microRNA-219在制備抗癲癇藥物中的應用的制作方法
【專利摘要】microRNA-219在制備抗癲癇藥物中的應用，涉及microRNA-219。microRNA-219可在制備抗癲癇藥物中應用。所述抗癲癇藥物為預防或治療癲癇和以癇性發作為特征的神經系統疾病的藥物。所述藥物由有效量包含序列表所示序列的核酸和藥學上可接受的載體或輔料組成。所述藥物可按照藥物制備的常用方法制成注射制劑、口服制劑、噴霧制劑、軟膏制劑或貼劑等。提供microRNA-219及其激動劑在預防、治療癲癇和以癇性發作為特征的神經系統疾病中的用途，用以治療和預防癲癇及以癇性發作為特征的神經系統疾病的發生。
【專利說明】microRNA-219在制備抗癲癇藥物中的應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及microRNA-219,尤其是涉及microRNA_219在制備抗癲癇藥物中的應用。
【背景技術】
[0002]癲癇是一種以大腦神經元異常同步化放電為特征的慢性反復性嚴重神經系統疾病，全球約5千萬患者深受其擾。抗癲癇藥物僅控制約三分之二患者的癲癇發作，且不能從根本上改善其病理生理狀態。癲癇的發生涉及到離子通道改變，突觸重塑，炎癥，神經膠質增生和神經元死亡等。然而，迄今為止，針對這些過程的干預措施在臨床上很少表現出足夠的療效，我們對癲癇發生的細胞和分子機制仍缺乏完整了解。
[0003]microRNA是一類長度為19~23個核苷酸的內源性非編碼RNA，其被RNA誘導沉默復合體(RISC,由Dicer, Argonaute及其他蛋白質組成)載入后可以與祀mRNA的3’非翻譯區(UTR)配對，引起靶mRNA的降解或抑制其翻譯效率，進而調控基因表達(Vasudevan S，Tong Y，Steitz J A.Switching from repression to activation:miRNAscan up-regulate translation.Science, 2007;(5858):1931-1934 ；Lewis B P，Burge CB，Bartel D P.Conserved seed pairing, often flanked by adenosines, indicates thatthousands of human genes are miRNA targets Cell2005 (I): 15-20)。miRNA 以復雜網絡調控的方式參與生物體生理過程，對在生理條件下神經系統中miRNA分布、表達和功能的研究表明，miRNA通過調節多種基因的表達，廣泛參與對神經元發育、細胞成熟與迀移、髓鞘形成、突觸發育成熟和可塑性、膠質疤痕形成、神經性疼痛、神經修復和再支配等多種生理病理過程，miRNA生成異常或其功能通路發生障礙在神經退行性疾病、精神病和腦腫瘤等的發生發展中發揮關鍵作用(Hebert S S，De Strooper B.Alterations of the miRNAnetwork cause neurodegenerative disease.Trends Neurosci，2009; (4):199-206 ；Saugstad JA.MiRNAs as effec`tors of brain function with roles in ischemiaand injury,neuroprotection, and neurodegeneration.J Cereb Blood FlowMetab.2010;30 (9):1564-1576)。
[0004]MiRNA-219為人和嚙齒類動物腦組織所特有的miRNA之一(DostieJ，Mourelatos Z,Yang M，Sharma A,Dreyfuss G.Numerous microRNPs in neuronalcell containing novel miRNAs.RNA.2003; 9 (2): 180-6)，與腦組織的發育和高級神經功能密切相關(Okabe M, Imai T, Kurusu M, Hiromi Y，Okano H，Translationalrepression determines a neuronal potential in Drosophila asymmetric celldivison.Nature.2001;411 (6833):94-98 ；Miller S，Yasuda M，Coats JKj JonesY，Martone ME, Mayford M.Disruption of dendritic translation of CaMK II alphaimpairs stabilization of synaptic plasticity and memory consolidation.Neuron.2002; 36 (3): 507-19)。對其生理功能的深入研究逐步顯示出miRNA_219與癲癇發生的潛在相關性。如最近Jannet Kocerha等發現N-甲基-D-天冬氨酸受體功能減退與miRNA-219表達下調相關，miRNA-219通過調節NMDAR信號下游效應蛋白CaMKII y 而參與 NMDAR 功能異常所致行為失常(Kocerha J, Faghihi MA, Lopez-ToledanoMA, Huang J, Ramsey AJ, Caron MG,Sales N, Willoughby D, Elmen J, Hansen HF, OrumH, Kauppinen S, Kenny PJ, Wahlestedt C.MiRNA-219modulates NMDA receptor-mediatedneurobehavioral dysfunction.Proc Natl Acad Sci USA.2009; 106 (9): 3507-12);此外，研究發現，miRNA-219在海馬神經元的胞體、樹突區域高表達，在軸突區也有表達(OkadoH,Ohtaka-Maruyama C，Sugitani Y，Fukuda Y，Ishida R, Hirai S，Miwa A, TakahashiA,Aoki K, Mawano H，Kasai M.The transcriptional repressor RP58is crucial forcell-division patterning and neuronal survival in the developing cortex.Dev Biol.2009;331 (2):140-51),表明其在突觸可塑性中發揮重要作用。以上研究提示，miRNA-219與癲癇的發生密切相關，其可能參與調控癲癇的發病過程。
【發明內容】
[0005]本發明的目的在于提供microRNA-219在制備抗癲癇藥物中的應用。
[0006]microRNA-219可在制備抗癲癇藥物中應用。
[0007]所述抗癲癇藥物為預防或治療癲癇和以癇性發作為特征的神經系統疾病的藥物，所述藥物由有效量包含序列表所示序列的核酸和藥學上可接受的載體或輔料組成。
[0008]所述藥物可按照藥物制備的常用方法制成注射制劑、口服制劑、噴霧制劑、軟膏制劑或貼劑等。
[0009]本領域技術人員可對本發明所述的microRNA-219的核苷酸序列進行適當修飾，所述的修飾包括任意核苷酸的核糖修飾、堿基修飾和磷酸骨架修飾中的一種或幾種的組合或任意核苷酸的增減、替換，只要修飾后的核苷酸序列仍具有與microRNA-219相同的活性就應當屬于本發明所要保護的范·圍之內。
[0010]本發明公開了 micix)RNA-219及其激動劑在預防、治療癲癇和以癇性發作為特征的神經系統疾病中的用途。通過大量的實驗證實，在誘發癲癇發作的小鼠模型中，小鼠大腦海馬組織中microRNA-219水平顯著降低。給予小鼠側腦室注射microRNA-219的拮抗劑(antagomir)能引起小鼠癲癇發作癥狀。而給予癲癇模型小鼠側腦室注射microRNA-219的激動劑(agomir)則能顯著改善其癲癇發作癥狀，意味著microRNA-219在癲癇的發病機制中起著關鍵性作用，其為拮抗癲癇及其相關疾病發病的重要保護性小分子核酸。本發明旨在公開基于microRNA-219及其激動劑/類似物/修飾物的生物制劑的用途，用以治療和預防癲癇及以癇性發作為特征的神經系統疾病的發生。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0011]圖1為小鼠側腦室注射1.5ug KA后小鼠腦電圖波形。
[0012]圖2為KA誘導癲癇模型小鼠海馬內microRNA-219表達變化情況。
[0013]圖3為癲癇患者腦脊液中miCix)RNA-219表達情況。
[0014]圖4為小鼠側腦室注射0.2nmol antagomir-219后小鼠腦電圖波形。
[0015]圖5為小鼠側腦室注射0.2nmol陰性對照劑antagomir-NC后小鼠腦電圖波形。
[0016]圖6為小鼠側腦室注射0.2nmol antagomir-219后小鼠海馬內microRNA-219表達變化情況。
[0017]圖7為癲癇模型小鼠側腦室注射0.2nmol agomir-219后小鼠腦電圖波形。
[0018]圖8為癲癇模型小鼠側腦室注射0.2nmol陰性對照劑agomir_NC后小鼠腦電圖波形。
[0019]圖9為小鼠側腦室注射0.2nmol agomir-219后小鼠腦電圖波形。
[0020]圖10為癲癇模型小鼠側腦室注射0.2nmol agomir-219后小鼠海馬內microRNA-219表達變化情況。
[0021]圖11為癲癇細胞模型(原代培養小鼠海馬神經元)中加入0.8nmol agomir-219(終濃度為400nM)后microRNA-219表達變化情況。
[0022]圖12為癲癇細胞模型(原代培養小鼠海馬神經元)中加入0.8nmol antagomir-219(終濃度為400nM)后microRNA-219表達變化情況。
【具體實施方式】
[0023]下面結合具體實施例來進一步描述本發明，所有實施例僅用于例證本發明，決不限制本發明的保護范圍。本領域技術人員應該理解的是，在不偏離本發明的精神和范圍下可以對本發明技術方案的細節和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發明的保護范圍內。
[0024]用成年雄性ICR小鼠(30_35g)，側腦室注射經典致癇劑海人酸(Kainic acid,KA)
1.5ug誘發小鼠癲癇發作，建立小鼠癲癇動物模型。注射海人酸后小鼠表現出雙眼凝視、須動增加、呼吸急促、反復洗臉動作，伴有頭面部抽搐，逐漸發展為伴有站立并摔倒的全身強直陣攣性發作的癲癇癥狀，發作等級達到Racine分級IV~V級，小鼠腦電圖顯示為多量高幅棘波的癲癇發作波形，各導聯見`每s5~6次，30~80ii V的癇樣放電持續發放(參見圖1 )。24h后，斷頭取腦，取出雙側海馬，提取RNA，熒光定量PCR實驗顯示，KA組小鼠較正常對照組小鼠，海馬內microRNA-219水平顯著降低(降低70%)(參見圖2)。收集臨床癲癇患者的腦脊液標本，檢測顯示癲癇患者腦脊液中microRNA-219水平較非癲癇患者顯著降低(參見圖3)。這意味著microRNA-219的表達變化與癲癇的發生發展密切相關。
[0025]進一步給予成年雄性I CR小鼠側腦室注射mi croRNA-219的特異性拮抗劑(antagomir-219),小鼠表現出癲癇發作癥狀,發作等級達到Racine分級IV級,腦電圖顯示為異常棘波波形，各導聯見每si次，10~60 ii V的癇樣放電持續發放(參見圖4)。癲癇靜止期，部分小鼠易激怒、暴躁，有攻擊行為。熒光定量PCR實驗顯示，注射microRNA-219拮抗劑后，小鼠海馬內microRNA-219水平顯著降低(參見圖6),意味著拮抗microRNA-219可誘發小鼠癲癇發作，microRNA-219在癲癇發病機制中發揮著重要作用。
[0026]同時，ICR小鼠KA誘發癲癇發作6h后，給予其側腦室注射microRNA-219的激動劑 (agomir-219)，小鼠癲癇癥狀明顯好轉，發作潛伏期延長，發作持續時間大大縮短，只出現凝視，頭面部抽搐，雙前肢抬起陣攣等輕度發作。而后未見小鼠多次發作。小鼠腦電圖顯示皮層癇樣放電明顯受到抑制，基本波動為4~6HZ的0節律，間隔5~7s出現一次低幅癇樣放電(參見圖7)。熒光定量PCR實驗顯示，小鼠海馬內microRNA-219水平恢復到正常水平，意味著microRNA-219為拮抗癲癇及其相關疾病發病的重要保護性小分子核酸(參見圖 10)。[0027]通過大量的實驗證實，小鼠癲癇模型大腦海馬組織中micix)RNA-219水平顯著降低。給予小鼠側腦室注射microRNA-219的拮抗劑(antagomir)能誘發小鼠癇性發作。而給予癲癇模型小鼠側腦室注射microRNA-219的激動劑(agomir)則能顯著改善其癲癇發作癥狀，提示microRNA-219在癲癇的發病機制中起著關鍵性作用，其為拮抗癲癇及其相關疾病發病的重要保護性小分子核酸。這一結果在癲癇細胞模型中進一步得到了證實(參加圖11和12)。同時，收集了臨床癲癇患者的腦脊液，檢測其中micix)RNA-219水平，證實其與癲癇發病具有相關性(參見圖3)。
[0028]本發明是在大量動物和細胞實驗的基礎上，結合臨床癲癇患者的腦脊液檢查結果，旨在開發基于micix)RNA-219的用以治療和預防癲癇及以癇性發作為特征的神經系統疾病的生物制劑。具體如下:
[0029]microRNA219生物制劑:制備的藥物可以只含microRNA219的核苷酸序列或其類似物/激動劑/修飾物，也可制成一種藥物組合物，其特征在于包含有效劑量的microRNA219的核苷酸序列或其類似物及藥學上可接受的載體；其中，所述的載體可為納米顆粒，脂質體，膽固醇，殼聚糖，病毒等。合成microRNA219的核苷酸序列或其類似物/激動劑，并與上述載體連接形成藥物，可制成注射制劑或口服制劑，通過靜脈或肌肉注射或口服的方式，用于治療癲癇或以癇性發作為特征的神經系統疾病。
[0030]實施例1.小鼠腦電圖記錄
[0031]采用Nicolet尼高力數字化腦電圖儀進行描記，以頭皮電極描記小鼠腦電圖，采用4導聯，在小鼠左右額(F3、F4)，左右頂(P3、P4)相對的頭皮上各放置一根針電極，參考電極置左耳并接地。靈敏度:10yV/mm，紙速:30mm/sec,高頻濾波:70HZ,低頻濾波:1.6Hz。
[0032]實施例2.癲癇模型小鼠海馬中microRNA-219表達水平的檢測
[0033]1、本實驗采用6~8周·齡雄性ICR小鼠，具體分為2組:癲癇模型小鼠組及對照組。癲癇模型小鼠組小鼠放置固定在小鼠腦立體定位儀上，給予側腦室微量注射海人酸(KA)1.5ug (lug/yL)，誘發小鼠癲癇發作，制造小鼠癲癇模型。對照組小鼠給予同側側腦室微量注射生理鹽水1.5iiL。
[0034]2、24h后，常規提取小鼠雙側海馬RNA:
[0035]每IOOmg組織中加入ImL TRIZOL試劑，電動勻漿器勻漿。室溫下放置5min后，加A 0.2mL氯仿,混勻后室溫下放置5min,4°C 12, OOOr離心15min。將上層水相液轉移至新EP管中，加入等體積(0.5mL)異丙醇，混勻后室溫下放置IOmin, 4。。12, OOOr離心IOmin0棄上清，加入lmL75%乙醇,混勻后4°C 9，OOOr離心5min。棄上清，空氣干燥沉淀IOmin,加A 20 u L DEPC處理水，于55~60°C水浴IOmin溶解RNA。獲得的RNA溶液保存于_80°C。
[0036]3、紫外吸收法測定RNA濃度及純度:
[0037]按照酶標儀使用說明進行操作，測量前先用溶解RNA用的DEPC水調零。根據260nm處讀值獲得RNA濃度，以A260/A280的比值判定RNA純度。
[0038]4、變性瓊脂糖凝膠電泳:
[0039]Ig瓊脂糖溶于72mL水中，冷卻至60°C，加入IOmL的10XMOPS電泳緩沖液和18mL的37%甲醛溶液。取3ugRNA，加3倍體積的甲醛上樣染液，加EB于甲醛上樣染液中至終濃度為10ug/mL。加熱至70°C孵育5min使樣品變性。上樣于膠孔中，5~6V/cm電壓下電泳至溴酚藍指示劑進膠至少2~3cm，紫外透射光下觀察并拍照。[0040]5、采用 TaKaRa 公司 PrimeScript miRNA qPCR 檢測試劑盒對 hasiiR-219 的表達進行檢測:[0041]miRNAs 逆轉錄:
[0042]逆轉錄反應體系(20 ii L):
[0043]
2 xmi RN A Reaction Buffer Mix(for Real Time)I OjaL
0.1%BSA2j.1L
MiRNA PrimcScript RT Enzyme Mix2[iL
Total RNA(10pg/j_iL~lug/‘uL)I(.1L
RNasc Free dH20Up 1 20j.1L
[0044]以上體系混勻后，瞬時離心，37°C孵育60min后，85°C孵育5sec (酶的失活反應)。停止后4°C備用，產物保存于-20°C。
[0045]MiRNAs real-time PCR: (PCR 試劑來源于 TaKaRa 公司，miR-219, U6 等引物由廣州銳博生物有限公司合成)
[0046]反應體系(20iiL):
[0047]
SYBY Premix Ex Taq II (2 x)IOpL
PCR Forward Primcr(10|.1M)0.8|.1L
PCR Reverse Primer( IOjiM)0.8(.1L
ROX Rcfcrcncc Dyc II (50x)0.4(..1L
模板(cDAN溶液)2(_iL
dH206(.1L
[0048]反應程序:
[0049]95°C 30sec— (95°C 3sec—65°C 30sec) X40cycles—Melting Curve
[0050]結果顯示:小鼠癲癇造模成功(圖1)。癲癇模型小鼠海馬中microRNA-219含量較對照正常組小鼠有明顯下降，說明在癲癇小鼠海馬中，micix)RNA-219表達水平下降(圖2)。
[0051]實施例3.癲癇患者腦脊液microRNA-219的表達情況
[0052]1、收集5例癲癇患者及5例正常對照者腦脊液樣本(取自2013年廈門大學附屬中山醫院神經內科住院患者，每個病例均由兩個或以上臨床醫師確診分類)。按照實施例2所述方法提取RNA，并檢測microRNA-219的表達。
[0053]2、結果顯示:癲癇患者腦脊液中microRNA-219表達水平明顯降低(圖3)。提示microRNA-219的表達變化與癲癇的發生發展密切相關。
[0054]實施例4.microRNA-219的特異性拮抗劑(antagomir-219)能誘發小鼠癲癇發作
[0055]1、本實驗采用6~8周齡雄性ICR小鼠，具體分為2組:antagomir_219處理干預小鼠組及陰性對照組。antagomir-219處理干預組小鼠放置固定在小鼠腦立體定位儀上，給予側腦室微量注射microRNA-219的拮抗劑(antagomir-219) 0.2nmol(0.2nmol/2.5 u L)。對照組小鼠給予同側側腦室微量注射antagomir-219的陰性對照劑antagomir-NC0.2nmol。
[0056]2、觀察小鼠的行為表現:antagomir-219處理干預組小鼠表現為明顯的癲癇發作癥狀，Racine分級達到IV級。小鼠腦電圖顯示，干預組小鼠呈現出異常棘波波形，各導聯見每Si次，10~60 y V的癇樣放電持續發放(圖4)。對照組小鼠表現為正常行為，腦電圖亦無異常癇性波形(圖5)。
[0057]3、24h后，常規提取兩組小鼠海馬RNA，如實施例2的步驟分別檢測兩組小鼠海馬內的microRNA-219表達水平。結果顯示antagomir-219處理干預組小鼠海馬內microRNA-219表達水平較對照組明顯降低(圖6)。
[0058]這些結果表明拮抗小鼠海馬內的antagomir-219表達水平可誘發小鼠癲癇發作，說明micix)RNA-219在癲癇的發病機制中起著關鍵作用。
[0059]實施例5.microRNA-219及其激動劑(agomir-219)在小鼠癲癇中的治療作用
[0060]1、本實驗采用6-8周齡雄性ICR小鼠，具體分為4組:正常對照組(側腦室注射生理鹽水)，癲癇模型小鼠agomir-219處理干預組(KA誘發小鼠癲癇6h后側腦室注射agomir-2190.2nmol),癲癇模型小鼠agomir-219陰性對照劑(agomir-NC)處理干預組(KA誘發小鼠癲癇6h后側腦室注射agomir-NC0.2nmol) , agomir-219處理干預組(側腦室注射agomir-2190.2nmol)。
[0061]2、觀察小鼠的行為表現:癲癇模型小鼠agomir-219處理干預組小鼠的癲癇癥狀有明顯改善，其后未見多次癇性發作。做小鼠腦電圖顯示，癲癇小鼠注射agomir-219后小鼠皮層癇樣放電明顯受到抑制，基本波動為4~6HZ的0節律，間隔5~7s出現一次低幅癇樣放電(參見附圖7)。癲癇模型小鼠agomir-219陰性對照劑(agomir-NC)處理干預組小鼠癲癇癥狀無明顯改善，小鼠·Racine分級達到IV級，腦電圖顯示有異常棘波波形，各導聯可見每s3~4次，30-60 ii V棘波持續發放(圖8)。而agomir-219處理干預組小鼠表現正常，腦電圖亦無異常波。說明agomir-219不影響小鼠的正常生理功能，對小鼠無損害(圖9)。
[0062]3、24h后，常規提取四組小鼠海馬RNA，如實施例2的步驟分別檢測各組小鼠海馬內的microRNA-219表達水平。結果顯示癲癇模型小鼠agomir-219處理干預組小鼠海馬內microRNA-219表達水平恢復到正常水平(圖10)。
[0063]這些結果表明microRNA-219為拮抗癲癇及其相關疾病發病的重要保護性小分子核酸，可成為預防和治療癲癇和以癇性發作為特征的神經系統疾病的藥物。
[0064]實施例6.癲癇細胞模型中加入microRNA-219的激動劑/拮抗劑后microRNA-219的表達變化情況
[0065]1、本實驗采用懷孕18天小鼠的胚胎，取出其中海馬神經元細胞原代培養7天后，分為如下組:正常對照組(加入生理鹽水)；癲癇細胞模型組(加入KA，終濃度為50iiM);癲癇細胞模型agomir-219處理干預組(加入KA6h候，加入agomir-2190.8nmol使終濃度為400nM);癲癇細胞模型agomir-219陰性對照劑(agomir-NC)處理干預組(處理方法同agomir-219處理組)；Agomir_219處理干預組(神經元中加入0.8nmol agomir-219使終濃度為400nM);Antagomir-219處理干預組(神經元中加入0.8nmol Antagomir-219使終濃度為400nM) ；Antagomir-NC處理干預組(處理方法同antagomir-219處理組)。[0066]2、24h候后，常規提取各組細胞的RNA，如實施例2的步驟分別檢測各組細胞的microRNA-219表達水平。結果如圖`11和12所示。
【權利要求】
1.microRNA-219在制備抗癲癇藥物中的應用。
2.如權利要求1所述應用，其特征在于所述抗癲癇藥物為預防或治療癲癇和以癇性發作為特征的神經系統疾病的藥物，所述藥物由有效量包含序列表所示序列的核酸和藥學上可接受的載體或輔料組成。
3.如權利要求2所述應用，其特征在于所述藥物按照藥物制備的常用方法制成注射制劑、口服制劑、噴霧制劑、軟膏制劑或貼劑。
【文檔編號】A61K31/7088GK103656685SQ201410011211
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2014年1月10日 優先權日:2014年1月10日
【發明者】鄭紅花, 鄭維紅, 唐榮, 計志林, 張云武 申請人:廈門大學