actin抗體，于4°C孵育12h。TBST洗膜后加入二抗室溫孵育1.5h，用ECL顯色液顯色。實驗結果如圖10所示。
[0050]實施例5、抑制活性氧可削弱樹枝狀大分子引起的肝細胞生長抑制
[0051]人正常肝細胞HL7702 用不同濃度的 PAMAM dendriemrsC 12.5 μ g/ml-100 μ g/ml)處理24小時，給藥前3h加入NAC處理細胞，24h后采用MTT法測定各組的細胞活力。實驗結果如圖11所示，NAC預處理可明顯削弱樹枝狀大分子引起的肝細胞的生長抑制。將離心收集到的細胞用PBS洗I次，用RIPA試劑盒裂解細胞，并定量后按照每個泳道20 μ g進行蛋白電泳后轉膜至PVDF膜上，用5%脫脂牛奶封閉lh，分別加入LC3b和β -actin抗體，于4°C孵育12h。TBST洗膜后加入二抗室溫孵育1.5h，用ECL顯色液顯色。實驗結果如圖12所示。
[0052]實施例6、氯喹抑制細胞自噬削弱樹枝狀大分子引起的肝損傷
[0053]BALB/C雌鼠分為4組，分別為對照組，PAMAM處理組(100mg/kg )，氯喹處理組(50mg/kg),聯合用藥組(PAMAM100mg/kg+CQ50mg/kg)。每天記錄體重變化，實驗結果如圖13所示；實驗10天后，處死小鼠，記錄肝重變化，實驗結果如圖14所示；將各組肝組織進行切片并HE染色觀察，實驗結果如圖15所示。
[0054]實施例7、氯喹抑制細胞自噬削弱樹枝狀大分子引起的肝臟關鍵酶指標異常
[0055]將各實驗組動物肝臟研磨，采用酶標儀測定各組實驗動物肝臟中谷丙轉氨酶、谷草轉氨酶、堿性磷酸酶、甘油三酯、總膽固醇含量的變化，實驗結果如圖16所示。
[0056]實施例8、抑制細胞自噬削弱量子點引起的腎細胞生長抑制
[0057]人正常腎細胞用40nM的量子點處理不同時間，給藥前3h加入3_甲基腺嘌呤、氯喹或氯化銨處理細胞，24h后采用MTT法測定各組的細胞活力。實驗結果如圖17所示，抑制細胞自噬可顯著削弱量子點引起的腎細胞生長抑制。
[0058]實施例9、抑制細胞自噬削弱樹枝狀大分子引起的神經細胞生長抑制
[0059]人神經膠質瘤細胞U118米用100 μ g/ml PAMAM dendrimers G5處理24h,給藥前3小時加入4μ M氯喹處理細胞，24h后采用MTT法測定各組的細胞活力。實驗結果如圖18所示，抑制細胞自噬能顯著削弱PAMAM引起的神經細胞的生長抑制。
[0060]以上實施例僅起說明的作用。不能也不應將它們視為對本發明范圍或精神的限制。本領域技術人員可以理解對于本發明的目的而言，可使用其他變化或替代形式。而本發明的目的僅由本說明書和所附權利要求書定義。
【權利要求】
1.一種降低納米遞藥材料體內外毒性藥物復合物，其特征在于，該藥物復合物由納米遞藥材料與細胞自噬干預藥物組成藥物復合物。
2.如權利要求1所述的降低納米遞藥材料體內外毒性藥物復合物，其特征在于，所述納米遞藥材料選自樹枝狀大分子(PAMAM Dendrimers),聚乳酸聚乙二醇酸共聚物(PLGA),碳納米管，聚乙烯亞胺(PEI)或量子點。
3.如權利要求1所述的降低納米遞藥材料體內外毒性藥物復合物，其特征在于，所述細胞自噬干預藥物選自細胞自噬抑制劑、細胞自噬激活劑或自噬相關基因。
4.如權利要求3所述的降低納米遞藥材料體內外毒性藥物復合物，其特征在于，所述細胞自噬抑制劑選自3-甲基腺嘌呤、氯喹、羥基氯喹、渥曼青霉素、LY294002、放線菌酮或巴伐洛霉素Al。
5.如權利要求3所述的降低納米遞藥材料體內外毒性藥物復合物，其特征在于，所述細胞自噬激活劑選自雷帕霉素或海藻糖。
6.如權利要求3所述的降低納米遞藥材料體內外毒性藥物復合物，其特征在于，所述自噬相關基因是siRNA或shRNA。
7.如權利要求1所述的降低納米遞藥材料體內外毒性藥物復合物，其特征在于，所述復合物由一種或多種自噬干預藥物與一種或多種所述的納米材料組成。
8.如權利要求7所述的降低納米遞藥材料體內外毒性藥物復合物，其特征在于，所述復合物的組成方法為藥物與納米材料之間離子相互作用、化學鍵形成反應、物理結合或生物反應。
9.如權利要求1所述的降低納米遞藥材料體內外毒性藥物復合物，其特征在于，所述復合物選自以下一組中的形式進行配方:固體、溶液、分散劑、膠束、乳劑、脂質體或納米微球。
10.權利要求1的降低納米遞藥材料體內外毒性藥物復合物在制備藥物遞送、醫學影像、疾病診斷或腫瘤治療制劑中的用途。
11.如權利要求10的用途，其特征在于，所述的藥物復合物的組分序貫使用。
【文檔編號】A61K48/00GK104511017SQ201310460943
【公開日】2015年4月15日 申請日期:2013年9月29日 優先權日:2013年9月29日
【發明者】鞠佃文, 李玉彬, 曾賢, 錢曉璐, 王紹飛, 王子玉, 范佳君, 孫筠, 宋平, 馮美卿 申請人:復旦大學