專利名稱：碳納米材料儲備液及采用其的碳納米材料細胞毒性的測定方法
技術領域：
本發明涉及一種反映原形碳納米材料和細胞直接相互作用結果的碳納 米材料細胞毒性的測定方法，以及其中所用到的一種不含蛋白質的碳納米材 料儲備液。
背景技術：
當前，由于富勒烯(C60)、碳納米管(CNTs)等碳納米材料的發現及大量 生產，國內外掀起了評估碳納米材料對人類健康和環境所產生的影響的熱 潮。但是，碳納米材料細胞毒性測定方法會在一定程度上影響其生物安全性 的評估。目前，常用的檢測方法大致有如下幾種:臺盼蘭染色直接計數存活率， MTT或WST染色測紫外吸收，PI染色用流式細胞儀計數細胞存活率， Bradford法測蛋白濃度間接指示細胞存活率。每種檢測方法都各有其優缺點。 臺盼蘭染色直接計數法相對準確，但缺點是需要對大量樣本進行計數才具有 統計學意義，比較費時費力，此外還會有一些人為因素的干擾。基于MTT 和WST染色測紫外的方法是目前細胞毒性檢測最常用的方法，用該法檢測碳納米材料細胞毒性的一般步驟為(1)取常規細胞培養液(含胎牛血清) 中的細胞，按實驗設計的密度接種于細胞培養板中，培養過夜。(2)碳納米 材料分散在儲備液中。(3) —定量的碳納米材料儲備液加入到細胞中至設計 濃度(無碳納米材料的對照組加入等體積儲備液)，37。C5y。C02培養箱孵育 實驗所需時間。(4)孵育結束后，MTT法檢測細胞存活率。其中，碳納米材 料具有極大的比表面積和較高的化學活性，很容易和染料分子發生相互作用 而使實驗結果偏離真值。PI是一種使死細胞著色而活細胞拒染的染料，細胞懸液經染色后使用流式細胞儀檢測其存活率，該法快速簡便，但也存在碳納米材料與染料分子相互作用的缺點。Bradford法與上述方法有較大不同，細 胞用PBS重懸多次后裂解，測上清中蛋白濃度以指示細胞數量，該法排除 了納米材料與染料分子接觸對實驗結果的干擾，但是，細胞在不同的生理生 化狀態下，其總蛋白含量不盡相同，因此該法在實用性上也存在局限性。此外，納米材料儲備液的配置方法也不盡相同，主要有兩大類含10% 胎牛血清的細胞培養液和不含胎牛血清的細胞培養液，還有一些研究中把納 米材料分散于純水中。由于碳納米材料極高的比表面積，同樣易于和其所處 溶液介質中的蛋白和其它分子發生相互作用而使毒性檢測結果不盡相同。目 前，有關碳納米材料安全性評估的實驗結果多而雜亂，且很多結果不一致甚 至是相反的，這其中，沒有一個統一的碳納米材料細胞毒性檢測方法是造成 這種現象的重要原因之一。發明內容本發明要解決的技術問題即是提供一種可反映原形碳納米材料和細胞 直接相互作用結果而使結果更準確的碳納米材料細胞毒性的測定方法，以及 其中所用到的一種不含蛋白質的碳納米材料儲備液。由于碳納米材料很快(不到5min)就被常規培養液中的蛋白包裹，形 成蛋白納米管，因此所測得的毒性大大降低，沒反映原形碳納米材料的細胞 毒性。為此，本發明擬以常用的MTT測定方法為基礎，在碳納米材料和細 胞接觸和作用之前，避免碳納米材料與環境介質中的蛋白和其他分子的非共 價結合；另外，還避免未被細胞內化的碳納米材料與MTT染料分子發生相 互作用而影響結果。為此，需將接種于細胞培養板中進行培養的細胞的細胞 培養液去除后再加入碳納米材料儲備液，且未被細胞內化的碳納米材料也需 去除，更主要的是所用的碳納米材料儲備液也避免采用含有蛋白的常規細 胞培養液來配制，然而該儲備液還需滿足在較短時間內維持細胞生理活性的功能。本發明人經過研究發現，選用類似生理介質的磷酸鹽緩沖液(PBS) 作為介質溶液來配制碳納米材料儲備液，孵育一定時間后使碳納米材料充分 為細胞所內化且維持細胞的生理活性，由此保證得到的是原形碳納米材料和 細胞直接相互作用的結果。
因此，解決上述技術問題的技術方案之一為 一種碳納米材料儲備液， 其可以選用磷酸鹽緩沖液作為介質溶液。
根據本發明，所述的碳納米材料可選自單壁碳納米管，多壁碳納米管， 納米碳黑，C6Q富勒烯及其衍生物中的一種或幾種。
其中，所述的C6Q富勒烯衍生物優選其羥基衍生物——富勒醇C6()(OH)x， 本發明選用x-22-24的混合物為例來說明。
根據本發明，所述的磷酸鹽緩沖液選用現細胞學試驗中常用的濃度為 O.OIM， pH值為7.2-7.4的PBS。
另外，本發明碳納米材料細胞毒性的測定方法的技術方案，可以包括以
下步驟
(1) 將接種于細胞培養板中進行培養的細胞的常規細胞培養液去除，加入 上述碳納米材料儲備液，孵育2-3小時；
(2) 孵育后，除去未被細胞內化的碳納米材料；
(3) 加入常規細胞培養液，繼續孵育；
(4) 孵育結束后，MTT染色檢測細胞存活率。
根據本發明，步驟(2)采用PBS洗除未被細胞內化的碳納米材料。 本發明測定方法所適用的細胞可以是貼壁細胞，也可以是懸浮細胞。 根據本發明，所述的常規細胞培養液可以是現有任何用于體外細胞培養 的培養液，如含l(m(v:v)胎牛血清的RPMI1640細胞培養液，含10%胎牛血 清的DMEM/fl2細胞培養液，含10%胎牛血清的MEM細胞培養液等。
而本發明測定方法中所說的孵育條件可同常規，通常在37°C、 5%C02 培養箱中進行；而步驟(3)中繼續孵育至實驗所需時間；步驟(4)中MTT染色檢測也同現有技術，具體來說，加入10% (體積百分比)MTT， 37'C培養箱 放置4h，加入適量酸性SDS (pH3-4)過夜，用酶標儀測定OD57Q值。當然， 在實際進行檢測時，同常規還設有對照組，即在步驟(l)加入同試驗組儲備液 等體積的PBS。
和已有的這些方法相比，本發明最重要的特點是在納米材料和細胞接觸 和作用之前，避免了與環境介質中的蛋白和其他分子的非共價結合，保證測 量獲得的毒性資料是原形碳納米材料和細胞直接相互作用的結果，而不是碳 納米材料與蛋白結合后，偶聯物與細胞作用的生物效應和毒性。另外，本發 明還在納米材料和細胞作用之后洗去未被細胞內化的碳納米材料，避免了染 料分子和納米材料發生相互作用而對實驗結果產生干擾。
圖l為本發明方法測得碳納米管MWNTs40、 MWNTs20 (分別以1， 2 標示)在PBS中和在細胞培養液中對Hela細胞毒性的試驗結果圖。
圖2為本發明方法測得納米碳黑NCBPG、 NCBS160禾QNCBP90 (分別 以l， 2， 3標示)在PBS中和在細胞培養液中對Hela細胞毒性的試驗結果 圖。
圖3為本發明方法測得C6Q (OH)x在PBS中和在細胞培養液中對K562 細胞毒性的試驗結果圖。
具體實施例方式
下面用實施例來進一步說明本發明，但本發明并不受其限制。 實施例1多壁碳納米管(MWNTs)儲備液的制備
本實施例中用到2種MWNTs:直徑40-100nm多壁碳納米管(MWNTs40)， 直徑20-40nm多壁碳納米管(MWNTs20)，均購買自深圳納米港有限公司， 純度95%,長度10-30微米。MWNTs用常規方法進行預處理以去掉催化劑金屬(Fe， Ni等)、無定形碳，增加其水溶性以及切短以利于細胞的吞噬， 具體包括用混酸(發煙硫酸濃硝酸體積比=1:1)純化后強超聲(300W、 20KHz) 5h使其變短并功能化，所得到的混合液離心(4000rpm)，棄去溶液 中少量的不溶碳管。以l: 10(v:v)的比例用蒸餾水稀釋后，懸浮液透析120h 以去掉雜質(用16KD的透析管)。掃描電鏡和原子力顯微鏡分析顯示碳納 米管的平均長度均為600nm。一定量的MWNTs加入到PBS(0.01M，pH=7.4) 中制成濃度為lmg/mL的儲備液備用，每次實驗前再超聲15min。 實施例2納米碳黑(NCB)儲備液的制備
將3種納米碳黑(NCB):NCBPG(直徑51nm，德固賽，中國)，NCBS160(直 徑20nm，德固賽，中國)，NCBP90(直徑14nm，德固賽，中國)分別加入到 PBS (O.OIM， pH=7.4)中制成濃度為lmg/mL的儲備液備用，每次實驗前 再超聲15min。
實施例3 C6。(OH》儲備液的制備
C60:純度>99%,河南大學。C6Q(OH)x參照文獻(LiTB,HuangKXand Li XH. Synthesis of C60 (OH)x(O)y and its hydrolyzation to C60(OH)n. Chem. Commun. 1999,4,30-32)方法合成，過程如下在lOOmL含<:6。飽和甲苯溶 液中，加入2ml 4M的NaOH，用1.5ml 10%的四丁基氫氧化銨作為相轉移催 化劑，隨后加入10111130%的11202反應，直至甲苯溶液由紫色變為無色，同 時水溶液由無色變為棕黃色，進行相分離，得到棕黃色C6Q (OH、溶液，用 甲醇使C6o(OH)x沉淀，加水使沉淀溶解，再加入甲醇沉淀，離心去掉甲醇， 反復幾次，直至甲醇溶液的pH《8，干燥得到C6o(OH)x。 C6o(OH、用水溶解 后，加熱回流24小時，用甲醇沉淀產物，烘干后得到C6o(OH)"x-22-24)。 一定量的C6o(OH)x加入到PBS (O.OIM， pH7.3)中制成濃度為lmg/mL的 儲備液備用，每次實驗前再超聲15min。
實施例4 MWNTs對Hda細胞毒性實驗
1、取常規細胞培養液(含10v/v。/。胎牛血清的1640培養液)中的Hela細胞，按2xl()S個/mL的細胞密度接種2mL于6孔板中，貼壁過夜。
2、 小心地吸掉常規細胞培養液，每孔加入1.8mLPBS(0.01M， pH=7.4)， 再加入實施例1的MWNTs儲備液，使MWNTs終濃度為100|xg/mL;對照 組加入2mLPBS， 37°C、 5%0)2培養箱孵育2 h。
3、 用PBS洗三次以去除未被細胞內化的碳納米材料。
4、 加入2mL常規細胞培養液，37。C培養箱孵育24h。
5、 每孔加入10Q/。MTT，37t:培養箱放置4h，加入適量酸性SDS(pH3-4)
過夜，用酶標儀測定OD57o值。結果如圖l所示。
為了與上述實驗組作出比較，將上述常規細胞培養液(1640含10%胎 牛血清)替換PBS制備MWNTs儲備液重復上述實驗。結果如圖1所示，比 較這兩組結果發現，MWNTs在細胞培養液中對Hela細胞的毒性低于在PBS 中的毒性。
實施例5納米碳黑(NCB)對Hela細胞毒性實驗
將實施例2的NCB儲備液替換實施例4中的MWNTs儲備液，余測定 方法同實施例4，結果如圖2所示，比較兩組結果發現，NCB在細胞培養液 中對Hela細胞的毒性顯著低于在PBS中的毒性。
實施例6富勒烯衍生物——富勒醇C6o(OH)x對K562細胞毒性實驗 取常規細胞培養液(含10%胎牛血清的1640培養液)中的K562細胞(懸 浮細胞)，按5xl(^個/mL的細胞密度接種2mL于6孔板中，培養過夜。離 心去掉常規細胞培養液，加入實施例3配好的C6C (OH)x (^22-24)儲備液孵 育3h，離心，用PBS重懸三次以洗去未被細胞內化的C6o(OH)x，加入常規 細胞培養液后，37'C培養箱分別孵育24h和48h檢測細胞存活率，具體實 驗細節同實施例4，結果如圖3所示。為了與該實驗組作出比較，我們也用 常規細胞培養液制備的Qo(OHX儲備液重復了上述實驗，結果如圖3所示， 比較這兩組結果，同樣發現C6o(OHX在細胞培養液中對K562細胞的毒性低 于在PBS中的毒性。由以上實施例的結果發現，由于碳納米材料被培養液中的蛋白包裹，形 成蛋白納米管，因此所測得的毒性大大降低，可見碳納米材料與環境介質中 的蛋白和其他分子的非共價結合對其細胞毒性測定結果影響很大，不能反映 原形碳納米材料的細胞毒性。因此，本發明所采用的方法能保證測量獲得的 毒性資料是原形碳納米材料和細胞直接相互作用的結果，而不是碳納米材料 與蛋白結合后，偶聯物與細胞作用的生物效應和毒性；從而更接近于實際結 果。
其他碳納米材料對貼壁細胞和懸浮細胞毒性也可以采用上述方法進行 測定，在此不再贅述。
權利要求
1、一種碳納米材料儲備液，其選用磷酸鹽緩沖液作為介質溶液。
2、 如權利要求1所述的碳納米材料儲備液，其特征在于所述的碳納米材料選自單壁碳納米管，多壁碳納米管，納米碳黑，C60富勒烯及其衍生物。
3、 如權利要求2所述的碳納米材料儲備液，其特征在于所述的C6o富勒 烯衍生物為富勒醇C6o(OH)x，其中x=22-24。
4、 如權利要求1所述的碳納米材料儲備液，其特征在于所述的磷酸鹽 緩沖液的濃度為O.OIM， pH值為7.2-7.4。
5、 一種碳納米材料細胞毒性的測定方法，其包括以下步驟(1) 將接種于細胞培養板中進行培養的細胞的常規細胞培養液去除，加入 如權利要求l-4任一項所述的碳納米材料儲備液，孵育2-3小時；(2) 孵育后，除去未被細胞內化的碳納米材料；(3) 加入常規細胞培養液，繼續孵育；(4) 孵育結束后，MTT染色檢測細胞存活率。
6、 如權利要求5所述的測定方法，其特征在于步驟(2)采用磷酸鹽緩沖 液洗除未被細胞內化的碳納米材料。
7、 如權利要求5所述的測定方法，其特征在于所述的細胞為貼壁細胞 和/或懸浮細胞。
全文摘要
本發明公開了一種碳納米材料儲備液，其選用磷酸鹽緩沖液(PBS)作為介質溶液。本發明還公開了碳納米材料細胞毒性的測定方法，其采用上述碳納米材料儲備液，使碳納米材料在與細胞接觸前不與常規細胞培養液接觸，并在和細胞作用之后洗去未被細胞內化的碳納米材料。本發明碳納米材料儲備液不含蛋白，而測定方法避免了與環境介質中的蛋白和其他分子的非共價結合，從而保證測量獲得的毒性結果是原形碳納米材料和細胞直接相互作用的結果，具有更高的準確性。
文檔編號C12Q1/02GK101290286SQ20071003953
公開日2008年10月22日 申請日期2007年4月17日 優先權日2007年4月17日
發明者劉瑞麗, 李文新, 穎 諸 申請人:中國科學院上海應用物理研究所