單核銅配合物及其制備方法和應用的制作方法

單核銅配合物及其制備方法和應用的制作方法
【專利摘要】本發明涉及一種單核銅配合物及其制備方法和應用。它們的化學式分別是[CuLCl](ClO4)(1)和[CuL(acac)](PF6)(2)。其中L為N,N-(2-吡啶基)-1-(1-萘基)乙胺，acac是乙酰丙酮，PF6為六氟磷酸根。配合物(1)晶體為正交晶系，空間點群為Pbca，晶胞參數為：配合物(2)晶體為單斜晶系，空間點群為P2(1)／c，晶胞參數為：通過多種光譜方法表征本發明對CT-DNA具有較強的鍵合作用；瓊脂凝膠電泳實驗證實化合物以氧化切割機理對pBR322DNA有明顯的切割效果；MTT實驗證實化合物對多種細胞具有良好的抗癌活性，可作為潛在的抗癌藥物。
【專利說明】單核銅配合物及其制備方法和應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種單核銅配合物及其制備方法和應用，具體是其在化學核酸酶領域和抗癌藥物領域的應用。
【背景技術】[0002]癌癥是一大類惡性腫瘤的統稱，是當前危及人類生命的最主要疾病之一。在中國，每年非正常死亡人數在800萬左右，其中因癌癥死亡人數約為160萬。隨著生物學與醫學的發展，人們對癌癥的治療方法有了長足進步，其中化學療法是一項極為重要的方法，已經取得了非凡的成就。上世紀60年代末，順鉬以其優異抗腫瘤作用，帶動了科學界對金屬配合物的藥理機能的進一步深入研究。隨之眾多新的高效、低毒、具有抗癌性能的金屬配合物被不斷合成出來，并逐步投入臨床應用。
[0003]從化學角度來說，致癌就是細胞核DNA的癌化。因此，在化學和生物領域，DNA的定點斷裂與重組是抗癌藥物研究的核心。地球生命在長遠歲月的進化中，于體內創造與保留了眾多天然核酸酶，其活性中心一般需要特定金屬離子的參與。但是將天然核酸酶制備成抗癌藥物，卻面臨諸多問題，原因在于天然核酸酶的品種、數量和功能等遠遠無法滿足市場的需要。為克服這些缺點，人們模擬天然核酸酶的化學組成、空間結構，設計合成一系列的化學核酸酶，并測定它們與DNA之間的相互作用，選擇優良的模擬物作為抗癌藥物，投入臨床實驗中。在生物化學領域，化學核酸酶的合成與應用作為最前沿的方向，已經成為研究熱點之一。
[0004]目前投入應用的金屬配合物抗癌藥物有順鉬、卡鉬、奧沙利鉬等，它們以優異的抗癌性能成為抗癌藥物的主力軍。釕的配合物毒性低，同時易被腫瘤組織吸收，也被視為最具有前景的抗癌藥物之一。銅是人體所需的重要必需元素，文獻報道一些銅配合物同樣具有較強的抗癌活性，這一方向也成為了化學核酸酶發展的一個重要課題。本發明依照于此，設計合成了兩個銅的配合物，并對其進行表征，測定相應的生物活性，以期獲得優良的致癌藥物。

【發明內容】

[0005]本發明的目的在于提供一種單核銅配合物及其制備方法和應用。使用常規的溶液合成法，可得到單核銅配合物。該配合物與DNA具有良好的鍵合和切割作用，并且對多種細胞具有較好的抗癌活性。本發明的制備方法簡單，可靠。
[0006]本發明提供的單核銅配合物的化學式分別為[CuLCl] (C104) (I)和[CuL(acac)](PF6)⑵。其中L為N，N-(2-吡啶基)-1-(1-萘基)乙胺，acac是乙酰丙酮，PF6為六氟磷酸根。
[0007]本發明提供的單核銅配合物晶體，配合物(I)屬于正交晶系，空間點群為Pbca，晶胞參數為:a=13.966(4)A, b=13.887(4) A, C= 23.249(6)A;配合物⑵為單斜晶系，空間點群為 P2(l) / c，晶胞參數為:a= 16.570(3) A, b = 12.324(3) A, c = 14.080(3) A,β =101.64(3) °。
[0008]本發明提供的單核銅配合物的結構描述如下:配合物(I)的非對稱基本單元由[CuLCl]+陽離子和外界的一個高氯酸根陰離子組成，每個配體與一個銅離子配位，采取四配位的平面正方形配位構型，每一個銅離子與配體的兩個吡啶氮原子和一個乙胺氮原子配位，另外還與一個外界的氯離子配位。配合物(2)非對稱基本單元由[CuL(acac)]+陽離子和外界的一個六氟磷酸根陰離子組成；每個配體與一個銅離子配位，采取五配位的四方錐配位構型；每一個銅離子與配體的兩個吡啶氮原子和一個乙胺氮原子配位，另外還與外界的乙酰丙酮上兩個氧原子配位。
[0009]本發明提供的單核銅配合物的制備方法包括如下步驟:
[0010]配合物(I):將三氯乙酸銅的水溶液和配體的乙醇溶液混合，加入氫氧化鋰調節體系酸度(PH=7);常溫攪拌反應4小時，反應液過濾；濾液靜置5-7天后析出針狀晶體即為產物。
[0011]配合物(2):將Cu (acac) 2 / CH2Cl2的水溶液和配體的乙醇溶液混合，加入氫氧化鋰調節體系酸度(pH = 7)，室溫攪拌2.5小時；再加入六氟磷酸鉀，常溫攪拌反應2小時，反應液過濾；濾液靜置5-7天后析出針狀晶體即為產物。
[0012]所述的銅鹽與主配體N，N-(2_吡啶基)-1-(1-萘基)乙胺的摩爾比為1:1。
[0013]所述的氫氧化鋰與配體的摩爾比為2: 1。
[0014]經電子吸收光譜實驗和熒光淬滅實驗證實所述單核銅配合物與CT-DNA之間有中等鍵合的插入作用。
[0015]經瓊脂糖電泳實驗證明，在添加H2O2的情況下，所述單核銅配合物對PBR322DNA有明顯的切割效果，并為氧化切割機理。
[0016]經MTT實驗表明所述單核銅配合物對多種細胞具有較好的抗癌活性，可作為潛在的抗癌藥物。
[0017]總之，本發明提供的單核銅配合物對DNA有良好的鍵合和切割效果，并且對多種細胞具有較好的抗癌活性。本發明制備方法簡單，可靠。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0018]圖1a為銅配合物(1)的陽離子結構圖。
[0019]圖1b為銅配合物(2)的陽離子結構圖。
[0020]圖2a為加入不同量的CT-DNA后，銅配合物(I)的電子吸收光譜變化示意圖。
[0021]圖2b為加入不同量的CT-DNA后，銅配合物(2)的電子吸收光譜變化示意圖。
[0022]圖3a為銅配合物(I)與EB競爭的熒光淬滅實驗結果圖。
[0023]圖3b為銅配合物(2)與EB競爭的熒光淬滅實驗結果圖。
[0024]圖4a為添加H2O2后，銅配合物⑴對pBR322DNA的濃度依賴切割實驗結果圖。
[0025]圖4b為添加H2O2后，銅配合物(2)對pBR322DNA的濃度依賴切割實驗結果圖。
[0026]圖5a為添加H2O2后，銅配合物⑴對pBR322DNA的切割機理實驗結果圖。
[0027]圖5b為添加H2O2后，銅配合物⑵對pBR322DNA的切割機理實驗結果圖。
【具體實施方式】[0028]本發明參照具體實施例詳細說明如下，但僅作說明而不是限制本發明。實施例中使用的試劑在沒有特別注明的情況下均為市售。
[0029]實施例1
[0030]配體L.2HC104的合成:
[0031]稱取0.99g(5mmol)的二節胺置于50mL圓底燒瓶中。稱取0.883g (5mmol)的1-氯甲基萘，溶于20mL丙酮中，在攪拌狀態下逐滴加入到二芐胺中。稱取0.967g(7mmol)的K2CO3顆粒，加入到圓底燒瓶中，配成懸濁液。反應體系加熱回流25h，旋蒸得到后的物質用H2O溶解，然后用氯仿進行萃取。得到的萃取液用MgS04干燥，旋蒸，得到配體產物2.2723g。將油狀液體用25mL乙醇溶解，再緩慢滴加高氯酸，產生黃棕色沉淀，過濾，用無水乙醇重結晶，得到配體L*2HC104的淺黃色粉末0.49g，產率27.0%。元素分析(％)，理論值:(C23H21N3.2HC104):C,51.11 ;Η，3.89 ;Ν，7.78。實驗值:C,51.03 ;Η，3.97 ;Ν，6.99。
[0032]實施例2
[0033]單核銅配合物(I)的合成:
[0034]稱取配體(2mmol)溶于5mL乙醇中，稱取三氯乙酸銅(2mmol),用5mL蒸懼水溶解，加入到反應體系中，再加入氫氧化鋰水溶液5mL(5mmol),調節體系酸度pH=7。室溫下攪拌4個小時，反應液過濾。濾液靜置6天后析出晶體即為產物，收集晶體。通過X射線單晶衍射儀分析(圖1a)和元素分析，證明該晶體為[CuLCl] (C104) (1)。測定相應元素的百分比含量為(% ):C，51.43 ;Η，3.90 ;Ν，7.86。結果與理論值基本一致。
[0035]實施例3
[0036]單核銅配合物⑵的合成:
[0037]稱取實施例1制備的配體(2mmol)溶于5mL乙醇中，稱取Cu (acac) 2 /CH2Cl2 (2mmol)，用5mL蒸餾水溶解，加入到反應體系中，再加入氫氧化鋰水溶液5mL(5mmol)，調節體系酸度pH=7。常溫攪拌2.5h后，加入KPF6(4mmol)，再攪拌2h，反應液過濾。濾液靜置7天后析出晶體即為產物，收集晶體。通過X射線單晶衍射儀分析(圖1b)和元素分析，證明該晶體為[CuL(acac)] (PF6) (2)。測定相應元素的百分比含量為(％ ):C,52.03 ；.Η，4.37 ;Ν，6.51。結果與理論值基本一致。
[0038]單核銅配合物的結構參數見表1、2。
[0039]實施例4
[0040]實施例2、3得到的單核銅配合物的相關測試和試驗
[0041]一、兩個單核銅配合物的電子吸收光譜變化試驗:
[0042]實驗過程:
[0043]在室溫下，向樣品池和參比池中各加2.0mL緩沖溶液(緩沖溶液用三蒸水配制，含50mM NaCl和5mM Tris，用鹽酸調至pH=7.2)，然后向樣品池加入一定量體積的配合物溶液并向參比池中補加相應等體積的緩沖溶液。用微量進樣器往樣品池和參比池中加入一定量相同體積的CT-DNA儲備液，使CT-DNA與配合物的濃度比值不斷增加，觀察配合物吸收峰的變化并將數據保存以便擬合處理。
[0044]實驗結果:
[0045]單核銅配合物(1)
[0046]如圖2a所示，單核銅配合物在255nm和287nm處有強紫外吸收，隨著CT-DNA的逐漸等量加入，配合物的最大吸收峰強度逐漸降低，表現出“減色”特征，計算該化合物在最大吸收峰處的減色率為26.32%，表明配合物與CT-DNA發生了插入作用。為了定量比較化合物與DNA結合的強弱，我們通過監控配合物的吸收光譜變化(圖2a內的嵌入圖)，由方程式(ea-ef) / ( ε b- ε f) = (b-(b2-2Kb2Ct [DNA] t/s)1/2) / 2KbCt (Thorp and Bard 方程)可計算出配合物與DNA的結合常數Kb，式中[DNA]表示DNA的濃度，Ct表示配合物的濃度，b=l+KbCt+Kb[DNA] / 2s,而 ε a，ε f 分別表示 Atjbsd / [complex],完全結合后的配合物的摩爾吸光系數和自由配合物的摩爾吸光系數，s是鍵合位點的大小。以(ea-ef) /
(ε b_ ε f)對[DNA]作圖，擬合得到結合常數Kb，其值為8.68 X IO5M'表明該化合物與DNA的鍵合作用為中等鍵合強度。
[0047]單核銅配合物(2)
[0048]如圖2b所示，單核銅配合物同樣在255nm和287nm處有強紫外吸收，隨著CT-DNA的逐漸等量加入，配合物的最大吸收峰強度逐漸降低，表現出“減色”特征，計算該化合物在最大吸收峰處的減色率為19.09%，表明配合物與CT-DNA發生了插入作用。為了定量比較化合物與DNA結合的強弱，我們通過監控配合物的吸收光譜變化(圖2b內的嵌入圖)，由方程式(ε a- ε f) / ( ε b- ε f) = (b_ (b2_2Kb2Ct [DNA] t / s)1/2) / 2KbCt (Thorp and Bard 方程)可計算出配合物與DNA的結合常數Kb，式中[DNA]表示DNA的濃度，Ct表示配合物的濃度，b=l+KbCt+Kb[DNA] / 2s,而 ε a，ε f 分別表示 Atjbsd / [complex],完全結合后的配合物的摩爾吸光系數和 自由配合物的摩爾吸光系數，s是鍵合位點的大小。以(ea-ef) /
(ε b_ ε f)對[DNA]作圖，擬合得到結合常數Kb，其值為4.97 X IO5M'表明該化合物與DNA的鍵合作用為中等鍵合強度。
[0049]二、EB-DNA的熒光淬滅變化試驗:
[0050]兩個單核配合物本身均不產生熒光，所以不能采用直接熒光光譜法研究配合物與DNA的相互作用。故采用配合物淬滅DNA與EB結合物的熒光，通過研究EB-DNA結合物熒光強度的變化來間接測定配合物與DNA的結合程度。
[0051]實驗過程:
[0052]配制CT-DNA和EB的混合溶液，其含量分別為2.4 X IO^6M EB和4.8 X 10-5ΜCT-DNA，儲備于4°C冰箱中。配合物配制成10_3M儲備液。淬滅滴定實驗時，向樣品池中加入2.0mL儲備的EB-DNA混合液，觀察其熒光強度，然后用微量進樣器每次往樣品池中加入等體積的配合物儲備液，使配合物與DNA的濃度比值不斷增加，觀察發射光譜的變化并將數據保存以便擬合處理。
[0053]實驗結果:
[0054]如圖3a和圖3b所示，配合物淬滅EB-DNA的熒光光譜，在加入配合物后，EB-DNA的熒光強度降低，并且隨著配合物濃度的增加，其熒光強度逐漸降低，表明配合物與CT-DNA的競爭結合取代了 EB。根據經典的熒光淬滅理論Stem-Volmer方程式，10 / I=1+K[Q]，以加入配合物前后EB-DNA的熒光強度比值(I。/ I)為縱坐標，配合物的濃度為橫坐標，做出了 Stem-Volmer圖(圖3a和圖3b內的嵌入圖)，對測試數據進行擬合，得到較好的線性關系。根據方程 Keb [EB] =kapp [complex]，Keb=L O X IO7W1 ([EB] =2.4 μ Μ)，計算出 R 型單核銅配合物和S型單核銅配合物的表觀鍵合常數Kapp分別為2.06 X 1O5M-1和2.24X IO5M'均小于經典鍵合常數107m-1，說明兩個配合物與DNA之間均為中等鍵合作用。[0055]三、實施添加H2O2后，單核銅化合物對PBR322DNA的濃度依賴切割實驗:
[0056]實驗過程:
[0057]為了檢測配合物的化學核酸酶活性，我們采用瓊脂糖凝膠電泳法對配合物進行PBR322DNA切割實驗研究，如圖4a和圖4b所示，配合物在近生理條件環境下(pH=7.2，37°C )，加入pBR322DNA和250 μ M H2O2,再將梯度濃度銅化合物與200ng pBR322DNA混合，銅化合物濃度梯度數據如下:10 μ M，20 μ Μ, 30 μ Μ, 50 μ Μ,
[0058]實驗結果:
[0059]如圖4a和圖4b所示，兩個單核銅配合物在近生理條件且在誘導劑H2O2存在下均能夠有效地切割DNA，將超螺旋型質粒pBR322DNA(Form I)降解至缺刻開環型(Form II)和線狀DNA(Form III)。我們發現，增加配合物的濃度，DNA的斷裂程度增加，且在化合物濃度為 50μΜ 時，[CuLCl] (ClO4)和[CuL (acac) ] (PF6)配合物分別產生近 95 %和 86 % 的 FormII，表明該化合物表現出良好的濃度依賴切割DNA活性。
[0060]四、實施添加H2O2后，兩個單核銅化合物對PBR322DNA的切割機理實驗:
[0061]為了探討雙核 配合物對DNA的切割機理，我們采用單線態氧(1O2)抑制劑NaN3，超氧陰離子自由基(02_)抑制劑S0D，羥基自由基(.0H)淬滅劑KI和金屬離子螯合劑EDTA，過氧化物抑制劑catalase，對DNA切割活性的影響來判斷是否有活性氧物種存在。為了研究配合物和DNA作用的結合部位，我們分別加入了小溝槽和大溝槽結合試劑如SYBR green和甲基綠。
[0062]實驗過程:
[0063]在瓊脂糖凝膠電泳儀中，泳道0-2分別為DNA對照:DNA ；DNA+250 μ M H2O2 ；DNA+250 μ M H202+50 μ M配合物；泳道3-9為切割機理的研究:DNA+50 μ M配合物+250 μ MH2O2，分別加入:20mM KI ；20mM NaN3 ；20U / mL SOD ；20U / mL catalase ; IOmM 甲基綠；10mMSYBR green I；10mM EDTA。
[0064]實驗結果:
[0065]從圖5a和圖5b可知，兩個單核銅配合物對DNA的切割活性結果相似，均在加入抑制劑KI (泳道3)和NaN3 (泳道4)后DNA的切割活性被抑制，這說明反應過程中可能產生了羥基自由基和單線態氧類活性物種。化合物對PBR322DNA的切割機理為氧化切割。在金屬螯合劑EDTA存在下，配合物對DNA的斷裂程度都減弱，暗示金屬陽離子在配合物斷裂DNA過程中起著重要的作用。甲基綠和SYBR green的加入并沒有對配合物切割DNA產生明顯的抑制作用，說明溝槽處不是配合物和DNA作用的首選位點。
[0066]五、化合物對幾種癌細胞的選擇性實驗:
[0067]MTT (噻唑蘭)法是一種檢測細胞存活和生長的方法。該實驗基本原理是:噻唑蘭可透過活細胞膜進入細胞內，活細胞線粒體中的琥珀脫氫酶能使外源性MTT還原為難溶于水的藍紫色的Formazan結晶并沉淀在細胞中，結晶物能被DMSO溶解,用酶標儀檢測570nm處的吸光度值，可間接反映活細胞數量。該方法常用于大量的抗腫瘤藥物篩選、細胞毒性試驗以及腫瘤放射敏感性測定等。具有靈敏度高、經濟等優點。
[0068]實驗過程:
[0069]我們利用MTT法測定了配合物對體外HeLa、MCF-7、Bel-7404和H印G_2細胞生長的抑制能力。其基本步驟是:將細胞接種于96孔培養板，每孔2X IO5個細胞，6復孔。5%C02，37°C下孵育24h后，不同濃度藥物加入相應孔板中作用腫瘤細胞48h，同時設置對照孔(細胞、相同濃度的藥物溶解介質、培養液、MTT、二甲基亞砜)，并且每組設定3復孔。每孔加入MTT(5mg / mL) 20 μ L，繼續培養4h，小心吸棄上層清液，加二甲基亞砜(IOOyL /孔)，輕微震蕩，室溫反應0.5h，用酶標儀檢測570nm處的吸光度值，然后分析數據。
[0070]如表3所不，該兩種配合物分別作用宮頸癌HeLa、乳腺癌MCF-7和肝癌HepG_2、Bel-7404細胞48小時后，發現對四種細胞均有明顯的抑制作用，表明這兩個單核銅配合物對四種細胞均具有較好 的抗癌活性，可作為潛在的抗癌藥物。
[0071]表1兩個銅配合物晶體結構的主要數據
[0072]
【權利要求】
1.一種單核銅配合物，其特征在于它的化學式分別為[CuLCl] (ClO4) (I)和[CuL(acac)] (PF6) (2)，其中其中 L 為 N，N-(2_ 吡啶基)-1-(1-萘基)乙胺。
2.根據權利要求1所述的銅配合物，其特征在于它的結構描述如下: 配合物(I)的非對稱基本單元由[CuLCl]+陽離子和外界的一個高氯酸根陰離子組成，每個配體與一個銅離子配位，采取四配位的平面正方形配位構型，每一個銅離子與配體的兩個吡啶氮原子和一個乙胺氮原子配位，另外還與一個外界的氯離子配位； 配合物(2)非對稱基本單元由[CuUacac)]+陽離子和外界的一個六氟磷酸根陰離子組成；每個配體與一個銅離子配位，采取五配位的四方錐配位構型；每一個銅離子與配體的兩個吡啶氮原子和一個乙胺氮原子配位，另外還與外界的乙酰丙酮上兩個氧原子配位。
3.根據權利要求1所述的銅配合物，其特征在于所述的銅配合物(I)晶體為正交晶系，空間點群為 Pbca，晶胞參數為:a=13.966(4)A，b=13.887(4) A，c= 23.249(6)A,單胞體積Y= 4509(2)人3。
4.根據權利要求1所述的銅配合物，其特征在于所述的銅配合物(2)晶體為單斜晶系，空間點群為 P2(l) / c，晶胞參數為:a= 16.570(3) A, b = 12.324(3) A, c = 14.080(3) A,β =101.64 (3)。，單胞體積 V= 2816.2(10) A3。
5.權利要求1所述的銅配合物(I)的制備方法，其特征在于它包括了如下步驟:將配體L.2此104溶于乙醇，加入 等摩爾三氯乙酸銅的水溶液，再加入氫氧化鋰調節酸度，室溫攪拌4小時，反應液過濾；濾液靜置5-7天后析出晶體即為產物，收集晶體。
6.根據權利要求5所述的制備方法，其特征在于所述三氯乙酸銅與配體N，N-(2-吡啶基)-1-(1-萘基)乙胺的摩爾比為1:1。
7.權利要求1所述的銅配合物(2)的制備方法，其特征在于它包括如下步驟:將配體L于乙醇，加入等摩爾Cu (acac) 2 / CH2Cl2的水溶液，再加入氫氧化鋰調節酸度，室溫攪拌2.5小時，再加入等摩爾六氟磷酸鉀，室溫下攪拌反應2小時，反應液過濾；濾液靜置5-7天后析出晶體即為產物，收集晶體。
8.權利要求1所述的銅配合物的應用，其特征在于用于制備抗癌藥物。
【文檔編號】A61P35/00GK103788118SQ201410069353
【公開日】2014年5月14日 申請日期:2014年2月21日 優先權日:2014年2月21日
【發明者】周學拳, 孫倩, 田金磊, 閻世平 申請人:南開大學