白介素2的超級激動劑、部分激動劑和拮抗劑的制作方法

背景

白介素2(IL-2)是主要由活化的CD4⁺T細胞產生的多能細胞因子，其在產生正常免疫應答中發揮重要的作用。IL-2促進活化的T淋巴細胞的增殖和擴增，增強B細胞生長，并且活化單核細胞和天然殺傷細胞。正是憑借這些活性，IL-2得到測試并且用作癌癥的批準治療(阿地白介素(aldesleukin)，)。

在真核細胞中，人IL-2作為153個氨基酸的前體多肽合成，從所述前體多肽中去除20個氨基酸以產生成熟的分泌性IL-2(Taniguchi 1983)。重組人IL-2已在大腸埃希氏菌(E.coli)(Rosenberg 1984)、昆蟲細胞(Smith 1985)和哺乳動物COS細胞(Taniguchi 1983)中產生。

白介素-2(IL-2)是首先被鑒定為T細胞生長因子的四α-螺旋束I型細胞因子(Morgan等人，Science 193：1007(1976))，但隨后顯示其具有廣泛的作用。IL-2促進T輔助分化(Zhu等人，Annual review of immunology 28：445(2010)；Liao等人，Nat Immunol 9：1288(2008)；及Liao等人，Nat Immunol 12：551(2011))和調節性T(Treg)細胞的發育(Cheng等人，Immunol Rev 241：63(2011))，誘導天然殺傷和淋巴因子活化的殺傷活性(Liao等人，Immunity 38：13(2013))，并介導活化誘導的細胞死亡(AICD)(Lenardo等人，Nature 353：858(1991))。

IL-2通過與三種不同的受體相互作用起作用：白介素2受體α(IL-2Rα；CD25)、白介素2受體β(IL-2Rβ；CD122)和白介素2受體γ(IL-2Rγ；CD132；共同γ鏈)。待鑒定的第一種受體是IL-2Rα，其是在T細胞活化后出現的55kD多肽(p55)，并且最初被稱為Tac(代表T活化)抗原。IL-2Rα以約10^-8M的K_d結合IL-2，并且也被稱為“低親和力”IL-2受體。IL-2與僅表達IL-2Rα的細胞的結合不導致任何可檢測的生物學應答。

IL-2經由靜息T細胞和NK細胞上的中間親和力受體(K_d約10^-9M)(其由IL-2Rβ和共同的細胞因子受體γ鏈γ_c(IL-2Rγ)組成)或經由活化的淋巴細胞和Treg細胞(其另外表達IL-2Rα(CD25))上的高親和力受體(K_d約10^-11M)發信號(Lenardo等人，Nature 353：858(1991)；及Yuan等人，Immunol Rev 259：103(2014))。鑒于γ_c由IL-4、IL-7、IL-9、IL-15和IL-21的受體共享(Leonard等人，Nature Reviews Immunology 1：200(2001))并且由具有X染色體連鎖性嚴重聯合免疫缺陷的人中突變的基因編碼(Noguchi等人，Cell 73：147(1993年4月9日))，IL-2Rβ被IL-15的受體共享(Waldmann，Nature Reviews Immunology 6：595(2006))，IL-15是一種對于NK細胞和記憶CD8⁺T細胞的正常發育至關重要的細胞因子(Waldmann，Nature Reviews Immunology 6：595(2006))。

結合其受體的IL-2和IL-15的三維結構提供了對受體裝配和信號傳導的了解(Wang等人，Science 310：1159(2005)；及Ring等人，Nat Immunol 13：1187(2012))。除了它們在正常免疫應答中的生理作用之外，IL-2和IL-15還可以促進病理應答，并且治療目標是維持這些細胞因子的期望作用，同時阻斷不利的自身免疫或免疫抑制應答。針對人IL-2Rα的兩種單克隆抗體(mAb)，即達利珠單抗(Daclizumab)和巴利昔單抗(Basiliximab)得到FDA批準，并且在腎移植排斥(Vincenti等人，N Engl J Med 338：161(1998))、心臟移植(Hershberger等人，N Engl J Med 352：2705(2005))、多發性硬化(Gold等人，Lancet 381：2167(2013))和哮喘(Bielekova等人，Proc Natl Acad Sci USA 101：8705(2004)；及Busse等人，Am J Respir Crit Care Med 178：1002(2008))中展現出功效，但是它們不經由NK和記憶CD8⁺細胞上表達的中間親和性IL-2Rβ-γ_c受體阻斷IL-2信號傳導并且不能阻斷IL-15信號傳導(Tkaczuk等人，Am J Transplant 2：31(2002))。雖然抗-人IL-2Rβ mAb Mikβ1可以阻斷IL-2和IL-15向表達IL-2Rβ-γ_c受體的細胞的反式呈遞(trans-presentation)(Morris等人，Proc Natl Acad Sci USA 103：401(2006))，但是它在經由其高親和力異三聚體受體復合物阻斷通過IL-2或IL-15的反式信號傳導中是相對無效的(Morris等人，Proc Natl Acad Sci USA 103：401(2006)；及Waldmann等人，Blood 121：476(2013))。因此，需要可阻斷一種或多種IL-2和/或IL-15功能的新型IL-2突變蛋白。本公開提供了用作IL-2部分激動劑和拮抗劑的新型IL-2突變蛋白。

概述

IL-2對免疫系統發揮了廣譜的作用，并且它在調節免疫活化和穩態兩者中發揮重要的作用。作為免疫系統刺激劑，IL-2已經在治療癌癥和慢性病毒感染中得到應用。IL-2的刺激影響也可以導致破壞，介導自身免疫和移植物排斥。由于其在免疫調節和疾病中的工具性作用，鑒定新型IL-2分子，如IL-2部分激動劑和拮抗劑仍然是研究的活躍領域。

基于對IL-2與其關聯受體如何相互作用的新了解，本文中提供了新型IL-2組合物。在大多數情況下，IL-2經由三種不同受體起作用：IL-2Rα、IL-2Rβ和IL-2Rγ。大多數細胞，如靜息T細胞不響應IL-2，由于它們僅表達IL-2Rβ和IL-2Rγ(它們對IL-2具有低親和力)。在刺激時，靜息T細胞表達相對高親和力IL-2受體IL-2Rα。IL-2與IL-2Rα的結合引起此受體序貫結合IL-2Rβ，和IL-2Rγ，引起T細胞活化。

先前開發出由于對IL-2Rβ的增強的結合親和力而具有提升的作用的IL-2“超級因子(superkine)”(Levin等人，Nature 484：529(2012))。假設此高親和力超級因子/IL-2Rβ復合物可以充當顯性陰性支架以創建“受體信號傳導夾”以阻斷內源信號傳導。定向突變這些超級-IL-2“完全激動劑”以降低對IL-2Rγ_c的結合會減弱IL-2Rβ-γ_c異二聚化，并且代表新一類的基于機制的IL-2部分激動劑和非信號傳導(中性)分子，其通過阻斷內源細胞因子并且自身不施加作用而在功能上起拮抗劑的作用(參見圖1中的示意圖)。

本文中提供了新型人白介素-2(IL-2)突變蛋白或其變體。具體地講，提供了IL-2突變蛋白，其具有升高的對IL-2Rβ受體的結合能力和降低的對IL-2Rγ_c受體的結合能力。例如，此類IL-2突變蛋白在降低或抑制一種或多種IL-2和/或IL-15功能為有用的應用中(例如，在治療移植物抗宿主病(GVHD)和成人T細胞白血病中)作為IL-2部分激動劑和拮抗劑得到應用。還提供了編碼此類IL-2突變蛋白的核酸、制備此類IL-2突變蛋白的方法、包含此類IL-2突變蛋白的藥物組合物和使用此類IL-2突變蛋白的治療方法。

在一個方面中，本文中提供了IL-2突變蛋白，所述IL-2突變蛋白與野生型人IL-2相比具有更大的對IL-2Rβ的結合親和力和降低的對IL-2Rγ_c受體的結合親和力(hIL-2)。在一些實施方案中，IL-2突變蛋白包含：(a)提供IL-2Rβ結合親和力的一個或多個氨基酸取代，其選自根據野生型hIL-2編號的氨基酸位置24、65、74、80、81、85、86、89、92和/或93；和(b)降低IL-2Rγ_c受體結合親和力的一個或多個氨基酸取代，其選自根據野生型hIL-2編號的氨基酸位置18、22、126和/或130。

在多個實施方案中，所述提高IL-2Rβ結合親和力的氨基酸取代包括：Q74N、Q74H、Q74S、L80F、L80V、R81D、R81T、L85V、I86V、I89V和/或I93或其組合。在某些實施方案中，所述提高IL-2Rβ結合親和力的氨基酸取代包括：L80F、R81D、L85V、I86V和I92F。在一些實施方案中，所述提高IL-2Rβ結合親和力的氨基酸取代包括：N74Q、L80F、R81D、L85V、I86V、I89V和I92F。在一些實施方案中，所述提高IL-2Rβ結合親和力的氨基酸取代包括：Q74N、L80V、R81T、L85V、I86V和I92F。在某些實施方案中，所述提高IL-2Rβ結合親和力的氨基酸取代包括：Q74H、L80F、R81D、L85V、I86V和I92F。在一些實施方案中，所述提高IL-2Rβ結合親和力的氨基酸取代包括：Q74S、L80F、R81D、L85V、I86V和I92F。在某些實施方案中，所述提高IL-2Rβ結合親和力的氨基酸取代包括：Q74N、L80F、R81D、L85V、I86V和I92F。在某些實施方案中，所述提高IL-2Rβ結合親和力的氨基酸取代包括：Q74S、R81T、L85V和I92F。

在一些實施方案中，所述降低IL-2Rγ_c受體結合親和力的氨基酸取代包括氨基酸取代L18R、Q22E、A126T和/或S130R或其組合。在具體的實施方案中，所述降低IL-2Rγ_c受體結合親和力的氨基酸取代包括Q126T。在某些實施方案中，所述降低IL-2Rγ_c受體結合親和力的氨基酸取代包括L18R和Q22E。在一些實施方案中，所述降低IL-2Rγ_c受體結合親和力的氨基酸取代包括L18R、Q22E和Q126T。在某些實施方案中，所述降低IL-2Rγ_c受體結合親和力的氨基酸取代包括L18R、Q22E、Q126T和S130R。

在一個實施方案中，IL-2突變蛋白與野生型人IL-2相比具有更大的對IL-2Rβ的結合親和力和降低的對IL-2Rγ_c受體的結合親和力，其中IL-2突變蛋白包含氨基酸取代L80F、R81D、L85V、I86V、I92F和Q126T。

在一個實施方案中，IL-2突變蛋白與野生型人IL-2相比具有更大的對IL-2Rβ的結合親和力和降低的對IL-2Rγ_c受體的結合親和力，其中IL-2突變蛋白包含氨基酸取代L18R、Q22E、L80F、R81D、L85V、I86V和I92F。

在一個實施方案中，IL-2突變蛋白與野生型人IL-2相比具有更大的對IL-2Rβ的結合親和力和降低的對IL-2Rγ_c受體的結合親和力，其中IL-2突變蛋白包含氨基酸取代L18R、Q22E、L80F、R81D、L85V、I86V、Q126T和I92F。

在一個實施方案中，IL-2突變蛋白與野生型人IL-2相比具有更大的對IL-2Rβ的結合親和力和降低的對IL-2Rγ_c受體的結合親和力，其中IL-2突變蛋白包含氨基酸取代L18R、Q22E、L80F、R81D、L85V、I86V、I92F、Q126T和S130R。

在某些實施方案中，主題IL-2突變蛋白與野生型hIL-2相比具有降低的刺激IL-2Rβ+T細胞中的STAT5磷酸化的能力。在一些實施方案中，T細胞是CD8+T細胞。

在一些實施方案中，主題IL-2突變蛋白與野生型hIL-2相比具有降低的刺激IL-2Rβ+細胞中的pERK1/ERK2信號傳導的能力。

在某些實施方案中，主題IL-2突變蛋白是IL-2和/或IL-15拮抗劑。在一些實施方案中，IL-2突變蛋白是CD8+T細胞中的IL-2和/或IL-15STAT5磷酸化的抑制劑。在一些實施方案中，IL-2突變蛋白是IL-2和/或IL-15誘導的CD8+T細胞增殖的抑制劑。在一些實施方案中，IL-2突變蛋白是IL-2依賴性的TCR誘導的細胞增殖的抑制劑。在一個實施方案中，IL-2突變蛋白是IL-2依賴性Th1、Th9和/或Treg分化的抑制劑。在某些實施方案中，IL-2突變蛋白是Th17分化的促進劑。在一些實施方案中，突變蛋白是NK細胞的IL-2依賴性活化的抑制劑。

在另一個方面中，本文中提供了IL-2突變蛋白融合蛋白，其包含與人Fc抗體片段連接的本文中描述的任一種IL-突變蛋白。

在另一個方面中，本文中提供了藥物組合物，其包含本文中描述的任一種IL-2突變蛋白或IL-2突變蛋白融合蛋白和藥學可接受載體。在一些實施方案中，藥物組合物包含具有氨基酸取代L18R、Q22E、L80F、R81D、L85V、I86V、I92F、Q126T和S130R的IL-2突變蛋白。

在又一個方面中，本文中提供了治療患有移植物抗宿主病(GVHD)的受試者的方法。在多個實施方案中，方法包含對受試者施用治療有效量的包含本文中公開的任一種IL-2突變蛋白的藥物組合物。在一些實施方案中，藥物組合物包含具有氨基酸取代L18R、Q22E、L80F、R81D、L85V、I86V、I92F、Q126T和S130R的IL-2突變蛋白。

在另一個方面中，本文中提供了治療患有成人T細胞白血病的受試者的方法。在某些實施方案中，該方法包括向所述受試者施用治療有效量的包含本文中公開的任一種IL-2突變蛋白的藥物組合物。在一些實施方案中，藥物組合物包含具有氨基酸取代L18R、Q22E、L80F、R81D、L85V、I86V、I92F、Q126T和S130R的IL-2突變蛋白。

附圖說明

圖1顯示了用于產生本文中提供的主題IL-2突變蛋白的示意圖。左邊，在IL-2上，綠色區域指示先前報道的變化以產生對IL-2Rβ具有高親和力結合的H9“超級IL-2”，從而阻斷內源性IL-2的結合。紅色圓圈指示IL-2的變化，其降低與IL-2Rγ_c的結合和IL-2Rβ-γ_c異二聚化。右邊，根據對IL-2Rγ_c結合的破壞水平，應當產生不同水平的活性和功能，如指示。

圖2顯示了如本文中描述的IL-2突變蛋白文庫的FACS概貌。將人IL-2基因的易錯PCR的產物進行選擇。經由六輪選擇產生第一代IL-2文庫。使用與藻紅蛋白(PE)綴合的四聚體IL-2Rβ進行第一輪以結合表達IL-2突變蛋白的酵母(A)。使用用PE標記的單體IL-2Rβ實現選擇的后續輪次。(B)來自第二代IL-2文庫的結果。

圖3描繪了相對于野生型IL-2序列顯示的具有高親和力IL-2Rβ結合的IL-2突變蛋白中改變的氨基酸殘基。還顯示了每種突變蛋白和IL-2對IL-2Rβ的結合親和力。

圖4顯示了對IL-2Rβ具有高親和力結合的IL-2突變蛋白對CD25^-和CD25⁺天然殺傷(NK)細胞的刺激作用。在經處理的(A)CD25^-和(B)CD25⁺YT-1NK細胞中證實的野生型IL-2和IL-2突變蛋白6-6、D10、和H9對STAT5磷酸化的劑量響應關系。圓圈野生型IL-2；正方形6-6；三角形向上H9；三角形向下D10。

圖5顯示了IL-2突變蛋白結合的CD25非依賴性。CD25^-和CD25⁺YT-1NK細胞的STAT5磷酸化的劑量響應曲線。(A)IL-2和IL-2(F42A)(圓圈，實線野生型IL-2，CD25+細胞；正方形，實線IL-2F42A，CD25+細胞；三角形向上，虛線野生型IL-2，CD25-細胞；三角形向下，虛線，IL-2F42A，CD25-細胞)。(B)H9和H9(F42A)(圓圈，實線野生型H9，CD25+細胞；正方形，實線H9F42A，CD25+細胞；三角形向上，虛線H9，CD25-細胞；三角形向下，虛線，H9F42A，CD25-細胞)。雖然F42A突變使CD25⁺細胞上的野生型IL-2的劑量響應曲線向右轉變，但對CD25^-沒有觀察到的影響，H9和H9 F42A的劑量響應曲線是基本上重疊的，不管CD25表達如何。

圖6描繪了幾種IL-2突變蛋白“超級激動劑”(即，對IL-2Rβ具有高親和力結合的突變蛋白)在缺乏IL-2Rα的情況下刺激T細胞的能力。用IL-2突變蛋白或野生型IL-2刺激從CD25敲除小鼠分離的T細胞。提供了IL-2突變蛋白的劑量響應曲線和響應的EC50。如顯示，所有測試的IL-2突變蛋白相對于野生型IL-2在缺乏IL-2Rα的情況下導致相對升高的T細胞刺激。

圖7是比較IL-2突變蛋白“超級激動劑”誘導有經歷的T細胞刺激的相對能力的FACS分析。用兩種濃度的(10ng/ml或1ng/ml)的IL-2突變蛋白或野生型IL-2刺激T細胞。在每個FACS概貌中顯示了刺激的T細胞的百分比。

圖8顯示了IL-2“超級激動劑”突變蛋白D10對天然殺傷(NK)細胞功能，特別是自發和抗體依賴性細胞介導的細胞毒性的影響。將天然殺傷細胞(效應子)和經Cr⁵¹標記的腫瘤細胞(靶物)在存在野生型IL-2或IL-2突變蛋白D10的情況下與或不與抗EGFR抗體西妥昔單抗(cetuximab)一起孵育5小時。NK細胞自發細胞毒性的D10刺激由于高劑量IL-2(*p＝0.008，**p＝0.001)，在沒有IL-2或D10刺激的情況下有最小的自發細胞毒性。此外，D10的添加增強西妥昔單抗抗體的ADCC。

圖9顯示了D10的晶體結構。L85V的初始疏水核心突變導致靶向多個疏水性核心殘基和高親和力共有序列的第二代IL-2文庫。D10的晶體結構在螺旋C之前的環區域中含有明確限定的電子密度。

圖10顯示了相對于IL-2，對IL-2Rβ具有高親和力結合的IL-2“超級激動劑”突變蛋白展現出CD8⁺T細胞而非Treg的增強的刺激。在接受PBS、20μgIL-2、20μg H9或1.5μg IL-2/抗IL-2單克隆抗體復合物(IL-2/mAb)的小鼠的脾中測定(A)宿主CD3⁺CD8⁺CD44^高記憶表型(MP)T細胞和(B)宿主CD3⁺CD4⁺CD25^高T細胞(調節T細胞)的總細胞計數。

圖11顯示了相對于IL-2，對IL-2Rβ具有高親和力結合的IL-2突變蛋白激動劑展現出增強的抗腫瘤響應及降低的不利作用。肺水腫(肺濕重)充當IL-2處理后不利毒性作用的量度，并通過在干燥之前和之后稱重肺測定(A)。P值意指治療方式之間的比較。*，p＜0.05；**，p＜0.01。(B)使用B16F10黑素瘤細胞在體內測試IL-2突變蛋白的抗贅生性質。給C57B1/6小鼠(n＝3-4只小鼠/組)皮下注射106個B16F10黑色素瘤細胞，然后一旦腫瘤結節變得可見和可觸摸(其通常對應于腫瘤細胞注射后的第4至5天或約15mm²的腫瘤大小)，每天注射PBS、20μg IL-2、20μg H9或1.5μg IL-2/抗IL-2單克隆抗體復合物(IL-2/mAb)達5天。顯示以mm²計的平均腫瘤面積(+/-SD)對腫瘤接種后的時間。P值意指IL-2與其它治療方式的比較。

圖12顯示了通過破壞γ_c結合產生基于機制的IL-2突變蛋白。(A)H9-IL-2Rβ-γ_c復合物的結構(H9是綠色；IL-2Rβ是藍色；γ_c是金色)。以青色顯示了對H9-RETR摻入以破壞IL-2與γ_c的相互作用的突變(L18R，Q22E，Q126T，和S130R)(圖的右邊部分)。(B，C)H9-IL-2Rβ(C)和H9-RET-IL-2Rβ(D)復合物對γ_c的結合的表面等離子體共振分析。

圖13顯示了對IL2Rγ_c具有降低的結合親和力的IL-2突變蛋白的減弱的信號傳導。(A，B)對野生型IL-2或各種H9變體測試其在CD25^-(A)和CD25⁺(B)YT-1人NK樣細胞中誘導STAT5磷酸化的能力。(C，D)相對于細胞因子刺激后CD25^-YT-1細胞中的最大表面表達，IL-2Rβ(C)和IL-2Rγ(D)的內化動力學。(E)將新鮮分離的(上部圖)或預活化的(下部圖)的CD8⁺T細胞保持未刺激或者用1μg/ml IL-2、H9-RE、H9-T、H9-RET或H9-RETR刺激30分鐘。通過流式細胞術測定CD25表達(左圖)或pSTAT5(右圖)。(F)用IL-2、H9、H9-RET或H9-RETR處理如指定的細胞，裂解，并且用針對pSTAT5或總STAT5的抗體進行蛋白質印跡。(G)由野生型IL-2、H9、H9-RE、H9-T、H9-RET和H9-RETR誘導的pSTAT5的劑量響應曲線。(H)由野生型IL-2、H9、H9-RET和H9-RETR得到的磷酸-S6核糖體蛋白(pS6)的劑量響應曲線。MFI，均值熒光強度。對于劑量響應實驗(A，B，G，H)，橫坐標指示以ng/ml計的細胞因子濃度的對數。MFI，均值熒光強度。數據代表每組的至少兩個實驗(誤差條，一式三份的S.E.M.)。

圖14顯示了在兩種不同測定中對IL2Rγ_c具有降低的結合親和力的IL-2突變蛋白的減弱的信號傳導。(A)CD25^-YT1人NK樣細胞上的磷酸-ERK1/ERK2蛋白的劑量響應曲線。(B)新鮮分離的(上部圖)或預活化的(下部圖)人CD8⁺T細胞上的IL-2Rβ和IL-2Rγ表達的比較。數據代表每組的至少兩個實驗。誤差條代表一式三份的SEM.。

圖15顯示了響應IL-2、H9、H9-RE、H9-T、H9-RET和H9-RETR的增殖和CD25表達。由IL-2和H9而非由H9-RET或H9-RETR誘導新鮮分離的人CD8⁺T細胞的增殖的誘導，H9-T有中間作用。用CFSE標記細胞，用指定的IL-2變體刺激，并且在5天后通過流式細胞術評估CFSE稀釋。

圖16顯示了H9-RET和RETR對增殖、STAT5結合、和基因表達的影響。(A)在具有不同濃度的指定的IL-2變體的96孔板中培養新鮮分離的和預活化的人CD8⁺T細胞達2天，并且測量[³H]-胸苷摻入。棒代表均值±S.E.M。從2名個體供體組合細胞。數據代表至少兩個獨立實驗。(B)用IL-2、H9、H9-RET和H9-RETR(1μg/ml)處理24小時的預活化的CD8⁺T細胞的RNA-Seq熱圖分析。顯示了基因，其表達相對于對照被IL-2上調或下調(根據顏色量表，在-1.00和1.00之間歸一化每種基因的表達)。顯示了優先上調(紅色)或下調(綠色)≥2倍的mRNA。(C)用指定的細胞因子刺激后上調(空心棒)或下調(實心棒)的mRNA數目。IL-2、H9、H9-RET和H9-RETR分別誘導731、742、65和23種mRNA，并且抑制437、397、13和46種mRNA(倍數變化≥2；p值＜1e-10)。(D)基于ChIP-Seq的STAT5B結合位點的數目及其在用IL-2變體處理的預活化的CD8⁺T細胞中的全基因組分布。顯示了5’非翻譯區(5’UTR)、外顯子、內含子、和3’非翻譯區(3’UTR)，如在人RefSeq數據庫(匯編GRCh37.p9)中限定。TSS上游的5kb稱為啟動子區。(E)使用IL-2誘導的STAT5B峰實施熱圖聚簇，其以STAT“峰頂點”(以位置“0”指示)的上游約1kb和下游1kb為中心。由IL-2、H9、H9-RET和H9-RETR誘導的結合強度以紅色的強度指示。(F)在保持未刺激或用IL-2、H9、H9-RET和H9-RETR刺激24小時的預活化的細胞中相對于RPL7的IL2RA、LTA、CISH、IL7RA和BCL6 RNA的表達。數據代表至少兩個實驗，除了RNA-Seq實驗外，其中通過RT-PCR確認選擇基因(參見文本)。

圖17描繪了用IL-2、H9、H9-RE、H9-T、H9-RET或H9-RETR處理的預活化的CD8⁺T細胞上的CD25表達。數據代表三個獨立實驗。

圖18顯示了H9-RETR抑制IL-2R介導的信號傳導。(A和B)H9-RET和H9-RETR是IL-2和IL-15的競爭性抑制劑。在缺乏或存在1μg/ml H9-RET或H9-RETR的情況下將預活化的人CD8⁺T細胞與指定濃度的IL-2或IL-15孵育。(C和D)H9-RETR在預活化的CD8⁺T細胞中比抗Tac或Mikβ1單抗更有效阻斷IL-2和IL-15誘導的STAT5磷酸化。(E和F)H9-RETR比抗Tac或Mikβ1更有效抑制IL-2誘導的或IL-15誘導的增殖。顯示了均值±S.E.M。數據代表三個獨立實驗。(G)H9-RETR在體內抑制IL-2-誘導的(上圖)和IL-15誘導的(下圖)STAT5磷酸化。在IL-2或IL-15之前60分鐘向C57BL/6小鼠注射(i.p)Fc4或Fc4-H9-RETR。30分鐘后在脾CD4⁺CD25⁺FoxP3⁺T細胞中測量pSTAT5。指示MFI。數據代表三個獨立實驗。(H)Fc4-H9-RETR減弱GVHD。對BALB/c小鼠進行輻照(950cGy)，并移植1000萬個T消耗的骨髓(BM)細胞，不含或含有來自C57BL/6小鼠的200萬個Treg消耗的泛-T細胞。通過以100μg/劑量每天兩次i.p.注射10天，用Fc4或Fc4-H9-RETR融合蛋白處理接受泛-T細胞的小鼠。數據表示從三個獨立實驗合并的存活曲線，并使用Kaplan-Meier方法和對數秩檢驗進行分析。對于Fc4對H9-RETR-Fc4，p＝0.0001。(I)如指示，在存在或缺乏UPC10，達利珠單抗，Mikβ1或H9-RETR的情況下阻斷用50U/ml IL-2培養3天的ED40515(+)T細胞的增殖。數據代表兩個實驗，每個實驗一式三份進行。(J)用UPC10、達克珠單抗、Mikβ1或H9-RETR處理的來自具有郁積型ATL的患者的細胞的自發性6天增殖測定。一式三份進行測定。

圖19顯示IL-2突變蛋白H9-RET和h9-RETR對CD8+T細胞的影響。(A)H9-RET和H9-RETR抑制IL-2-誘導的CD25在預活化的CD8⁺T細胞上的表達。(B)在存在或缺乏H9-RET或H9-RETR的情況下用IL-2刺激的預活化的人CD8⁺T細胞中的IL2RA mRNA水平(相對于RPL7表達歸一化)。數據代表三個獨立實驗。(C)H9-RETR對IL-2-和IL-15誘導的T細胞增殖的抑制。新鮮分離的CD8⁺T細胞進行CFSE標記并在存在或缺乏1μg/ml H9-RET或H9-RETR的情況下用IL-2或IL-15(1μg/ml)刺激，并評估CFSE稀釋。數據代表三個獨立實驗(A和C)或者自一式三份完成的兩個獨立實驗合并(B)。

圖20顯示IL-2突變蛋白H9-RET和h9-RETR對CD8+T細胞的影響。(A)H9-RET和H9-RETR都抑制新鮮分離的CD8⁺T細胞的TCR誘導的增殖。細胞用CFSE標記，在有或沒有1μg/ml的H9-RET或H9-RETR的情況下用平板結合的抗-CD3(2μg/ml)+可溶性抗CD28(1μg/ml)刺激4天，并且通過流式細胞術評估CFSE稀釋。(B)1μg/ml的H9-RET或H9-RETR抑制用2μg/ml抗CD3+1μg/ml抗-CD28刺激4天的外周血CD8⁺T細胞上的TCR誘導的CD25表達。數據代表三個獨立實驗。

圖21顯示H9-RET和H9-RETR阻斷Th1、Th9和Treg分化，但是促進Th17分化。在缺乏或存在H9-RET或H9-RETR的情況下，在各種T輔助極化條件下分化細胞。數據代表每種類型細胞的至少兩個獨立實驗。

圖22顯示H9-RETR阻斷IL-2誘導的NK細胞活化和細胞毒性。(A)與IL-2不同，H9-RET和H9-RETR(1μg/ml)在孵育24小時后都不刺激原代人NK細胞中的CD69表達，但H9-RETR抑制IL-2(100ng/ml)誘導的CD69表達。實驗進行兩次。(B，C)H9-RET和H9-RETR都不刺激原代人NK細胞中的細胞毒性，而10³ng/mL的H9-RETR抑制HER18(B)和K562(C)靶細胞的IL-2誘導的NK細胞細胞毒性。NK細胞和靶細胞在指定的細胞因子存在下以10∶1的比率孵育4小時。通過⁵¹Cr釋放測定HER18細胞裂解并一式三份進行；通過流式細胞術評估K562細胞的裂解。進行四個獨立實驗。

圖23是用于圖18G中的實驗的方案的示意圖。

詳述

為了使本公開更容易理解，某些術語和短語在下面以及貫穿整個說明書定義。

定義

本文中引用的所有參考文獻通過引用方式整體并入，如同完全闡述一樣。除非另有定義，本文中使用的技術和科學術語具有與本發明所屬領域的普通技術人員通常理解的相同的含義。Singleton等人，Dictionary of Microbiology and Molecular Biology第3版，J.Wiley&Sons(New York，NY 2001)；3月，Advanced Organic Chemistry Reactions，Mechanisms and Structure第5版，J.Wiley&Sons(New York，NY 2001)；以及Sambrook和Russell，Molecular Cloning：A Laboratory Manual第3版，Cold Spring harbor Laboratory Press(Cold Spring Harbor，NY 2001)，為本領域技術人員提供了本公開中使用的許多術語的一般指導。適當時，涉及使用市售試劑盒和試劑的方法通常根據制造商定義的方案和/或參數進行，除非另有說明。

如本文中所用，“IL-2”意指野生型IL-2，無論是天然的還是重組的。成熟的人IL-2作為133個氨基酸的序列(少信號肽，其由另外的20個N端氨基酸組成)發生，如Fujita等人，PNAS USA，80，7437-7441(1983)中描述。人IL-2的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)見于Genbank，在登錄定位符(accession locator)NP_000577.2下。成熟人IL-2的氨基酸序列描述于SEQ ID NO：2中。鼠(小家鼠(Mus musculus))IL-2氨基酸序列見于Genbank，在登錄定位符(SEQ ID NO：3)下。成熟鼠IL-2的氨基酸序列描述于SEQ ID NO：4。

SEQ ID NO：1

MYRMQLLSCIALSLALVTNSAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWTTFCQSIISTLT

SEQ ID NO：2

APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWTTFCQSIISTLT

SEQ ID NO：3

MYSMQLASCVTLTLVLLVNSAPTSSSTSSSTAEAQQQQQQQQQQQQHLEQLLMDLQELLSRMENYRNLKLPRMLTFKFYLPKQATELKDLQCLEDELGPLRHVLDLTQSKSFQLEDAENFISNIRVTVVKLKGSDNTFECQFDDESATVVDFLRRWIAFCQSIISTSPQ

SEQ ID NO：4

APTSSSTSSSTAEAQQQQQQQQQQQQHLEQLLMDLQELLSRMENYRNLKLPRMLTFKFYLPKQATELKDLQCLEDELGPLRHVLDLTQSKSFQLEDAENFISNIRVTVVKLKGSDNTFECQFDDESATVVDFLRRWIAFCQSIISTSPQ

如本文中所用，“IL-2突變蛋白”意指已經對白介素-2蛋白進行特定取代的IL-2多肽。IL-2突變蛋白的特征在于在天然IL-2多肽鏈的其它殘基中或處的一個或多個位點處的氨基酸插入，缺失，取代和修飾。根據本公開，任何此類插入，缺失，取代和修飾導致保留IL-2Rβ結合活性的IL-2突變蛋白。示例性突變蛋白可包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多個氨基酸的取代。

突變蛋白還包括在IL-2的其它位置處的保守修飾和取代(即，對突變蛋白的二級或三級結構具有最小影響的那些)。此類保守取代包括Dayhoff在The Atlas of Protein Sequence and Structure 5(1978)和由Argos于EMBO J.，8：779-785(1989)中描述的那些。例如，屬于下組之一的氨基酸代表保守改變：第I組：ala、pro、gly、gln、asn、ser、thr；組II：cys、ser、tyr、thr；組III：val、ile、leu、met、ala、phe；組IV：lys、arg、his；組V：phe、tyr、trp、his；和VI組：asp、glu。

“根據IL-2編號”意指參照在野生型IL-2的成熟序列中正常發生該氨基酸的位置來鑒定所選擇的氨基酸，例如R81意指存在于SEQ ID NO：2中的第81個氨基酸精氨酸。

術語“具有IL-2Rαβγ受體的細胞類型”意指已知具有這種受體型的細胞，即T細胞，活化的T細胞，B細胞，活化的單核細胞和活化的NK細胞。術語“具有IL-2Rβγ受體的細胞類型”意指已知具有該受體型的細胞，即B細胞，靜息單核細胞和靜息NK細胞。

如本文中所用，關于多肽或DNA序列的術語“同一性”意指兩個分子之間的亞基序列同一性。當兩個分子中的亞基位置被相同的單體亞基(即，相同的氨基酸殘基或核苷酸)占據時，則分子在該位置是相同的。兩個氨基酸或兩個核苷酸序列之間的相似性是相同位置數目的直接函數。一般來說，比對序列，使得獲得最高階匹配。如果必要，那么可以使用發表的技術和廣泛可用的計算機程序，如GCS程序包(Devereux等，Nucleic Acids Res.12：387，1984)，BLASTP，BLASTN，FASTA(Atschul等，J.Molecular Biol.215：403，1990)計算同一性。可以使用序列分析軟件，如威斯康星大學生物技術中心(University of Wisconsin Biotechnology Center)(1710 University Avenue，Madison，Wis.53705)的遺傳學計算機組的序列分析軟件包，以其默認參數測量序列同一性。

術語“多肽”，“蛋白質”或“肽”意指任何氨基酸殘基鏈，不管其長度或翻譯后修飾(例如糖基化或磷酸化)。

在本公開的突變體IL-2多肽是“基本上純的”的情況下，按重量(干重)計，它們可以是至少約60％感興趣的多肽，例如含有突變體IL-2氨基酸序列的多肽。例如，按重量計，多肽可以是至少約75％，約80％，約85％，約90％，約95％或約99％感興趣的多肽。純度可以通過任何適當的標準方法，例如柱色譜，聚丙烯酰胺凝膠電泳或HPLC分析測量。

“激動劑”是與靶物相互作用以引起或促進靶物的活化增加的化合物。

“部分激動劑”是如下的化合物，其與激動劑與相同的靶物相互作用，但是即使通過增加部分激動劑的劑量也不產生與激動劑一樣大的生物化學和/或生理作用的量級。

“超級激動劑(super agonist)”是能夠產生比靶受體的內源性激動劑更大的最大應答，并且因此具有超過100％的功效的一類激動劑。

“拮抗劑”是例如通過阻止，減少，抑制或中和激動劑的活性對抗激動劑的作用的化合物。“拮抗劑”還可以阻止，抑制或降低靶物，例如靶受體的組成性活性，甚至在沒有鑒定的激動劑的情況下。

“可操作地連接”意指感興趣的核苷酸序列(即，編碼IL-2突變蛋白的序列)以允許核苷酸序列表達的方式連接于調節序列(例如，在體外轉錄/翻譯系統中或當將載體引入宿主細胞中時在宿主細胞中)。“調節序列”包括啟動子，增強子和其它表達控制元件(例如多聚腺苷酸化信號)。參見例如Goeddel(1990)于Gene Expression Technology：Methods in Enzymology 185(Academic Press，SanDiego，Calif.)。調節序列包括在許多類型的宿主細胞中指導核苷酸序列的組成性表達的那些，以及僅在某些宿主細胞中指導核苷酸序列表達的那些(例如組織特異性調節序列)。本領域技術人員應當理解，表達載體的設計可以取決于諸如待轉化的宿主細胞的選擇，期望的蛋白質的表達水平等因素。可以將本發明的表達構建體引入宿主細胞中，從而產生本文中公開的人IL-2突變蛋白或產生其生物活性變體。

術語“宿主細胞”和“重組宿主細胞”在本文中可互換使用。應當理解，此類術語不僅指特定的受試細胞，而且指此類細胞的后代或潛在后代。因為某些修飾可能由于突變或環境影響而在后代中發生，所以此類后代實際上可能不與親本細胞相同，但仍然包括在如本文中使用的術語的范圍內。

如本文中所用，術語“轉化”和“轉染”意指用于將外來核酸(例如DNA)引入宿主細胞中的多種本領域公認的技術，包括磷酸鈣或氯化鈣共沉淀，DEAE-葡聚糖介導的轉染，脂轉染、粒子槍或電穿孔。

如本文中所用，術語“藥學可接受載體”包括但不限于與藥物施用相容的鹽水，溶劑，分散介質，涂層材料，抗細菌劑和抗真菌劑，等張劑和吸收延遲劑等。補充的活性化合物(例如抗生素)也可以摻入組合物中。

如本文中所用，術語“癌癥”(或“癌性”)，“過度增殖性”和“贅生性”意指具有自主生長能力的細胞(即以快速增殖細胞生長為特征的異常狀態或狀況)。過度增殖性和贅生性疾病狀態可以分類為病理性(即表征或構成疾病狀態)，或者它們可以分類為非病理性(即，作為偏離正常，但與疾病狀態無關)。該術語意在包括所有類型的癌性生長或致癌過程，轉移組織或惡性轉化的細胞，組織或器官，而不考慮組織病理學類型或侵入性階段。“病理性過度增殖”細胞發生在以惡性腫瘤生長為特征的疾病狀態中。非病理性過度增殖性細胞的實例包括與傷口修復相關的細胞增殖。術語“癌癥”或“腫瘤”用于指各種器官系統的惡性腫瘤，包括影響肺，乳腺，甲狀腺，淋巴腺和淋巴樣組織，胃腸器官和泌尿生殖道的惡性腫瘤，以及腺癌，其通常認為包括惡性腫瘤，如大多數結腸癌，腎細胞癌，前列腺癌和/或睪丸腫瘤，非小細胞肺癌，小腸癌和食管癌。

術語“癌”是本領域公認的，并且意指上皮或內分泌組織的惡性腫瘤，包括呼吸系統癌，胃腸系統癌，泌尿生殖系統癌，睪丸癌，乳腺癌，前列腺癌，內分泌系統癌和黑素瘤。“腺癌”意指源自腺組織或其中腫瘤細胞形成可識別的腺體結構的癌。

如本文中所用，術語“造血贅生性病癥”意指涉及造血起源的增生性/贅生性細胞的疾病，例如源自髓樣，淋巴樣或紅細胞樣譜系或其前體細胞。優選地，疾病源自分化不良的急性白血病(例如，成紅細胞性白血病和急性巨核細胞白血病)。其它示例性髓樣病癥包括但不限于急性早幼粒細胞性白血病(APML)，急性骨髓性白血病(AML)和慢性骨髓性白血病(CML)(綜述于Vaickus，L.(1991)Crit Rev.，Oncol./Hemotol 11：267-97)；淋巴樣惡性腫瘤包括但不限于急性成淋巴細胞白血病(ALL)，包括B譜系ALL和T譜系ALL，慢性淋巴細胞性白血病(CLL)，幼淋巴細胞白血病(PLL)，毛細胞白血病(HLL)和瓦爾登斯特倫(Waldenstrom)巨球蛋白血癥(WM)。惡性淋巴瘤的其它形式包括但不限于非霍奇金(Hodgkin)淋巴瘤及其變體，外周T細胞淋巴瘤，成人T細胞白血病/淋巴瘤(ATL)，皮膚T細胞淋巴瘤(CTCL)，大顆粒淋巴細胞性白血病(LGF)，霍奇金病和Reed Stemberg病。

IL-2突變蛋白

IL-2突變蛋白部分激動劑和拮抗劑

在一個方面中，本文中提供作為部分激動劑和拮抗劑的IL-2突變蛋白。在某些實施方案中，本文中提供了與野生型IL-2(例如，人IL-2，SEQ ID NO：2)相比含有一個或多個降低IL-2突變蛋白對IL-2Rγ_c受體的結合親和力的突變的IL-2突變蛋白。如本文中所用，術語“共同γ_c鏈”、“IL-2Rγ_c”、“Yc”、“IL-2Rγ”、“IL-2受體亞基γ”和“IL-2RG”(Genbank登錄號：NM_000206和NP_000197(人)和NM_013563和NP_038591(小鼠))均指I型細胞因子受體家族的成員，其是針對至少6種不同白介素受體的受體復合物的細胞因子受體亞基，包括但不限于IL-2、IL-4、IL-7、IL-9、IL-15和IL-21受體。IL-2Rγ_c與IL-2Rβ相互作用，以主要在記憶T細胞和天然殺傷(NK)細胞上形成中間親和力IL-2受體，并與IL-2Rα和IL-2Rβ相互作用，以在活化的T細胞和調節性T細胞(Treg)上形成高親和力IL-2受體。不受任何特定運行理論束縛，認為此類突變蛋白可以通過在結合IL-2Rβ+/IL-2Rγ_c+細胞(例如靜息T細胞和天然殺傷(NK)細胞)上的IL-2Rβ時減弱或抑制IL-2β/IL-2γ_c異二聚化和信號傳導而用作IL-2部分激動劑或拮抗劑的功能。

示例性的主題IL-2突變蛋白在至少約50％、至少約65％、至少約70％、至少約80％、至少約85％、至少約87％、至少約90％、至少約91％、至少約92％、至少約93％、至少約94％、至少約95％、至少約96％、至少約97％、至少約98％約99％與野生型IL-2相同。突變可以由氨基酸殘基的數量或含量的變化組成。例如，突變體IL-2可以具有比野生型IL-2更大或更小數目的氨基酸殘基。或者或另外，示例性突變體多肽可以含有存在于野生型IL-2中的一個或多個氨基酸殘基的取代。在多個實施方案中，突變體IL-2多肽可以通過單個氨基酸殘基的添加，缺失或取代而不同于野生型IL-2。

作為說明，包括與參考氨基酸序列SEQ ID NO：2至少95％相同的氨基酸序列的IL-2突變蛋白是除了包括SEQ ID NO：2的參考氨基酸序列的多至5個改變外包含與參考序列相同的序列的多肽。例如，參考序列中高達5％的氨基酸殘基可以缺失或用另一個氨基酸取代，或可以將參考序列中總氨基酸殘基的高達5％的氨基酸數目插入參考序列中。參考序列的這些改變可發生在參考氨基酸序列的氨基(N--)或羧基(C--)末端位置或在那些末端位置之間的任何位置，在參考序列的殘基之間個別或在參考序列內的一個或多個連續組中散布。

在某些實施方案中，IL-2突變蛋白以比野生型IL-2小至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的親和力結合IL-2Rγ_c。IL-2突變蛋白的結合親和力也可以表示為比野生型IL-2低1.2、1.4、1.5、2、5、10、15、20、25、50、100、200、250或更多倍的對IL-2γ_c的親和力。可以使用本領域已知的任何合適的方法測量主題IL-2突變蛋白對IL-2γ_c的結合親和力。用于測量IL-2Rγ_c結合的合適方法包括但不限于放射性配體結合測定(例如飽和結合，斯卡恰特(scatchard)圖，非線性曲線擬合程序和競爭結合測定)；非放射性配體結合測定(例如，熒光偏振(FP)，熒光共振能量轉移(FRET)和表面等離子體共振測定(參見例如Drescher等人，Methods Mol Biol 493：323-343(2009))；液相配體結合測定(例如實時聚合酶鏈式反應(RT-qPCR)和免疫沉淀)；和固相配體結合測定(例如多孔板測定，珠上配體結合測定，柱上配體結合測定，和濾器測定)。

在某些實施方案中，相對于野生型IL-2，IL-2突變蛋白破壞IL-2Rβ與IL-2Rγ_c的締合，使得該IL-2Rβ/IL-2Rγ_c相互作用減少約2％，約5％、約10％、約15％、約20％、約50％、約75％、約90％、約95％或更多。

在一些實施方案中，降低IL-2突變蛋白對IL-2Rγ_c受體的結合親和力的一個或多個突變是氨基酸取代。在一些實施方案中，與野生型IL-2(SEQ ID NO：2)相比，主題IL-2突變蛋白由1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15個氨基酸取代組成。取代的氨基酸殘基可以是但不一定是保守取代，其通常包括下組內的取代：甘氨酸、丙氨酸；纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸；天冬氨酸、谷氨酸；天冬酰胺、谷氨酰胺；絲氨酸、蘇氨酸；賴氨酸；精氨酸；和苯丙氨酸、酪氨酸。在具體的實施方案中，取代位于接觸IL-2Rγ_c結合界面的IL-2的氨基酸殘基處。

在某些實施方案中，氨基酸取代是選自根據野生型hIL-2(例如，SEQ ID NO：2)編號的位置：18、22、126和/或130的野生型IL-2的一個或多個氨基酸位置處的取代。在某些實施方案中，降低IL-2Rγ_c受體結合親和力的氨基酸取代包括氨基酸取代L18R、Q22E、A126T和/或S130R或其組合。

在一些實施方案中，降低IL-2Rγ_c受體結合親和力的氨基酸取代包括Q126T。在其它實施方案中，降低IL-2Rγ_c受體結合親和力的氨基酸取代包括L18R和Q22E。在一些實施方案中，降低IL-2Rγ_c受體結合親和力的氨基酸取代包括L18R，Q22E和Q126T。在其它實施方案中，降低IL-2Rγ_c受體結合親和力的氨基酸取代包括L18R，Q22E，Q126T和S130R。

在一些實施方案中，對IL-2Rβ受體具有降低的結合親和力的IL-2突變蛋白還包括1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個或更多個增加IL-2Rβ結合親和力的突變。如本文中所用，術語“IL-2Rβ”和“CD122”(Genbank登錄號NM_000878和NP_000869(人))均指I型細胞因子受體家族的成員，其與IL-2Rγ_c相互作用以主要在記憶T細胞和天然殺傷(NK)細胞上形成中間親和力IL-2受體，并與IL-2Rα和IL-2Rγ_c相互作用，以在活化的T細胞和調節T細胞(Treg)上形成高親和力IL-2受體。不受任何具體的運行理論束縛，認為具有對IL-2Rβ的強結合親和力和對IL-2Rγ_c的弱結合親和力的此類IL-2突變蛋白充當顯性陰性支架以產生“受體信號傳導夾”以阻斷內源信號傳導。此類IL-2突變蛋白將減弱IL-2Rβ-γ_c異二聚化，并且代表一類新型基于機制的IL-2部分激動劑和非信號傳導(中性)分子，其通過阻斷內源性細胞因子并且不自身施加作用在功能上起拮抗劑作用(參見圖1中的示意圖)。

在某些實施方案中，相對于野生型IL-2(例如，SEQ ID NO：2)，主題IL-2突變蛋白包括至少一個突變(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多個氨基酸殘基的缺失、添加或取代)，并且以比野生型IL-2更高的親和力結合IL-2Rβ。

在某些實施方案中，IL-2突變蛋白以比野生型IL-2大至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的親和力結合IL-2Rβ。IL-2突變蛋白的結合親和力也可以表示為比野生型IL-2大1.2、1.4、1.5、2、5、10、15、20、25、50、100、200、250或更多倍的對IL-2Rβ的親和力。可以通過本領域技術人員已知的任何合適的方法評估主題IL-2突變蛋白與IL-2Rβ的結合，包括但不限于上述方法。

在一些實施方案中，增加IL-2Rβ結合親和力的至少一個突變是氨基酸取代。在一些實施方案中，增加IL-2Rβ結合親和力的氨基酸取代包括在根據野生型hIL-2(SEQ ID NO：2)編號的氨基酸位置I24、P65、Q74、L80、R81、L85、I86、I89、I92、和/或V93處的取代：在某些實施方案中，取代包括I24V、P65H、Q74R、Q74H、Q74N、Q74S、L80F、L80V、R81I、R81T、R81D、L85V、I86V、I89V、I92F、和/或V93I或其組合。在某些實施方案中，取代包括Q74N、Q74H、Q74S、L80F、L80V、R81D、R81T、L85V、I86V、I89V、和/或I93V或其組合。

在一些實施方案中，增加IL-2Rβ結合親和力的氨基酸取代包括：L80F、R81D、L85V、I86V和I92F。在一些實施方案中，增加IL-2Rβ結合親和力的氨基酸取代包括：Q74N、L80F、R81D、L85V、I86V、I89V、和I92F。在一些實施方案中，增加IL-2Rβ結合親和力的氨基酸取代包括：Q74N、L80V、R81T、L85V、I86V和I92F。在一些實施方案中，增加IL-2Rβ結合親和力的氨基酸取代包括：Q74H、L80F、R81D、L85V、I86V和I92F。在一些實施方案中，增加IL-2Rβ結合親和力的氨基酸取代包括：Q74S、L80F、R81D、L85V、I86V和I92F。在某些實施方案中，增加IL-2Rβ結合親和力的氨基酸取代包括：Q74N、L80F、R81D、L85V、I86V和I92F。在一些實施方案中，增加IL-2Rβ結合親和力的氨基酸取代包括：Q74S、R81T、L85V和I92F。

在某些實施方案中，與野生型人IL-2相比，對IL-2Rβ具有更大結合親和力和對IL-2Rγ_c受體具有降低的結合親和力的主題IL-2突變蛋白包括氨基酸取代L80F、R81D、L85V、I86V、I92F和Q126T。在某些實施方案中，IL-2突變蛋白具有氨基酸序列：

APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHFDPRDVVSNINVFVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCTSIISTLT(SEQ ID NO：5)。

在多個實施方案中，與野生型人IL-2相比，對IL-2Rβ具有更大結合親和力和對IL-2Rγ_c受體具有降低的結合親和力的主題IL-2突變蛋白包括氨基酸取代L18R、Q22E、L80F、R81D、L85V、I86V和I92F。在某些實施方案中，IL-2突變蛋白具有氨基酸序列：

APTSSSTKKTQLQLEHLRLDLEMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHFDPRDVVSNINVFVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT(SEQ ID NO：6)。

在示例性實施方案中，與野生型人IL-2相比，對IL-2Rβ具有更大的結合親和力和對IL-2Rγ_c受體具有降低的結合親和力的主題IL-2突變蛋白包括氨基酸取代L18R、Q22E、L80F、R81D、L85V、I86V、I92F和Q126T。在某些實施方案中，IL-2突變蛋白具有氨基酸序列：

APTSSSTKKTQLQLEHLRLDLEMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHFDPRDVVSNINVFVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCTSIISTLT(SEQ ID NO：7)。

在一些實施方案中，與野生型人IL-2相比，對IL-2Rβ具有更大的結合親和力和對IL-2Rγ_c受體具有降低的結合親和力的主題IL-2突變蛋白包括氨基酸取代L18R、Q22E、L80F、R81D、L85V、I86V、I92F、Q126T和S130R。在某些實施方案中，IL-2突變蛋白具有氨基酸序列：

APTSSSTKKTQLQLEHLRLDLEMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHFDPRDVVSNINVFVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCTSIIRTLT(SEQ ID NO：8)。

在某些實施方案中，與野生型人IL-2相比，對IL-2Rβ具有更大的結合親和力和對IL-2Rγ_c受體具有降低的結合親和力的主題IL-2突變蛋白包括氨基酸取代Q74N、L80F、R81D、L85V、I86V、I89V、I92F和Q126T。在某些實施方案中，IL-2突變蛋白具有氨基酸序列：

APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLANSKNFHFDPRDVVSNVNVFVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCTSIISTLT(SEQ ID NO：9)。

在多個實施方案中，與野生型人IL-2相比，對IL-2Rβ具有更大結合親和力和對IL-2Rγ_c受體具有降低的結合親和力的主題IL-2突變蛋白包括氨基酸取代L18R、Q22E、Q74N、L80F、R81D、L85V、I86V、I89V和I92F。在某些實施方案中，IL-2突變蛋白具有氨基酸序列：

APTSSSTKKTQLQLEHLRLDLEMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLANSKNFHFDPRDVVSNVNVFVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT(SEQ ID NO：10)。

在一個示例性實施方案中，與野生型人IL-2相比，對IL-2Rβ具有更大的結合親和力和對IL-2Rγ_c受體具有降低的結合親和力的主題IL-2突變蛋白包括氨基酸取代L18R、Q22E、Q74N、L80F、R81D、L85V、I86V、I89V、I92F和Q126T。在某些實施方案中，IL-2突變蛋白具有氨基酸序列：

APTSSSTKKTQLQLEHLRLDLEMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLANSKNFHFDPRDVVSNVNVFVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCTSIISTLT(SEQ ID NO：11)。

在一些實施方案中，與野生型人IL-2相比，對IL-2Rβ具有更大的結合親和力和對IL-2Rγ_c受體具有降低的結合親和力的主題IL-2突變蛋白包括氨基酸取代L18R、Q22E、Q74N、L80F、R81D、L85V、I86V、I89V、I92F、Q126T、和S130R。在某些實施方案中、IL-2突變蛋白具有氨基酸序列：

APTSSSTKKTQLQLEHLRLDLEMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLANSKNFHFDPRDVVSNVNVFVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCTSIIRTLT(SEQ ID NO：12)。

在某些實施方案中，與野生型人IL-2相比，對IL-2Rβ具有更大的結合親和力和對IL-2Rγ_c受體具有降低的結合親和力的主題IL-2突變蛋白包括氨基酸取代Q74N、L80V、R81T、L85V、I86V、I92F和Q126T。在某些實施方案中、IL-2突變蛋白具有氨基酸序列：

APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLANSKNFHVTPRDVVSNINVFVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCTSIISTLT(SEQ ID NO：13)。

在多個實施方案中，與野生型人IL-2相比，對IL-2Rβ具有更大的結合親和力和對IL-2Rγ_c受體具有降低的結合親和力的主題IL-2突變蛋白包括氨基酸取代L18R、Q22E、Q74N，L80V、R81T、L85V、I86V和I92F。在某些實施方案中，IL-2突變蛋白具有氨基酸序列：

APTSSSTKKTQLQLEHLRLDLEMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLANSKNFHVTPRDVVSNINVFVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT(SEQ ID NO：14)。

在多個實施方案中，與野生型人IL-2相比，對IL-2Rβ具有更大的結合親和力和對IL-2Rγ_c受體具有降低的結合親和力的主題IL-2突變蛋白包括氨基酸取代L18R、Q22E、Q74N，L80V、R81T、L85V、I86V、I92F、和Q126T。在某些實施方案中，IL-2突變蛋白具有氨基酸序列：

APTSSSTKKTQLQLEHLRLDLEMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLANSKNFHVTPRDVVSNINVFVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCTSIISTLT(SEQ ID NO：15)。

在一些實施方案中，與野生型人IL-2相比，對IL-2Rβ具有更大的結合親和力和對IL-2Rγ_c受體具有降低的結合親和力的主題IL-2突變蛋白包括氨基酸取代L18R、Q22E、Q74N，L80V、R81T、L85V、I86V、I92F、Q126T、和S130R。在某些實施方案中，IL-2突變蛋白具有氨基酸序列：

APTSSSTKKTQLQLEHLRLDLEMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLANSKNFHVTPRDVVSNINVFVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCTSIIRTLT(SEQ ID NO：16)。

在某些實施方案中，與野生型人IL-2相比，對IL-2Rβ具有更大的結合親和力和對IL-2Rγ_c受體具有降低的結合親和力的主題IL-2突變蛋白包括氨基酸取代Q74H、L80F、R81D、L85V、I86V、I92F和Q126T。在某些實施方案中，IL-2突變蛋白具有氨基酸序列：

APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAHSKNFHFDPRDVVSNINVFVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCTSIISTLT(SEQ ID NO：17)。

在多個實施方案中，與野生型人IL-2相比，對IL-2Rβ具有更大的結合親和力和對IL-2Rγ_c受體具有降低的結合親和力的主題IL-2突變蛋白包括氨基酸取代L18R、Q22E、Q74H、L80F、R81D、L85V、I86V和I92F。在某些實施方案中，IL-2突變蛋白具有氨基酸序列：

APTSSSTKKTQLQLEHLRLDLEMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAHSKNFHFDPRDVVSNINVFVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT(SEQ ID NO：18)。

在一個示例性的實施方案中，與野生型人IL-2相比，對IL-2Rβ具有更大的結合親和力和對IL-2Rγ_c受體具有降低的結合親和力的主題IL-2突變蛋白包括氨基酸取代L18R、Q22E、Q74H、L80F、R81D、L85V、I86V、I92F、和Q126T。在某些實施方案中，IL-2突變蛋白具有氨基酸序列：

APTSSSTKKTQLQLEHLRLDLEMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAHSKNFHFDPRDVVSNINVFVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCTSIISTLT(SEQ ID NO：19)。

在一些實施方案中，與野生型人IL-2相比，對IL-2Rβ具有更大的結合親和力和對IL-2Rγ_c受體具有降低的結合親和力的主題IL-2突變蛋白包括氨基酸取代L18R、Q22E、Q74H、L80F、R81D、L85V、I86V、I92F、Q126T、和S130R。在某些實施方案中，IL-2突變蛋白具有氨基酸序列：

APTSSSTKKTQLQLEHLRLDLEMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAHSKNFHFDPRDVVSNINVFVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCTSIIRTLT(SEQ ID NO：20)。

在某些實施方案中，與野生型人IL-2相比，對IL-2Rβ具有更大的結合親和力和對IL-2Rγ_c受體具有降低的結合親和力的主題IL-2突變蛋白包括氨基酸取代Q74S、L80F、R81D、L85V、I86V、I92F和Q126T。在某些實施方案中，IL-2突變蛋白具有氨基酸序列：

APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLASSKNFHFDPRDVVSNINVFVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCTSIISTLT(SEQ ID NO：21)。

在一些實施方案中，與野生型人IL-2相比，對IL-2Rβ具有更大的結合親和力和對IL-2Rγ_c受體具有降低的結合親和力的主題IL-2突變蛋白包括氨基酸取代L18R、Q22E、Q74S、L80F、R81D、L85V、I86V和I92F。在某些實施方案中，IL-2突變蛋白具有氨基酸序列：

APTSSSTKKTQLQLEHLRLDLEMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLASSKNFHFDPRDVVSNINVFVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT(SEQ ID NO：22)。

在多個實施方案中，與野生型人IL-2相比，對IL-2Rβ具有更大的結合親和力和對IL-2Rγ_c受體具有降低的結合親和力的主題IL-2突變蛋白包括氨基酸取代L18R、Q22E、Q74S、L80F、R81D、L85V、I86V、I92F、和Q126T。在某些實施方案中，IL-2突變蛋白具有氨基酸序列：

APTSSSTKKTQLQLEHLRLDLEMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLASSKNFHFDPRDVVSNINVFVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCTSIISTLT(SEQ ID NO：23)。

在一些實施方案中，與野生型人IL-2相比，對IL-2Rβ具有更大的結合親和力和對IL-2Rγ_c受體具有降低的結合親和力的主題IL-2突變蛋白包括氨基酸取代L18R、Q22E、Q74S、L80F、R81D、L85V、I86V、I92F、Q126T、和S130R。在某些實施方案中，IL-2突變蛋白具有氨基酸序列：

APTSSSTKKTQLQLEHLRLDLEMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLASSKNFHFDPRDVVSNINVFVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCTSIIRTLT(SEQ ID NO：24)。

在某些實施方案中，與野生型人IL-2相比，對IL-2Rβ具有更大的結合親和力和對IL-2Rγ_c受體具有降低的結合親和力的主題IL-2突變蛋白包括氨基酸取代Q74N、L80F、R81D、L85V、I86V、I92F和Q126T。在某些實施方案中，IL-2突變蛋白具有氨基酸序列：

APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLANSKNFHFDPRDVVSNINVFVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCTSIISTLT(SEQ ID NO：25)。

在一些實施方案中，與野生型人IL-2相比，對IL-2Rβ具有更大的結合親和力和對IL-2Rγ_c受體具有降低的結合親和力的主題IL-2突變蛋白包括氨基酸取代L18R、Q22E、Q74N、L80F、R81D、L85V、I86V和I92F。在某些實施方案中，IL-2突變蛋白具有氨基酸序列：

APTSSSTKKTQLQLEHLRLDLEMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLANSKNFHFDPRDVVSNINVFVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT(SEQ ID NO：26)。

在多個實施方案中，與野生型人IL-2相比，對IL-2Rβ具有更大的結合親和力和對IL-2Rγ_c受體具有降低的結合親和力的主題IL-2突變蛋白包括氨基酸取代L18R、Q22E、Q74N、L80F、R81D、L85V、I86V、I92F、和Q126T。在某些實施方案中，IL-2突變蛋白具有氨基酸序列：

APTSSSTKKTQLQLEHLRLDLEMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLANSKNFHFDPRDVVSNINVFVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCTSIISTLT(SEQ ID NO：27)。

在一些實施方案中，與野生型人IL-2相比，對IL-2Rβ具有更大的結合親和力和對IL-2Rγ_c受體具有降低的結合親和力的主題IL-2突變蛋白包括氨基酸取代L18R、Q22E、Q74N、L80F、R81D、L85V、I86V、I92F、Q126T、和S130R。在某些實施方案中，IL-2突變蛋白具有氨基酸序列：

APTSSSTKKTQLQLEHLRLDLEMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLANSKNFHFDPRDVVSNINVFVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCTSIIRTLT(SEQ ID NO：28)。

在某些實施方案中，與野生型人IL-2相比，對IL-2Rβ具有更大的結合親和力和對IL-2Rγ_c受體具有降低的結合親和力的主題IL-2突變蛋白包括氨基酸取代Q74S、R81T、L85V、I92F和Q126T。在某些實施方案中，IL-2突變蛋白具有氨基酸序列：

APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLASSKNFHLTPRDVISNINVFVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCTSIISTLT(SEQ ID NO：29)。

在一些實施方案中，與野生型人IL-2相比，對IL-2Rβ具有更大的結合親和力和對IL-2Rγ_c受體具有降低的結合親和力的主題IL-2突變蛋白包括氨基酸取代L18R、Q22E、Q74S、R81T、L85V、和I92F。在某些實施方案中，IL-2突變蛋白具有氨基酸序列：

APTSSSTKKTQLQLEHLRLDLEMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLASSKNFHLTPRDVISNINVFVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT(SEQ ID NO：30)。

在某些實施方案中，與野生型人IL-2相比，對IL-2Rβ具有更大的結合親和力和對IL-2Rγ_c受體具有降低的結合親和力的主題IL-2突變蛋白包括氨基酸取代L18R、Q22S、Q74H、R81T、L85V、I92F、和Q126T。在某些實施方案中，IL-2突變蛋白具有氨基酸序列：

APTSSSTKKTQLQLEHLRLDLEMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLASSKNFHLTPRDVISNINVFVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCTSIISTLT(SEQ ID NO：31)。

在一些實施方案中，與野生型人IL-2相比，對IL-2Rβ具有更大的結合親和力和對IL-2Rγ_c受體具有降低的結合親和力的主題IL-2突變蛋白包括氨基酸取代L18R、Q22S、Q74H、R81T、L85V、I92F、Q126T、和S130R。在某些實施方案中，IL-2突變蛋白具有氨基酸序列：

APTSSSTKKTQLQLEHLRLDLEMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLASSKNFHLTPRDVISNINVFVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCTSIIRTLT(SEQ ID NO：32)。

在多個實施方案中，主題IL-2突變蛋白具有根據下式的氨基酸序列：

A-P-T-S-S-S-T-K-K-T-Q-L-Q-L-E-H-L-(X¹)_n-L-D-L-(X²)_n--M-(X³)_n--L-N-G-I-N-N-Y-K-N-P-K-L-T-R-M-L-T-F-K-F-Y-M-P-K-K-A-T-E-L-K-H-L-Q-C-L-E-E-E-L-K-(X⁴)_n-^-L-E-E-V-L-N-L-A-(X⁵)_n-^-S-K-N-F-H-(X⁶)_n-(X⁷)_n--P-R-D-(X⁸)_n--(X⁹)_n--S-N-(X¹⁰)_n--N-V-(X¹¹)_n--(X¹²)_n--L-E-L-K-G-S-E-T-T-F-M-C-E-Y-A-D-E-T-A-T-I-V-E-F-L-N-RW-I-T-F-C-(X¹³)_n--S-I-I-(X¹⁴)_n--T-L-T，其中：

每個n單獨選自0或1；

X¹是L(野生型)或R；

X²是Q(野生型)或E；

X³是I(野生型)或V；

X⁴是P(野生型)或H；

X⁵是Q(野生型)，R，H，N或S；

X⁶是L(野生型)，F或V；

X⁷是R(野生型)，I，T或D；

X⁸是L(野生型)或V；

X⁹是I(野生型)或V；

X¹⁰是I(野生型)或V；

X¹¹是I(野生型)或F；

X¹²是V(野生型)或I；

X¹³是A(野生型)或T；并且

X¹⁴是S(野生型)或R。(SEQ ID NO：50)。

在根據SEQ ID NO：50的IL-2突變蛋白的某些實施方案中，至少在X¹、X²、X³、X⁴、X⁵、X⁶、X⁷、X⁸、X⁹、X¹⁰、X¹¹、X¹²、X¹³或X¹⁴之一處的氨基酸不是野生型氨基酸。在一些實施方案中，至少在X¹、X²、X³、X⁴、X⁵、X⁶、X⁷、X⁸、X⁹、X¹⁰、X¹¹、X¹²、X¹³或X¹⁴的2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、或14處的氨基酸不是野生型氨基酸。在一些實施方案中，IL-2突變蛋白與SEQ ID NO：50的IL-2突變蛋白具有至少約95％、至少約96％、至少約97％、至少約98％、至少約99％或約100％同源性。

在一些實施方案中，作為部分激動劑的主題IL-2突變蛋白與野生型IL-2相比具有一種或多種降低的功能。

在某些實施方案中，IL-2突變蛋白具有降低的刺激依賴于IL-2Rβ/IL-2Rγ_c異二聚化的一種或多種信號傳導途徑的能力。在一些實施方案中，與野生型hIL-2相比，主題IL-2突變蛋白具有降低的刺激IL-2Rβ+細胞中的STAT5磷酸化的能力。在一些實施方案中，IL-2突變蛋白以野生型IL-2刺激相同細胞中的STAT5磷酸化的水平的1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更小的水平刺激IL-2Rβ+細胞中的STAT5磷酸化。在一些實施方案中，IL-2Rβ+細胞是T細胞。在具體實施方案中，T細胞是CD8+T細胞。在一些實施方案中，CD8+T細胞是新鮮分離的CD8+T細胞。在其它實施方案中，CD8+T細胞T細胞是活化的CD8+T細胞。在其它實施方案中，IL-2Rβ+細胞是天然殺傷(NK)細胞。

在一些實施方案中，與野生型hIL-2相比，突變蛋白具有降低的刺激IL-2Rβ+細胞中的ERK1/ERK2信號傳導的能力。在一些實施方案中，IL-2突變蛋白以野生型IL-2刺激相同細胞中的pERK1/ERK2信號傳導的水平的1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更小的水平刺激IL-2Rβ+細胞中的pERK1/ERK2信號傳導。在一些實施方案中，IL-2Rβ+細胞是T細胞。在具體的實施方案中，所述T細胞是CD8+T細胞。在一些實施方案中，CD8+T細胞是新鮮分離的CD8+T細胞。在其它實施方案中，CD8+T細胞T細胞是活化的CD8+T細胞。在其它實施方案中，IL-2Rβ+細胞是天然殺傷(NK)細胞。

可以使用本領域已知的任何合適的方法，例如通過STAT5和ERK1/2的磷酸化來測量STAT5和ERK1/2信號傳導。例如，可以使用對這些分子的磷酸化形式特異的抗體結合如本文中所述的流式細胞術分析來測量STAT5和ERK1/2磷酸化。

在一些實施方案中，與野生型hIL-2相比，突變蛋白具有降低的刺激IL-2Rβ+細胞中的PI 3激酶信號傳導的能力。在一些實施方案中，IL-2突變蛋白以野生型IL-2刺激相同細胞中的PI 3激酶信號傳導的水平的1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更小的水平刺激IL-2Rβ+細胞中的PI 3激酶信號傳導。在一些實施方案中，IL-2Rβ+細胞是T細胞。在具體實施方案中，T細胞是CD8+T細胞。在一些實施方案中，CD8+T細胞T細胞是活化的CD8+T細胞。在其它實施方案中，IL-2Rβ+細胞是天然殺傷(NK)細胞。

PI 3-激酶信號傳導可以使用本領域已知的任何合適的方法來測量。例如，可以使用對磷酸-S6核糖體蛋白特異性的抗體結合如本文中所述的流式細胞術分析來測量PI 3-激酶信號傳導。

在某些實施方案中，與野生型IL-2相比，突變蛋白具有降低的誘導淋巴細胞增殖的能力。在一些實施方案中，淋巴細胞是T細胞。在具體實施方案中，淋巴細胞是原代CD8+T細胞。在其它實施方案中，淋巴細胞是活化的CD8+T細胞。可以使用本領域已知的任何合適的方法測量細胞增殖。例如，可以使用羧基熒光素二乙酸琥珀酰亞胺二酯(CFSE)稀釋測定或通過[³H]-胸苷摻入來測量淋巴細胞增殖，如本文中所述。在一些實施方案中，IL-2突變蛋白以野生型IL-2誘導淋巴細胞增殖的水平的1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更小的水平誘導淋巴細胞增殖。

在一些實施方案中，與野生型IL-2相比，IL-2突變蛋白具有降低的活化淋巴細胞中的IL-2Rα表達的能力。在一些實施方案中，IL-2突變蛋白以野生型IL-2活化相同細胞中的IL-2Rα表達的水平的1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更小的水平活化淋巴細胞中的IL-2Rα表達。在一些實施方案中，淋巴細胞是CD8+T細胞。在一些實施方案中，CD8+T細胞是新鮮分離的CD8+T細胞。在其它實施方案中，CD8+T細胞是活化的CD8+T細胞。

不受任何特定運行理論束縛，認為展現出增強的IL-2Rβ結合和降低的IL-2Rγ_c的IL-2突變蛋白可以作為顯性陰性IL-2拮抗劑用作功能并且干擾一種或多種IL-2依賴性功能。此類拮抗劑通過干擾IL-2與IL-2Rβ的結合而用作功能，同時也抑制IL-2Rβ/IL-2Rγ_c異二聚化。此外，由于IL-15信號傳導通過IL-2Rβ/IL-2Rγ_c受體結合用作功能，認為此類IL-2突變蛋白也可以用作IL-15拮抗劑的功能。在某些實施方案中，IL-2突變蛋白抑制一種或多種IL-2和/或IL-15功能。

在一些實施方案中，抑制一種或多種IL-2和/或IL-15功能的IL-2突變蛋白包括在根據野生型hIL-2編號的氨基酸位置18、22和126處的氨基酸取代。在一些實施方案中，IL-2突變蛋白的氨基酸取代包括根據野生型hIL-2編號的L18R、Q22E和Q126T。

在一些實施方案中，抑制一種或多種IL-2和/或IL-15功能的IL-2突變蛋白包括在根據野生型hIL-2編號的氨基酸位置18、22、126和130處的氨基酸取代。在一些實施方案中，IL-2突變蛋白的氨基酸取代包括根據野生型hIL-2編號的L18R、Q22E、Q126T和S130R。

在某些實施方案中，突變蛋白是CD8+T細胞中IL-2和/或IL-15STAT5磷酸化的抑制劑。在一些實施方案中，突變蛋白是IL-2和/或IL-15誘導的CD8+T細胞增殖的抑制劑。在一些實施方案中，突變蛋白是IL-2依賴性的TCR誘導的細胞增殖的抑制劑。

IL-2促進Th1、Th9和Treg T細胞分化并抑制Th17分化。因此，不受任何特定運行理論束縛，認為用作IL-2拮抗劑功能的IL-2突變蛋白能夠抑制Th1、Th9和/或Treg細胞分化或促進Th17細胞分化。在一些實施方案中，IL-2突變蛋白是IL-2依賴性Th1、Th9和/或Treg分化的抑制劑。在某些實施方案中，突變蛋白是Th17分化的促進劑。

在某些實施方案中，突變蛋白是天然殺傷(NK)細胞的IL-2依賴性活化的抑制劑。可以通過本領域已知的任何合適的方法測量NK細胞的IL-2活化，例如通過測量IL-2誘導的CD69表達和/或細胞毒性，如本文所述。

IL-2突變蛋白的重組表達、表達載體和宿主細胞

在多個實施方案中，用于本發明實踐中的多肽是合成的，或通過重組核酸分子的表達產生。在多肽是嵌合體(例如，至少含有突變體IL-2多肽和異源多肽的融合蛋白)的情況下，其可以由雜合核酸分子編碼，所述雜合核酸分子含有編碼突變體IL-2的全部或部分的一個序列和編碼異源多肽的全部或部分的第二序列。例如，本文中所述的主題IL-2突變蛋白可以與六組氨酸標簽融合以促進細菌表達的蛋白質的純化，或與血凝素標簽融合，以促進在真核細胞中表達的蛋白質的純化。

用于構建編碼IL-2突變蛋白的DNA序列并在適當轉化的宿主中表達那些序列的方法包括但不限于使用PCR輔助的誘變技術。也可以用標準重組技術制備由對IL-2多肽缺失或添加氨基酸殘基組成的突變。在缺失或添加的情況下，編碼IL-2的核酸分子任選地用合適的限制性內切核酸酶消化。所得的片段可以直接表達或通過例如將其連接到第二片段進一步操作。如果核酸分子的兩個末端包含彼此重疊的互補核苷酸，則可以促進連接，但是也可以連接平末端片段。PCR產生的核酸也可用于產生各種突變體序列。

完整的氨基酸序列可用于構建反向翻譯的基因。可以合成含有編碼IL-2突變蛋白的核苷酸序列的DNA寡聚物。例如，可以合成編碼期望的多肽的部分的幾個小寡核苷酸，然后連接。單個寡核苷酸通常含有用于互補組裝的5’或3’突出端。

除了通過表達已經通過重組分子生物學技術改變的核酸分子產生突變多肽外，可以化學合成主題IL-2突變蛋白。化學合成的多肽由本領域技術人員常規產生。

一旦組裝(通過合成，定點誘變或另一種方法)，會將編碼IL-2突變蛋白的DNA序列插入表達載體中，并且可操作地連接到適于在期望的轉化宿主中表達IL-2突變蛋白的表達控制序列。可以通過核苷酸測序，限制性作圖和在合適的宿主中表達生物活性多肽確認正確的裝配。如本領域中公知，為了在宿主中獲得轉染基因的高表達水平，基因必須可操作地連接到在所選的表達宿主中有功能的轉錄和翻譯表達控制序列。

編碼IL-2突變蛋白的DNA序列(無論是通過定點誘變，化學合成或其它方法制備)還可以包括編碼信號序列的DNA序列。如果存在的話，此類信號序列應當是被選擇用于IL-2突變蛋白表達的細胞識別的信號序列。它可以是原核的，真核的或兩者的組合。它也可以是天然IL-2的信號序列。信號序列的包含取決于是否期望從制備它的重組細胞分泌IL-2突變蛋白。如果選擇的細胞是原核的，那么通常優選DNA序列不編碼信號序列。如果選擇的細胞是真核的，那么通常優選編碼信號序列，最優選使用野生型IL-2信號序列。

IL-2突變蛋白融合蛋白

如上所述，示例性主題IL-2突變蛋白可以制備為包括主題IL-2突變蛋白和異源多肽(即，多肽，其不是IL-2的多肽或其突變體)的融合或嵌合多肽(參見例如美國專利號6,451,308)。示例性異源多肽可以增加嵌合多肽在體內的循環半衰期，并且因此可以進一步增強突變體IL-2多肽的性質。在多個實施方案中，增加循環半衰期的多肽可以是血清白蛋白，例如人血清白蛋白，或缺少IgG重鏈可變區的抗體的IgG亞類的Fc區的。示例性的Fc區可以包括抑制補體固定和Fc受體結合的突變，或者它可以是裂解的，即能夠結合補體或通過另一種機制，如抗體依賴性補體裂解(ADCC；USSN 08/355,502 1994年12月12日提交)裂解細胞。

“Fc區”可以是與通過用木瓜蛋白酶消化IgG產生的IgG C末端結構域同源的天然存在的或合成的多肽。IgG Fc具有約50kDa的分子量。突變體IL-2多肽可以包括整個Fc區，或保留延長其作為其中一部分的嵌合多肽的循環半衰期的能力的較小部分。此外，全長或片段化Fc區可以是野生型分子的變體。也就是說，它們可以含有可以影響或可以不影響多肽功能的突變；如下文進一步描述的，在所有情況下天然活性不是必需的或期望的。在某些實施方案中，IL-2突變蛋白融合蛋白(例如，如本文中所述的IL-2部分激動劑或拮抗劑)包括IgG1、IgG2、IgG3或IgG4Fc區。

Fc區可以是“裂解性”或“非裂解性”，但通常是非裂解性的。非裂解性Fc區通常缺少高親和力Fc受體結合位點和C′1q結合位點。鼠IgG Fc的高親和力Fc受體結合位點包括IgG Fc的位置235處的Leu殘基。因此，可以通過突變或缺失Leu 235來破壞Fc受體結合位點。例如，Glu取代Leu 235抑制Fc區結合高親和力Fc受體的能力。通過突變或缺失IgG的Glu 318、Lys 320和Lys 322殘基，可以功能性破壞鼠C″1q結合位點。例如，Ala殘基取代Glu 318，Lys 320和Lys 322使得IgG1 Fc不能指導抗體依賴性補體裂解。相比之下，裂解性IgG Fc區具有高親和力Fc受體結合位點和C′1q結合位點。高親和力Fc受體結合位點包括IgG Fc的235位的Leu殘基，并且C′1q結合位點包括IgG1的Glu 318、Lys 320和Lys 322殘基。裂解性IgG Fc在這些位點處具有野生型殘基或保守氨基酸取代。裂解性IgG Fc可以靶向細胞，用于抗體依賴性細胞毒性或補體指導性細胞溶解(CDC)。人IgG的適當突變也是已知的(參見例如Morrison等人，The Immunologist 2：119-124，1994；和Brekke等人，The Immunologist 2：125，1994)。

在其它實施方案中，嵌合多肽可以包括主題IL-2突變蛋白和用作抗原性標簽功能的多肽，如FLAG序列。FLAG序列通過如本文中所述的生物素化的、高度特異性的抗FLAG抗體識別(還參見Blanar等人，Science 256：1014，1992；LeClair等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：8145，1992)。在一些實施方案中，嵌合多肽還包含C-末端c-myc表位標簽。

在其它實施方案中，嵌合多肽包括突變體IL-2多肽和異源多肽，其用作功能以增強突變體IL-2多肽的表達或指導突變體IL-2多肽的細胞定位，如Aga2p凝集素亞基(參見例如Boder和Wittrup，Nature Biotechnol.15：553-7，1997)。

在其它實施方案中，可以產生包含突變體IL-2和抗體或其抗原結合部分的嵌合多肽。嵌合蛋白的抗體或抗原結合組分可以充當靶向部分。例如，其可以用于將嵌合蛋白定位到細胞或靶分子的特定子集。產生細胞因子-抗體嵌合多肽的方法描述于例如美國專利號6,617,135。

編碼突變體IL-2的核酸分子

在一些實施方案中，單獨或作為嵌合多肽(如上文所述的那些)的一部分的主題IL-2突變蛋白可通過核酸分子的表達獲得。正如IL-2突變蛋白可以根據其與野生型IL-2多肽的同一性描述一樣，編碼它們的核酸分子將必然與編碼野生型IL-2的核酸分子具有某種同一性。例如，編碼主題IL-2突變蛋白的核酸分子可以與編碼野生型IL-2的核酸(例如，SEQ ID NO：2)是至少50％、至少65％、優選至少75％、更優選至少85％且最優選至少95％(例如99％)相同的。

提供的核酸分子可以包含天然存在的序列，或與天然存在的序列不同，但由于遺傳密碼的簡并性，編碼相同多肽的序列。這些核酸分子可以由RNA或DNA(例如，基因組DNA、cDNA或合成DNA，如通過基于亞磷酰胺的合成產生)或這些類型的核酸內的核苷酸的組合或修飾組成。此外，核酸分子可以是雙鏈或單鏈(即，有義鏈或反義鏈)。

核酸分子不限于編碼多肽的序列；也可以包括位于編碼序列(例如，IL-2的編碼序列)上游或下游的一些或所有非編碼序列。分子生物學領域的普通技術人員熟悉用于分離核酸分子的常規程序。它們可以例如通過用限制性內切核酸酶處理基因組DNA或通過進行聚合酶鏈反應(PCR)產生。在核酸分子是核糖核酸(RNA)的情況下，可以例如通過體外轉錄產生分子。

本公開的示例性分離的核酸分子可以包括在天然狀態下本身找不到的片段。因此，本公開涵蓋重組分子，例如其中核酸序列(例如，編碼突變體IL-2的序列)摻入載體(例如質粒或病毒載體)或異源細胞的基因組(或同源細胞的基因組，在除天然染色體位置以外的位置)中的那些重組分子。

如上所述，主題IL-2突變蛋白可以作為嵌合多肽的一部分存在。除了上述異源多肽之外或代替上述異源多肽，主題核酸分子可以含有編碼“標志物”或“報告物”的序列。標志物或報告物基因的實例包括β-內酰胺酶，氯霉素乙酰轉移酶(CAT)、腺苷脫氨酶(ADA)、氨基糖苷磷酸轉移酶(neo^r，G418^r)、二氫葉酸還原酶(DHFR)、潮霉素-B-磷酸轉移酶(hygromycin-B-hosphotransferase，HPH)、胸苷激酶(TK)、lacz(編碼β-半乳糖苷酶)和黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖基轉移酶(XGPRT)。本領域技術人員將意識到另外的有用試劑，例如，可以充當標志物或報告物功能的另外的序列。

可以通過將突變引入從任何生物細胞(如哺乳動物的細胞)獲得的編碼IL-2的DNA中獲得主題核酸分子。因此，主題核酸(及它們編碼的多肽)可以是小鼠、大鼠、豚鼠、牛、綿羊、馬、豬、兔、猴、狒狒、狗或貓的核酸。在一個實施方案中，核酸分子是人的核酸分子。

突變體IL-2基因產物的表達

上述核酸分子可以包含在能夠指導其在例如已經用載體轉導的細胞中表達的載體內。因此，除了主題IL-2突變蛋白之外，包含編碼主題IL-2突變蛋白的核酸分子的表達載體和用這些載體轉染的細胞在優選的實施方案中。

當然應該理解，不是所有的載體和表達控制序列都能同樣好地發揮功能以表達本文中所述的DNA序列。在相同表達系統下，所有宿主也不會同樣好地發揮作用。然而，本領域技術人員可以在這些載體，表達控制序列和宿主中進行選擇而無需過多的實驗。例如，在選擇載體中，必須考慮宿主，因為載體必須在其中復制。還應考慮載體的拷貝數，控制該拷貝數的能力和由載體編碼的任何其它蛋白質，如抗生素標志物的表達。例如，可以使用的載體包括允許編碼IL-2突變蛋白的DNA以拷貝數擴增的載體。此類可擴增載體是本領域中公知的。它們包括例如能夠通過DHFR擴增(參見例如Kaufman，美國專利號4,470,461，Kaufman和Sharp，“Construction of a Modular Dihydrafolate Reductase cDNA Gene：Analysis of Signals Utilized for Efficient Expression”，Mol.Cell.Biol.，2，第1304-19頁(1982))或谷氨酰胺合成酶(“GS”)擴增(參見例如美國專利號5,122,464和歐洲公開申請338,841)擴增的載體。

在一些實施方案中，本公開的人IL-2突變蛋白將從載體，優選表達載體表達。載體可用于宿主細胞中的自主復制，或可以在引入宿主細胞中后整合到宿主細胞的基因組中，從而與宿主基因組一起復制(例如，非附加體哺乳動物載體)。表達載體能夠指導與它們可操作地連接的編碼序列的表達。通常，在重組DNA技術中有用的表達載體通常是質粒(載體)的形式。然而，也包括其它形式的表達載體，如病毒載體(例如，復制缺陷型逆轉錄病毒，腺病毒和腺伴隨病毒)。

示例性重組表達載體可以包括可操作地連接到待表達的核酸序列的一個或多個調節序列，其基于待用于表達的宿主細胞選擇。

可以設計表達構建體或載體以在原核或真核宿主細胞中表達IL-2突變蛋白或其變體。

可以通過常規轉化或轉染技術將載體DNA引入原核或真核細胞中。用于轉化或轉染宿主細胞的合適方法可見于Sambrook等人(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual(第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Plainview，N.Y.)和其它標準分子生物學實驗室手冊。

蛋白質在原核生物中的表達最經常在具有含有組成性或誘導型啟動子的載體的大腸埃希氏菌(Escherichia coli)中進行。在大腸埃希氏菌中最大化重組蛋白表達的策略可以參見例如Gottesman(1990)于Gene Expression Technology：Methods in Enzymology 185(Academic Press，San Diego，Calif.)，第119-128頁和Wada等人(1992)Nucleic Acids Res.20：2111-2118。用于從細胞培養，收獲，破壞或提取IL-2突變蛋白或其變體的方法基本上描述于例如美國專利號4,604,377；4,738,927；4,656,132；4,569,790；4,748,234；4,530,787；4,572,798；4,748,234；和4,931,543，其全部內容通過引用的方式并入本文。

在一些實施方案中，也可以在真核生物，如酵母或人細胞中制備重組IL-2突變蛋白或其生物活性變體。合適的真核宿主細胞包括昆蟲細胞(可用于在培養的昆蟲細胞(例如Sf9細胞)中表達蛋白質的桿狀病毒載體的實例包括pAc系列(Smith等人(1983)Mol.Cell Biol.3：2156-2165)和pVL系列(Lucklow和Summers(1989)Virology 170：31-39))；酵母細胞(用于在酵母釀酒酵母(S.cerenvisiae)中表達的載體的實例包括pYepSec1(Baldari等人(1987)EMBO J.6：229-234)，pMFa(Kurjan和Herskowitz(1982)Cell 30：933-943)，pJRY88(Schultz等人(1987)Gene 54：113-123)、pYES2(Invitrogen Corporation，San Diego，Calif.)和pPicZ(Invitrogen Corporation，San Diego，Calif.))；或哺乳動物細胞(哺乳動物表達載體包括pCDM8(Seed(1987)Nature 329：840)和pMT2PC(Kaufman等人(1987)EMBO J.6：187：195))。合適的哺乳動物細胞包括中國倉鼠卵巢細胞(CHO)或COS細胞。在哺乳動物細胞中，表達載體的控制功能通常由病毒調節元件提供。例如，常用的啟動子源自多瘤，腺病毒2，巨細胞病毒和猿猴病毒40。對于原核和真核細胞兩者的其它合適的表達系統，參見Sambrook等人(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual(第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Plainview，N.Y.)的第16和17章。參見Goeddel(1990)于Gene Expression Technology：Methods in Enzymology 185(Academic Press，San Diego，Calif.)。

可以優化編碼本公開的人IL-2突變蛋白的序列以在感興趣的宿主細胞中表達。可以將序列的G-C含量調整至給定細胞宿主的平均水平，如通過參考在宿主細胞中表達的已知基因計算。用于密碼子優化的方法是本領域中公知的。可以優化IL-2突變蛋白編碼序列內的密碼子以增強宿主細胞中的表達，使得已經優化編碼序列內的約1％，約5％、約10％、約25％、約50％、約75％或高達100％的密碼子以在特定宿主細胞中表達。

適合使用的載體包括用于細菌中的基于T7的載體(參見例如Rosenberg等人，Gene 56：125，1987)，用于哺乳動物細胞中的pMSXND表達載體(Lee和Nathans，J.Biol.Chem.263：3521，1988)，和用于昆蟲細胞中的桿狀病毒衍生的載體(例如，表達載體pBacPAK9，來自Clontech，Palo Alto，Calif.)。

在一些實施方案中，編碼此類載體中的主題IL-2突變蛋白的核酸插入物可以與啟動子可操作地連接，所述啟動子基于例如在其中尋求表達的細胞類型來選擇。

在選擇表達控制序列中，還應考慮多種因素。這些包括例如序列的相對強度、其可控性以及其與編碼主題IL-2突變蛋白的實際DNA序列的相容性，特別是關于潛在的二級結構而言。宿主應該通過考慮它們與選擇的載體的相容性，由本發明的DNA序列編碼的產物的毒性，它們的分泌特征，它們正確折疊多肽的能力，它們的發酵或培養需求以及純化由DNA序列編碼的產物的容易性選擇。

在這些參數內，本領域技術人員可以選擇各種載體/表達控制序列/宿主組合，其將在發酵上或在大規模動物培養(例如使用CHO細胞或COS 7細胞)中表達期望的DNA序列。

在一些實施方案中，表達控制序列和表達載體的選擇將取決于宿主的選擇。可以使用多種表達宿主/載體組合。用于真核宿主的有用的表達載體包括例如具有來自SV40，牛乳頭瘤病毒，腺病毒和巨細胞病毒的表達控制序列的載體。用于細菌宿主的有用的表達載體包括已知的細菌質粒，例如來自大腸埃希氏菌的質粒，包括col E1、pCRI、pER32z、pMB9及其衍生物，更寬的宿主范圍的質粒，例如RP4，噬菌體DNA，例如，噬菌體λ(例如NM989)和其它DNA噬菌體(例如M13和絲狀單鏈DNA噬菌體)的許多衍生物。用于酵母細胞的有用的表達載體包括2μ質粒及其衍生物。用于昆蟲細胞的有用載體包括pVL 941和pFastBac^TM 1(GibcoBRL，Gaithersburg，Md.)。Cate等人，“Isolation Of The Bovine And Human Genes For Mullerian Inhibiting Substance And Expression Of The Human Gene In Animal Cells”，Cell，45，第685-98頁(1986)。

此外，在這些載體中可以使用極其多種表達控制序列中的任一種。此類有用的表達控制序列包括與前述表達載體的結構基因相關的表達控制序列。有用的表達控制序列的實例包括例如SV40或腺病毒的早期和晚期啟動子，lac系統，trp系統，TAC或TRC系統，噬菌體λ的主要操縱基因和啟動子區，例如PL，fd外殼蛋白的控制區，3-磷酸甘油酸激酶或其它糖酵解酶的啟動子，酸性磷酸酶的啟動子(例如PhoA)，酵母a-交配系統的啟動子，桿狀病毒的多角體啟動子和已知控制原核或真核細胞或其病毒的基因表達的其它序列，及其各種組合。

T7啟動子可以用于細菌，多角體蛋白啟動子可以用于昆蟲細胞，并且巨細胞病毒或金屬硫蛋白啟動子可以用于哺乳動物細胞。此外，在高等真核生物的情況下，組織特異性和細胞類型特異性啟動子是可廣泛可用的。這些啟動子因其指導核酸分子在體內給定組織或細胞類型中表達的能力而命名。技術人員熟知許多啟動子和可用于指導核酸表達的其它調節元件。

除了促進插入的核酸分子轉錄的序列之外，載體可以含有復制起點和編碼選擇標志物的其它基因。例如，新霉素抗性(neo^r)基因對表達其的細胞賦予G418抗性，并且因此允許轉染細胞的表型選擇。本領域技術人員可以容易地確定給定的調節元件或選擇標志物是否適合于在特定的實驗背景中使用。

可以用于本發明的病毒載體包括例如逆轉錄病毒，腺病毒和腺伴隨載體，皰疹病毒，猿猴病毒40(SV40)和牛乳頭瘤病毒載體(參見例如Gluzman(編)，Eukaryotic Viral Vectors，CSH Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.)。

含有并表達編碼本文公開的主題IL-2突變蛋白的核酸分子的原核或真核細胞也是本發明的特征。本發明的細胞是轉染的細胞，即通過重組DNA技術引入核酸分子，例如編碼突變體IL-2多肽的核酸分子的細胞。也認為此類細胞的后代在本發明的范圍內。

表達系統的精確組分不是至關重要的。例如，可以在原核宿主，如細菌大腸埃希氏菌中，或在真核宿主，如昆蟲細胞(例如Sf21細胞)或哺乳動物細胞(例如COS細胞、NIH 3T3細胞或HeLa細胞)中產生IL-2突變蛋白。這些細胞可從許多來源獲得，包括美國典型培養物保藏中心(Manassas，Va.)。在選擇表達系統中，重要的僅是組件彼此相容。技術人員或普通技術能夠做出此類確定。此外，如果在選擇表達系統中需要指導，那么熟練技術人員可以查閱Ausubel等人(Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley and Sons，New York，N.Y.，1993)和Pouwels等人(Cloning Vectors：A Laboratory Manual，1985增刊1987)。

表達的多肽可以使用常規生物化學程序從表達系統中純化，并且可以用作例如如本文中所述的治療劑。

在一些實施方案中，根據用于產生突變蛋白的宿主生物體，獲得的IL-2突變蛋白將是糖基化的或未糖基化的。如果選擇細菌作為宿主，那么產生的IL-2突變蛋白將是未糖基化的。另一方面，真核細胞將糖基化IL-2突變蛋白，盡管可能不以與天然IL-2被糖基化相同的方式。由轉化的宿主產生的IL-2突變蛋白可以根據任何合適的方法純化。已知用于純化IL-2的各種方法。參見，例如，Current Protocols in Protein Science，第2卷.John E.Coligan，Ben M.Dunn，Hidde L.Ploehg，David W.Speicher，Paul T.Wingfield編，Unit 6.5(Copyright 1997，John Wiley and Sons，Inc.)。可以使用陽離子交換，凝膠過濾和或反相液相色譜從在大腸埃希氏菌中產生的包含體中，或從產生給定突變蛋白的哺乳動物或酵母培養物的條件化培養基中分離IL-2突變蛋白。

構建編碼IL-2突變蛋白的DNA序列的另一個示例性方法是通過化學合成。這包括通過編碼展現出所述特性的IL-2突變蛋白的蛋白質序列的化學手段直接合成肽。該方法可以在影響IL-2與IL-2Rα，IL-2Rβ和/或IL-2Rγ的相互作用的位置處摻入天然和非天然氨基酸兩者。或者，編碼期望的IL-2突變蛋白的基因可以通過使用寡核苷酸合成儀的化學手段合成。此類寡核苷酸基于期望的IL-2突變蛋白的氨基酸序列設計，并且優選地選擇在會產生重組突變蛋白的宿主細胞中有利的那些密碼子。在這方面，公認的是遺傳密碼是簡并的：氨基酸可以由超過一個密碼子編碼。例如，Phe(F)由兩個密碼子TIC或TTT編碼，Tyr(Y)由TAC或TAT編碼，并且his(H)由CAC或CAT編碼。Trp(W)由單一密碼子TGG編碼。因此，應當理解，對于編碼特定IL-2突變蛋白的給定DNA序列，將存在許多將編碼該IL-2突變蛋白的DNA簡并序列。例如，應當理解，除了圖2中所示的突變蛋白5-2的優選DNA序列之外，還會有許多編碼所示的IL-2突變蛋白的簡并DNA序列。認為這些簡并DNA序列在本公開的范圍內。因此，本發明上下文中的“其簡并變體”意指編碼特定突變蛋白并因此實現特定突變蛋白表達的所有DNA序列。

可以通過本領域中已知的任何合適的方法測定IL-2突變蛋白的生物活性。此類測定包括PHA母細胞(PHA-blast)增殖和NK細胞增殖。

治療方法

在一些實施方案中，可以向受試者施用主題IL-2突變蛋白和/或表達它們的核酸，以治療與異常凋亡或分化過程有關的病癥(例如細胞增殖性病癥或細胞分化疾病，如癌癥，例如通過產生主動或被動免疫)。在治療此類疾病中，公開的IL-2突變蛋白可以擁有有利的性質，如降低的血管滲漏綜合征。

細胞增殖性和/或分化性病癥的實例包括癌癥(例如癌、肉瘤、轉移性病癥或造血贅生性病癥，例如白血病)。轉移性腫瘤可以源自大量原發性腫瘤類型，包括但不限于前列腺、結腸、肺、乳腺和肝的那些。本發明的組合物(例如突變體IL-2多肽和/或編碼它們的核酸分子)也可以施用給具有病毒感染(例如AIDS或流感)的患者。

突變體IL-2多肽可以用于治療具有，懷疑具有或可以有風險形成任何類型的癌癥(包括腎癌或黑素瘤)或任何病毒性疾病的患者。示例性的癌包括從宮頸、肺、前列腺、乳房、頭和頸、結腸和卵巢的組織形成的那些。該術語還包括癌肉瘤，其包括由癌性和肉瘤組織組成的惡性腫瘤。

增殖性病癥的其它實例包括造血贅生性病癥。

增殖性和/或分化性病癥的其它實例包括皮膚病癥。皮膚病癥可涉及真皮，表皮或下皮層中的細胞或細胞組或層的異常活性，或真皮-表皮連接處的異常。例如，皮膚病癥可以涉及角化細胞(例如，過度增殖基底和立即上基質角質形成細胞)，黑素細胞，朗格漢斯(Langerhans)細胞，梅克爾(Merkel)細胞，免疫細胞和在一個或多個表皮層(例如基底層(生發層)、棘層、顆粒層、透明層或角質層)中發現的其它細胞的異常活性。在其它實施方案中，病癥可涉及真皮細胞，例如真皮層(例如乳頭層或網狀層)中發現的真皮內皮，成纖維細胞，免疫細胞(例如，肥大細胞或巨噬細胞)的異常活性。

皮膚病癥的實例包括銀屑病、銀屑病關節炎、皮炎(濕疹)(例如剝脫性皮炎或特應性皮炎)、毛發紅糠疹、玫瑰糠疹(pityriasis rosacea)、紅斑痤瘡、副銀屑病、苔癬樣糠疹(pityriasis lichenoider)、扁平苔癬(lichen planus)、光澤苔蘚、魚鱗病樣皮膚病、角皮病(keratodermas)、皮膚病、斑禿、壞疽性膿皮病、白癜風、類天皰瘡(例如眼瘢痕性類天皰瘡或大皰性類天皰瘡)、，蕁麻疹、汗孔角化病(prokeratosis)、涉及關節囊內襯的上皮相關細胞的過度增殖和炎癥的類風濕性關節炎；皮炎，如溢脂性皮炎和日光皮炎；角化病如脂溢性角化病、老年角化病、光線性角化病、光誘發的角化病(photo-induced keratosis)和毛囊角化病(keratosis follicularis)；尋常痤瘡；瘢痕疙瘩和預防瘢痕疙瘩形成；痣；疣，包括疣、濕疣(condyloma)或尖銳濕疣，以及人乳頭瘤病毒(HPV)感染，如性病疣(venereal wart)；白斑；扁平苔蘚；和角膜炎。皮膚病癥可以是皮炎，例如特應性皮炎或過敏性皮炎，或銀屑病。

適于治療的患者也可具有銀屑病。術語“銀屑病”旨在具有其醫學含義，即主要累及皮膚并產生凸起的，增厚的，鱗屑的，不留疤痕的損害的疾病。病變通常是被重疊的有光澤的鱗屑覆蓋的尖銳分界的紅斑丘疹(erythematous papules)。鱗屑通常是銀色或微乳白色。經常發生指甲損害，導致凹陷性病斑(pitting)、指甲分離、增厚和變色。銀屑病有時與關節炎相關，并且它可以是有嚴重后果的。角質形成細胞的過度增殖是銀屑病表皮增生以及表皮炎癥和角化細胞分化減少的關鍵特征。已經調用多種機制來解釋表征銀屑病的角化細胞過度增殖。無序的細胞免疫也牽涉銀屑病的發病機制。銀屑病病癥的實例包括慢性靜止性銀屑病(chronic stationary psoriasis)，尋常性銀屑病，發疹性(滴狀)銀屑病，銀屑病性紅皮病，泛發性膿皰性銀屑病(Von Zumbusch)，膿皰性環狀銀屑病和局部膿皰性銀屑病。

或者，或除了直接施用于患者的方法之外，在一些實施方案中，突變體IL-2多肽可以用于離體方法。例如，可以在培養基中體外培養細胞(例如，從患者分離并且置于或維持在培養物中的外周血淋巴細胞或純化的淋巴細胞群體)，并且接觸步驟可以通過將IL-2突變體加入到培養基影響。培養步驟可以包括其它步驟，其中用其它作用劑刺激或處理細胞，例如以刺激增殖，或擴增與感興趣的抗原(例如癌抗原或病毒抗原)反應的細胞群。然后，在已經治療患者后對患者施用細胞。

在某些實施方案中，用作本文中所述的IL-2拮抗劑的主題IL-2突變蛋白可用于治療其中抑制一種或多種IL-2和/或IL-15依賴性功能有用的一種或多種狀況。在某些實施方案中，本文中所述的IL-2突變蛋白拮抗劑用于治療其中抑制IL-2Rβ/IL-2Rγ異二聚化和下游信號傳導有用的一種或多種疾病或病癥(例如GVDH或白血病)。

在一個實施方案中，治療方法用于治療移植物抗宿主病(GVHD)。在一些實施方案中，治療包括對具有GVHD的受試者施用治療有效量的作為IL-2拮抗劑的IL-2突變蛋白的步驟。已知IL-2和IL-15促成GVHD((Ferrara等人，Journal of Immunology 137：1874(1986)；和Blaser等人，Blood 105：894(2005))。因此，不受任何具體運行理論約束，認為本文中所述的IL-2拮抗劑可用于治療GVHD。在一個實施方案中，用于治療GVHD的IL-2突變蛋白包括與野生型IL-2相比降低其與IL-2Rγ_c受體的結合的一個或多個突變(例如，降低IL-2Rγ_c受體結合的任一種突變，如本文中描述)。在一些實施方案中，降低IL-2Rγ_c受體結合親和力的突變包括氨基酸取代L18R、Q22E、Q126T和S130R。在一些實施方案中，進一步具有降低的IL-2Rγ_c受體結合親和力的IL-2突變蛋白進一步包括與野生型IL-2相比增加IL-2突變蛋白對IL-2Rβ的結合親和力的一個或多個氨基酸突變(例如，如本文所述，增加IL-2Rβ結合的任一種突變)。在一些實施方案中，IL-2突變蛋白進一步包括氨基酸取代L80F、R81D、L85V、I86V和I92F。在一些實施方案中，IL-2突變蛋白包括氨基酸取代L18R、Q22E、L80F、R81D、L85V、Q126T、S130R、I86V和I92F。

在另一個實施方案中，治療方法用于治療IL-2和/或IL-15介導的白血病。在具體實施方案中，白血病是成人T細胞白血病(ATL)。ATL的特征在于CD4+T細胞的惡性擴增，其展現出牽涉IL-2和IL-15的自分泌信號以及IL-9的旁分泌信號的早期生長階段。此類細胞因子依賴性增殖在患有慢性和郁積型，但不是急性ATL的患者中是明顯的。因此，不受任何特定的運行理論束縛，認為IL-2部分激動劑和拮抗劑可以用于治療白血病的此類形式。在一些實施方案中，治療包括對患有成人T細胞白血病的受試者施用治療有效量的作為IL-2拮抗劑的IL-2突變蛋白的步驟。在一些實施方案中，患者患有慢性和郁積型ATL。在一個實施方案中，用于治療ATL的IL-2突變蛋白包括與野生型IL-2相比降低其與IL-2Rγ_c受體結合的一個或多個突變(例如，降低IL-2Rγ_c受體結合的任一種突變，如本文中所述)。在一些實施方案中，降低IL-2Rγ_c受體結合親和力的突變包括氨基酸取代L18R、Q22E、Q126T和S130R。在一些實施方案中，進一步具有降低的IL-2Rγ_c受體結合親和力的IL-2突變蛋白進一步包括與野生型IL-2相比增加IL-2突變蛋白對IL-2Rβ的結合親和力的一個或多個氨基酸突變(例如，增加IL-2Rβ結合的任一種突變，如本文中所述)。在一些實施方案中，IL-2突變蛋白進一步包括氨基酸取代L80F、R81D、L85V、I86V和I92F。在一些實施方案中，IL-2突變蛋白包括氨基酸取代L18R、Q22E、L80F、R81D、L85V、Q126T、S130R、I86V和I92F。

藥物組合物和施用方法

在一些實施方案中，主題IL-2突變蛋白和核酸可以摻入組合物(包括藥物組合物)中。此類組合物通常包括多肽或核酸分子和藥學可接受載體。

將藥物組合物配制成與其意圖的給藥途徑相容。本發明的突變體IL-2多肽可以口服給予，但更可能將通過腸胃外途徑施用它們。腸胃外施用途徑的實例包括例如靜脈內、皮內、皮下、經皮(局部)、經粘膜和直腸施用。用于腸胃外應用的溶液或懸浮液可以包括以下組分：無菌稀釋劑，如注射用水、鹽水溶液、不揮發性油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶劑；抗細菌劑如芐醇或對羥基苯甲酸甲酯；抗氧化劑如抗壞血酸或亞硫酸氫鈉；螯合劑如乙二胺四乙酸；緩沖劑如乙酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽和用于調節張力的作用劑，如氯化鈉或右旋糖。可以用酸或堿，如磷酸二氫鈉和/或磷酸氫二鈉、鹽酸或氫氧化鈉調節pH(例如，至約7.2-7.8的pH，例如7.5)。胃腸外制劑可以封裝在由玻璃或塑料制成的安瓿，一次性注射器或多劑量小瓶中。

適合于可注射使用的藥物組合物包括無菌水溶液(在水溶性的情況下)或分散體和用于臨時制備無菌可注射溶液或分散體的無菌粉末。對于靜脈內施用，合適的載體包括生理鹽水、抑菌水、Cremophor EL^TM.(BASF，Parsippany，N.J.)或磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)。在所有情況下，組合物應當是無菌的，并且在存在容易的可注射性的程度上應當是流體的。它在制造和儲存條件下應該是穩定的，并且必須針對微生物，如細菌和真菌的污染作用進行防腐。載體可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液體聚乙二醇等)及其合適的混合物的溶劑或分散介質。可以例如通過使用涂層材料，如卵磷脂，通過在分散體的情況下維持所需的粒度以及通過使用表面活性劑，如十二烷基硫酸鈉維持適當的流動性。通過各種抗細菌劑和抗真菌劑，例如對羥基苯甲酸酯、氯丁醇、酚、抗壞血酸、硫柳汞等，可以實現防止微生物的作用。在許多情況下，優選在組合物中包含等張劑，例如糖、多元醇(如甘露醇、山梨醇)、氯化鈉。可注射組合物的延長吸收可通過在組合物中包括延遲吸收的作用劑(例如單硬脂酸鋁和明膠)來實現。

無菌可注射溶液可以通過將所需量的活性化合物摻入根據需要具有上文列舉的成分中的一種或組合的合適溶劑中，然后過濾滅菌來制備。通常，通過將活性化合物摻入無菌媒介物中制備分散體，所述無菌媒介物包含基礎分散介質和來自上文列舉的那些的需要的其它成分。在用于制備無菌注射溶液的無菌粉末的情況下，優選的制備方法是真空干燥和冷凍干燥，其產生活性成分加上來自其先前無菌過濾的溶液的任何另外的需要成分的粉末。

口服組合物(如果使用的話)通常包括惰性稀釋劑或可食用載體。為了口服治療施用的目的，活性化合物可以與賦形劑一起摻入并以片劑、錠劑或膠囊劑，如明膠膠囊的形式使用。口服組合物也可以使用流體載體制備，用作漱口劑。可以包括藥學相容粘合劑和/或輔助材料作為組合物的一部分。片劑、丸劑、膠囊、錠劑等可以含有任何下列成分或類似性質的化合物：粘合劑，如微晶纖維素、黃蓍膠或明膠；賦形劑如淀粉或乳糖，崩解劑如藻酸，Primogel^TM或玉米淀粉；潤滑劑如硬脂酸鎂或Sterotes^TM；助流劑如膠體二氧化硅；甜味劑如蔗糖或糖精；或調味劑，如薄荷、水楊酸甲酯或橙味調味劑。

在通過吸入施用的情況下，從含有合適的推進劑，例如氣體如二氧化碳的加壓容器或分配器，或霧化器以氣溶膠噴霧的形式遞送主題IL-2突變蛋白或編碼它們的核酸。此類方法包括在美國專利號6,468,798中描述的那些方法。

也可以通過經粘膜或透皮手段進行主題IL-2突變蛋白或核酸的系統施用。對于經粘膜或經皮施用，在配制劑中使用適合于待滲透的屏障的滲透劑。此類滲透劑通常是本領域中已知的，并且包括例如用于經粘膜施用的去污劑，膽汁鹽和夫西地酸衍生物。可以通過使用鼻噴霧或栓劑實現經粘膜施用。對于透皮施用，將活性化合物配制成軟膏劑、軟膏(salve)、凝膠或乳膏，如本領域中通常已知。

在一些實施方案中，也可以以栓劑(例如，使用常規栓劑基質，如可可脂和其它甘油酯)或保留灌腸劑的形式制備化合物(突變體IL-2多肽或核酸)以進行直腸遞送。

在一些實施方案中，也可以通過使用本領域中已知的方法轉染或感染施用化合物(主題IL-2突變蛋白或核酸)，所述方法包括但不限于McCaffrey等人(Nature 418：6893，2002)，Xia等人(Nature Biotechnol.20：1006-1010，2002)，或Putnam(Am.J.Health Syst.Pharm.53：151-160，1996，勘誤表于Am.J.Health Syst.Pharm.53：325，1996)中描述的方法。

在一個實施方案中，用將保護突變體IL-2多肽免于從體內快速消除的載體制備主題IL-2突變蛋白或核酸，如受控釋放配制劑，包括植入物和微囊化遞送系統。可以使用可生物降解的生物相容性聚合物，如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、膠原、聚原酸酯和聚乳酸。可以使用標準技術制備此類配制劑。材料還可以從Alza Corporation和Nova Pharmaceuticals，Inc.商購獲得。脂質體懸浮液(包括用針對病毒抗原的單克隆抗體靶向到受感染的細胞的脂質體)也可以用作藥學可接受載體。這些可以根據本領域技術人員已知的方法制備，例如，美國專利號4,522,811。

可以通過細胞培養物或實驗動物中的標準藥學程序確定此類主題IL-2突變蛋白或核酸化合物的劑量、毒性和治療功效，例如用于測定LD₅₀(對50％群體致死的劑量)和ED₅₀(在50％的群體中治療有效的劑量)。毒性和治療效果之間的劑量比率是治療指數，并且其可以表示為比率LD₅₀/ED₅₀。展現出高治療指數的化合物是優選的。雖然可以使用展現出毒性副作用的化合物，但是應當注意設計將此類化合物靶向受影響組織的部位的遞送系統，以便使對未感染的細胞的潛在損害最小化，從而減少副作用。

從細胞培養測定和動物研究獲得的數據可以用于配制用于人的劑量范圍。此類化合物的劑量優選位于包括ED₅₀的循環濃度范圍內，具有很少的毒性或沒有毒性。劑量可以在此范圍內變化，這取決于所使用的劑型和所使用的施用途徑。對于本發明方法中使用的任何化合物，治療有效劑量可以最初從細胞培養測定中估計。可以在動物模型中配制劑量以達到循環血漿濃度范圍，其包括如在細胞培養物中測定的IC₅₀(即達到癥狀的半最大抑制的測試化合物的濃度)。此類信息可以用于更準確地確定人體中的有用劑量。可以例如通過高效液相色譜測量血漿中的水平。

如本文中所定義，主題IL-2突變蛋白的治療有效量(即有效劑量)取決于選擇的多肽。例如，可以施用在約0.001至0.1mg/kg患者體重范圍內的單劑量；在一些實施方案中，可以施用約0.005，0.01，0.05mg/kg。在一些實施方案中，施用600,000IU/kg(IU可以通過淋巴細胞增殖生物測定確定，并且以國際單位(IU)表示，如由世界衛生組織白介素-2(人)的第一國際標準建立)。劑量可以類似于但預期小于規定的劑量。組合物可以每天一次或多次至每周一次或多次施用一次；包括每隔一天一次。熟練技術人員將理解，某些因素可以影響有效治療受試者所需的劑量和時機，包括但不限于疾病或病癥的嚴重性、先前的治療、受試者的一般健康和/或年齡以及存在的其它疾病。此外，用治療有效量的主題IL-2突變蛋白治療受試者可以包括單一治療或可以包括一系列治療。在一個實施方案中，每8小時施用組合物達5天，接著2-14天的休息期，例如9天，然后每8小時再施用5天。

藥物組合物可與施用說明書一起包括在容器，包裝或分配器中。

提供以下實施例以描述本文中提供的本發明的某些實施方案，且不應解釋為限制。

實施例

實施例1：酵母表面上的IL-2的功能性表達

盡管先前已經在噬菌體上展示了IL-2(Buchli等人，Arch.Biochem.Biophys.339：79-841997)，但是現有系統不適于定向進化，因此不適合于獲得具有改善的對IL-2R亞基的結合的IL-2突變體。為了克服這點，在酵母細胞的表面上表達IL-2。將人IL-2DNA克隆到酵母展示載體pCT302中。用pCT302_IL-2載體轉化釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株EBY100，并在SD-CAA平板上于30℃下生長3天。將IL-2酵母的單個菌落在30℃下在SD-CAA中生長過夜，然后在20℃下在SGCAA中引入2天。在生物素化的γ存在下，用四聚化的生物素化的IL-2Rβ、生物素化的γ或生物素化的IL-2Rβ對酵母進行染色。將IL-2Rβ和γ的胞外域進行C端生物素化并偶聯至藻紅蛋白-綴合的鏈霉親和素，以用作染色和分選試劑。通過在冰上將2μM生物素化的IL-2Rβ與470nM鏈霉親和素-藻紅蛋白(SA-PE，Invitrogen)一起孵育15分鐘來形成IL-2Rβ四聚體。這些受體“四聚體”增強了低親和力單體胞外域(ECD)與IL-2的相互作用的親合力，使得能夠從文庫中最大回收IL-2變體。類似溶液野生型IL-2，酵母-展示的IL-2較弱地結合至單獨的IL-2Rβ，不結合至單獨的γ，但在IL-2Rβ的存在下的確結合至γ，如通過流式細胞術所示的對角線染色證明(數據未顯示)。因此，酵母-展示的IL-2概括了用可溶性IL-2看到的細胞上的異二聚體受體復合物的協同裝配，并且因此適合作為文庫選擇的平臺。

實施例2：IL-2突變體文庫的構建和篩選

第一代體外策略是創建整個IL-2基因的易錯PCR文庫。第一代突變IL-2文庫如下構建。使用 II隨機誘變試劑盒按照制造商的說明書使野生型人白介素-2(IL-2)經受易錯誘變。以下引物用于易錯PCR：5’-GCACCTACTTCAAGTTCTAC-3’(“IL-2_errprone_for)和5’-GCCACCAGAGGATCC-3’(“IL-2_errprone_rev)。然后，使用以下引物擴增易錯PCR反應的產物：5’AGTGGTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTTCTGCTAGCGCACCTACTTCAAGTTCTAC-3’(SEQ ID NO：33)和5’ACACTGTTGTTATCAGATCTCGAGCAAGTCTTCTTCGGAGATAAGCTTTTGTTCGCCACCAGAGGATCC-3’(SEQ ID NO：34)，得到約130μg的DNA。用限制酶NheI和BamHI雙重消化酵母展示載體pCT302，并凝膠純化。將IL-2DNA和pCT302DNA以5：1μg比率與電感受態EBY100酵母混合在一起。將酵母電穿孔以促進文庫DNA進入酵母中。將此電穿孔重復約20次，得到1x10⁸個轉化體的最終文庫大小。

第一代IL-2文庫的選擇：使文庫經受針對IL-2Rβ的六輪選擇(圖2A)。在第一輪中，用470nM四聚體IL-2Rβ標記文庫，所述四聚體IL-2Rβ通過混合2μM生物素化的IL-2Rβ與470nM鏈霉親和素-藻紅蛋白綴合物(SAV-PE)15分鐘而形成。將文庫與IL-2Rβ一起孵育1.5小時、用PBS-BSA緩沖液(磷酸鹽緩沖鹽水+牛血清白蛋白)洗滌，并且在4℃下與Miltenyi抗PE微珠孵育20分鐘。再次洗滌細胞，并流過磁性柱用于選擇。將此選擇方法再連續重復5次，變化僅在于IL-2Rβ濃度中(第2輪-1μM，第3輪-1μM，第4輪-300nM，第5輪-300nM，第6輪-100nM，所有單體IL-2Rβ)。在選擇結束后，將第5輪和第6輪酵母培養物鋪在SD-CAA平板上，這產生單獨的酵母菌落。測試18個所得的酵母菌落與500nM IL-2Rβ的結合。從這18個酵母菌落中分離的IL-2DNA進行測序。相對于野生型IL-2中的相應殘基，這18個酵母菌落中的氨基酸差異顯示在表1中。

表1

第二代IL-2文庫的文庫構建：基于高百分比的含有L85V的克隆，構建了主要聚焦于疏水核心殘基的第二IL-2文庫。構建了定點IL-2文庫，其具有在Q74、L80、R81、L85、I86、I89、I92、V93處的突變。使得Q74以H/K/N/Q/R/S變化。使得R81用NNK簡并密碼子在所有20種氨基酸中變化，其中N表示為腺嘌呤、胸腺嘧啶、鳥嘌呤和胞嘧啶核苷酸各自的25％混合物，并且K為鳥嘌呤或胸腺嘧啶。使得剩余的殘基以F/I/L/V變化。使用以下寡聚物通過裝配PCR構建文庫：

IL-2_affmat_ass01

GCACCTACTTCAAGTTCTACAAAGAAAACACAGCTACAACTGGAGCA(SEQ ID NO：35)

IL-2_affmat_ass02

CAAAATCATCTGTAAATCCAGAAGTAAATGCTCCAGTTGTAGCTGTG(SEQ ID NO：36)

IL-2_affmat_ass03

GGATTTACAGATGATTTTGAATGGAATTAATAATTACAAGAATCCCA(SEQ ID NO：37)

IL-2_affmat_ass04B

AACTTAGCTGTGAGCATCCTGGTGAGTTTGGGATTCTTGTAATTATT(SEQ ID NO：38)

IL-2_affmat_ass05B

GGATGCTCACAGCTAAGTTTTACATGCCCAAGAAGGCCACAGAACTG(SEQ ID NO：39)

IL-2_affmat_ass06

GTTCTTCTTCTAGACACTGAAGATGTTTCAGTTCTGTGGCCTTCTTG(SEQ ID NO：40)

IL-2_affmat_ass07

CAGTGTCTAGAAGAAGAACTCAAACCTCTGGAGGAAGTGCTAAATTTA(SEQ ID NO：41

IL-2_affmat_ass08GTGAAAGTTTTTGCTSYKAGCTAAATTTAGCACTTCCTCC(SEQ ID NO：42)

IL-2_affmat_ass09

AGCAAAAACTTTCACNTCNNKCCCAGGGACNTCNTCAGCAATNTCAACGTANTCNTCCTGGAACTAAAGGGATC(SEQ ID NO：43)

IL-2_affmat_ass10

CATCAGCATATTCACACATGAATGTTGTTTCAGATCCCTTTAGTTCCAG(SEQ ID NO：44)

IL-2_affmat_ass11

ATGTGTGAATATGCTGATGAGACAGCAACCATTGTAGAATTTCTGAACA(SEQ ID NO：45)

IL-2_affmat_ass12

AGATGATGCTTTGACAAAAGGTAATCCATCTGTTCAGAAATTCTACAAT(SEQ ID NO：46)

IL-2_affmat_ass13TTTTGTCAAAGCATCATCTCAACACTAACTGGATCCTCTGGTGGC(SEQ ID NO：47)

用以下寡聚物擴增定點PCR：

PCR擴增寡聚物(包括50bp同源性)

dL-2_site2_assFor：

5’-

AGTGGTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTTCTGCTAGCGCACCTACTTCAAGTTCTAC-3’(SEQ ID NO：48)

IL-2_site2_assRev：

5’-

ACACTGTTGTTATCAGATCTCGAGCAAGTCTTCTTCGGAGATAAGCTTTTGTTCGCCACCAGAGGATCC-3’(SEQ ID NO：49)

PCR產生40μg DNA，將其與雙重消化的pCT302和電感受態EBY100酵母混合，并如用第一代文庫一樣電穿孔。

第二代IL-2文庫的選擇：使文庫經受針對IL-2Rβ的五輪選擇(圖2B)。與用第一代文庫完全一樣進行此選擇方法，只是對使用的IL-2Rβ的濃度進行修改(第1輪-1μM，第2輪-100nM，第3輪-30nM，第4輪-30nM，第5輪-10nM，所有單體IL-2Rβ)。在選擇結束后，將第4輪和第5輪酵母培養物鋪在SD-CAA平板上，這產生單獨的酵母菌落。來自這兩輪的48個單獨的酵母克隆在96孔板塊形式中培養，并且通過用5nM IL-2Rβ、然后用SAV-PE標記進行篩選。篩選產生了對IL-2Rβ的7種高親和力結合劑(圖3和表2)。相對于野生型IL-2中的相應殘基在這7種高親和力結合劑間的氨基酸差異與對IL-2Rβ的結合親和力一起顯示在表2中。

表2

實施例3：IL-2突變蛋白蛋白表達和純化

將人IL-2變體(氨基酸1-133)、IL-2Rβ胞外域(氨基酸1-214)和γ_c(氨基酸34-232)與N-末端gp67信號序列和C-末端六組氨酸標簽以讀碼框的方式克隆到pAcGP67-A載體(BD Biosciences)中，并使用桿狀病毒表達系統產生。通過在SF900II培養基(Invitrogen)中生長的草地貪夜蛾(Spodoptera frugiperda，Sf9)細胞中的轉染和擴增來制備桿狀病毒儲液，并且在 Insect XPRESS^TM培養基(Lonza)中生長的懸浮液粉紋夜蛾(Trichoplusia ni)(High Five^TM)細胞中進行蛋白質表達。蛋白質被表達，并且在48-60小時后通過鎳瓊脂糖(QIAGEN)從HighFive^TM上清液中捕獲、濃縮并通過在10mM HEPES(pH 7.2)和150mM NaCl中平衡的Superdex^TM200柱(GE Healthcare)上的尺寸排阻色譜純化。表達完全糖基化在SPR和基于細胞的測定中使用的IL-2變體。對于生物素化受體表達，將IL-2Rβ和γ_c克隆到具有C-末端生物素受體肽(BAP)-LNDIFEAQKIEWHE和六組氨酸標簽的pAcGP67-A載體中。在過量生物素(100uM)的情況下共表達受體蛋白與BirA連接酶。

實施例4：CD25^-和CD25⁺天然殺傷(YT-1)細胞的刺激

將YT-1和CD25+YT-1細胞在補充有10％胎牛血清、2mM L-谷氨酰胺、最低非必需氨基酸、丙酮酸鈉、25mM HEPES和青霉素-鏈霉素(Gibco)的RPMI 1640培養基中培養。如下純化CD25⁺YT-1細胞：用FACS緩沖液(磷酸鹽緩沖鹽水+2％牛血清白蛋白)洗滌1x 10⁷個細胞，并用1mL FACS緩沖液中的PE-綴合的抗人CD25(1：20；Biolegend，San Diego，CA)于4℃下染色20分鐘。用偶聯至抗-PEIgG的順磁性微珠標記染色的細胞，并根據制造商的說明書(Miltenyi Biotec，Bergisch Gladbach，Germany)用LS分離柱分離。將洗脫的細胞以1x10⁵個細胞的濃度重懸于完全RPMI培養基中，并擴增用于隨后的實驗。經由使用 C6流式細胞儀的具有FL-2通道的流式細胞術監測細胞的富集。

通過用流式細胞術測定STAT5磷酸化來測定YT-1細胞上的H9、D10和6-6的劑量-響應關系(圖4A和4B)。用FACS緩沖液洗滌CD25⁺或CD25^-YT-1細胞，并重懸于96孔板中的200μL具有指定濃度的野生型、6-6、H9或D10的FACS緩沖液內。在室溫下刺激細胞20分鐘，然后通過添加甲醛至1.5％固定，并孵育10分鐘。用100％冰冷的甲醇在冰上透化細胞20分鐘，然后在-80℃孵育過夜。將固定的、透化的細胞用過量的FACS緩沖液洗滌，并與在FACS緩沖液中以1：20稀釋的50μL Alexa647綴合的抗STAT5 pY694(BD Biosciences，San Jose，CA)孵育20分鐘。將細胞在FACS緩沖液中洗滌兩次，并使用 C6流式細胞儀以FL-4通道測定平均細胞熒光。

通過利用IL-2的充分表征的突變，即第42位的苯丙氨酸突變到丙氨酸(F42A)進一步測試了IL-2突變蛋白(所謂的“超級-2”分子)的CD25非依賴性，所述突變消除對CD25的結合但不影響其結合至IL-2Rβ或IL-2Rγ的能力(Mott，1995)。也將此突變引入H9突變蛋白中，產生H9F42A。在CD25-和CD25+YT-1細胞上通過IL-2、IL-2F42A、H9和H9F42A的STAT誘導進行比較(圖5)。盡管IL-2F42A突變使CD25+細胞上的野生型IL-2的劑量響應曲線右移約1個對數，但F42A突變對CD25-細胞上的STAT誘導沒有可觀察到的影響(圖5A)。相比之下，H9和H9F42A的劑量響應曲線在CD25-和CD25+細胞上基本上重疊(圖5B)。因此，這些實驗證明，雖然IL-2突變蛋白不明顯受益于CD25的存在，但它們的活性對破壞CD25界面的突變不敏感。

實施例5：CD25-和CD25+T細胞的刺激

分別使用經抗體包被的CD4T細胞分離磁珠(Stem Cell Technologies and Miltenyi Biotec)從PBMC(Stanford Blood Bank)和BALB/C小鼠的脾和淋巴結制備人和小鼠CD4T細胞。對于首次用于試驗的細胞刺激測定，立即使用細胞。為了產生體外‘有經歷的’T細胞，在用碳酸氫鹽緩沖液(pH 9.6)中的二抗(Vector Labs)預包被孔，然后用100ng/mL的抗CD3(對于人類為OKT3，對于小鼠為2C11，eBiosciences)包被板。用可溶性抗CD28以0.1x10⁶個細胞/孔接種T細胞(對于人為CD28.2，對于小鼠為37.51，eBiosciences)。將細胞在完全TCR刺激下培養3天，然后在條件化培養基中靜置2天，并且在新鮮培養基中靜置2天。在使用前，通過Lympholyte-M(Cederlane)離心收集活細胞并計數。

評估IL-2突變蛋白對缺乏CD25表達或經表達的CD25的T細胞的活性(圖6)。在1ng/ml至1000ng/ml的蛋白質濃度范圍在STAT5磷酸化方面，測定野生型IL-2和6種IL-2突變蛋白的劑量響應關系。IL-2突變蛋白刺激CD25缺陷T細胞中的STAT5磷酸化的能力與其對IL-2Rβ的親和力高度相關。由IL-2突變蛋白引起的STAT5磷酸化的增加比IL-2大兩個數量級。

還評估了IL-2突變蛋白刺激有經歷的人CD4+T細胞上的STAT5磷酸化的能力(圖7)，所述細胞表達大量完全IL-2受體復合物，CD25(IL-2Rα)、IL-2Rβ和γ_c。體外TCR刺激人CD4T細胞并靜置以產生‘有經歷的’人CD4+CD25+T淋巴細胞。在1ng/mL時，幾乎沒有觀察到STAT5磷酸化的差異。每種IL-2變體(包括野生型)刺激超過90％的細胞。在0.1ng/mL下，觀察到小的差異。野生型IL-2導致48％pSTAT5刺激，并且IL-2突變蛋白產生65-79％的pSTAT5刺激。因此，IL-2突變蛋白明顯比野生型IL-2更好地刺激有經歷的人T細胞，但是增強不如在缺乏CD25的細胞上一樣明顯

實施例6：NK細胞細胞毒性測定

使用EGFR(內皮生長因子受體)-表達鱗狀腫瘤細胞系(SCC6)和EGFR單克隆抗體西妥昔單抗評估了D10IL-2突變蛋白對天然殺傷細胞功能，特別是自發和抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(ADCC)的影響。人EGFR陽性鱗狀細胞癌細胞系SCC6作為禮物從J.Sunwoo實驗室(Stanford，CA)獲得。在補充有10％熱滅活的FCS(HyClone Laboratories)、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素(均來自Invitrogen Life Technologies)的DMEM/F12培養基(Invitrogen Life Technologies)中培養SCC6細胞系。在37℃下在5％CO₂中在培養物中粘附生長細胞。西妥昔單抗(小鼠嵌合IgG1抗人表皮生長因子受體-EGFR；IMC-C225；)獲自Bristol-Myers Squibb。

如下進行鉻釋放：從含有約1x10⁹個細胞的健康供體白細胞-減少的系統(LRS)產物中分離NK細胞。通過根據制造商的說明書使用NK細胞分離珠(Miltenyi Biotec)進行陰性磁性細胞分選來分離NK細胞。評估NK細胞的純度(如通過CD3-CD56⁺流式細胞術定義的＞90％純度)。用150μCi⁵¹Cr/1x10⁶個細胞標記SCC6靶細胞2小時。在將純化的NK細胞以0∶1、1∶1和5∶1的可變的效應子∶靶細胞比率⁵¹Cr標記的SCC6細胞在單獨的培養基、西妥昔單抗(100pg/mL)、IL-2(1000IU/mL)、IL-2D10(1pg/mL)、IL-2D10(10pg/mL)、或包括西妥昔單抗(100pg/mL)+IL-2(1000IU/mL)、西妥昔單抗(100pg/mL)+IL-2D10(1pg/mL)或西妥昔單抗(100pg/mL)+IL-2D10(10pg/mL)的組合中培養5小時后測定裂解百分比。一式三份進行測定。在存在或缺乏可變濃度的西妥昔單抗、IL-2或IL-2D10的情況下，用⁵¹Cr標記的SCC6細胞培養純化的NK細胞。NK細胞自發細胞毒性的D10刺激優于高劑量IL-2(圖8，*p＝.008，**p＝.001)，在沒有IL-2或D10刺激的情況下具有最小的自發細胞毒性。與單獨的高劑量IL-2或西妥昔單抗相比，類似地通過D10刺激增加西妥昔單抗結合的SCC6的ADCC(*p＝.0005，**p＝.0001)。值得注意的是，與高劑量IL-2相比，用D10在所有效應子∶靶物比率(包括1∶1)下發生細胞毒性(自發和ADCC兩者)更優的功能性增強。

實施例7：IL-2突變蛋白在對抑制子-類型T細胞(Treg)的相對低刺激的情況下導致增強的記憶表型擴增

在體內評估IL-2突變蛋白H9對表達低水平CD25但高水平IL-2Rβγ的記憶表型CD8⁺T細胞的擴增的效能。C57B1/6小鼠接受PBS、20μg IL-2、20μg H9或1.5μg IL-2/抗IL-2單克隆抗體復合物，并通過流式細胞術評估脾CD3⁺CD4⁺CD44^高記憶表型T細胞的總細胞計數。制備脾細胞懸液，并且用熒光染料-綴合的單克隆抗體CD3(克隆145-2C11，eBioscience)、CD4(克隆RM4-5，Caltag Laboratories)、CD8a(克隆53-6.7，BD Biosciences)、CD25(克隆PC61，BD Biosciences)、CD44(克隆IM7，eBioscience)NK1.1(克隆PK136，BD Biosciences)和Thy1.1(克隆HIS51，eBioscience)染色。使用BD FACSCanto^TM II流式細胞儀獲得至少100,000個活細胞，并使用FlowJo軟件(TriStar，Inc.)分析。如圖10A所示，相對于其它治療形式，用公開的IL-2突變蛋白處理導致記憶表型T細胞的更大的擴增，且CD3⁺CD4⁺CD25^高T細胞調節T細胞的擴增有限(圖10B)。

實施例8：IL-2突變蛋白的降低的體內毒性

已知IL-2治療可以導致嚴重的副作用，如急性肺水腫，其是目前阻止更有效使用IL-2的限制。因此，評估了公開的IL-2突變蛋白相對于IL-2的毒性(圖11A)。C57B1/6小鼠每天接受PBS，20μg IL-2、20μg H9或1.5μg IL-2/抗-IL-2單克隆抗體復合物的腹膜內注射達連續5天。在過繼性細胞轉移后6天，取出肺，并在58℃下在真空下干燥過夜之前和之后稱重。通過從脫水后肺重量減去初始肺重量計算肺濕重。

實施例9：IL-2突變蛋白的增加的體內抗腫瘤活性

在體內測試公開的IL-2突變蛋白對腫瘤細胞的效能。將100μl RPMI中的10⁶個B16F10黑素瘤細胞注射到小鼠背部的上部真皮中(每組3-4只小鼠)。處理由PBS、20μg IL-2、20μg H9或1.5μg IL-2/抗IL-2單克隆抗體復合物(IL-2/mAb)的每日5次注射組成，并在腫瘤結節在約15mm²的大小時清楚可見并且可觸知后一天開始。公開的IL-2突變蛋白導致增強的體內抗腫瘤活性，如圖11B中表明。

實施例10：IL-2突變蛋白和IL-2的結構比較

重組表達幾種IL-2突變蛋白以便通過表面等離子體共振(SPR)測量它們對IL-2Rβ的結合親和力和動力學。IL-2至IL-2Rβ的親和力為K_D＝280nM。IL-2突變蛋白聚簇成低、中和高親和力類別。低親和力IL-2突變蛋白(5-2和6-6)分別以50至70nM的K_D結合IL-2Rβ，從野生型IL-2的4-6倍的親和力增加幾乎完全通過L85V取代。從二級定點文庫選擇的中和高親和力突變體分別具有10-15nM(C5，H4)和1.2-1.7nM(B1，D10，E10，G8，H9)的K_D。以解離速率的降低一致表現親和力增加，并且高親和力IL-2突變蛋白在L80F/R81D/L85V/I86V/I92F的隨機化位置中含有共有序列。

為了理解IL-2突變蛋白的結構結果，將D10突變蛋白以及結合到IL-2Rβ和γ_c的D10的三級復合物結晶。在單獨的D10的結構中，6個突變中的5個在不與IL-2Rβ接觸的位置中聚簇在B-C環上和C螺旋核心內。值得注意的是，B-C螺旋接頭區域與該區域部分或完全無序的其它IL-2結構相比在電子密度圖中是良好排序的(圖9)。總的來說，F80、V85和V86取代似乎塌陷成疏水簇，其穩定環并將C螺旋‘釘’到分子的核心中，從而相對于螺旋B堆積。H74和D81突變是溶劑暴露的，并且因此，它們的結構作用是不太清楚的，然而Asp是可以進一步有助于螺旋C結構的公知的螺旋N-加帽殘基。6個共有突變中僅一個I92F位于與受體復合物中的IL-2Rβ接觸的位置。Phe92深深插入C和A螺旋之間，與Ile92相比僅有助于復合物中被IL-2Rβ掩埋的分子表面的另外因此，其IL-2Rβ接觸可能僅對D10的總體約300倍親和力增加產生較小的貢獻。

還測定了D10三級受體復合物的低分辨率結構以評估突變是否已經擾亂IL-2Rβ/γc受體對接幾何學。將D10和IL-2Rβ的穩定三級復合物結晶，并在缺乏CD25的情況下純化。在D10三級復合物中的總體IL-2Rβ/γc異二聚體構造和細胞因子/IL-2Rβ接觸模式基本上與先前報道的四級裝配體相同。因此，超級-2的效能增加不是由于受體二聚體構造的結構變化導致的，而是可能是由于親和力增強導致的。

如較早討論，IL-2的C-螺旋似乎在結合至IL-2Rα后經歷微妙的復位(repositioning)，如在二級和四級復合物兩者中看到的。相比之下，在PDB數據庫中的三種野生型無配體結構的檢查揭示了C-螺旋位置的可變性，與該螺旋中相對于分子的其余部分的更高B因子一致。進行D10的結構與無配體的IL-2，和受體復合物中的IL-2的結構的比較。觀察到D10中的C螺旋比游離形式更類似于在IL-2的兩種受體結合的構象中看到的，已經經歷上移并進入螺旋核中。

使用分子動力學(MD)模擬詢問IL-2突變蛋白被賦予對IL-2Rβ的更高的結合親和力的機制。構建原子上詳細的馬爾可夫狀態模型(Markov state model，MSM)以直接探測IL-2對IL-2突變蛋白的相對構象柔性。此MSM中的狀態來自由原子論模擬產生的快速相互轉換構象的動力學聚簇。這些亞穩狀態中的每一個對應于潛在的自由能量圖景中的局部最小值，其最終確定系統的結構和動力學。MSM的分析表明IL-2突變蛋白可以比IL-2更穩定，并且IL-2比IL-2突變蛋白訪問幾乎多兩倍的簇。例如，與IL-2的約0.05相比，IL-2突變蛋白填充狀態具有約0.20的平衡概率。與IL-2相比，螺旋B、B-C環和螺旋C在IL-2突變蛋白中是剛性化的。由于進化突變位于B-C環(H74，D81)上，并且在B和C螺旋堆積界面(F80，V85，V86)內，兩個螺旋(不僅僅是螺旋C)受益于突變并且經歷共同的穩定化。F92似乎起螺旋C和螺旋A之間的分子楔的作用，在螺旋的更為C末端起額外的穩定化影響的作用。MD模擬暗示螺旋B也在超級-2中經歷穩定化是一個驚喜，因為這從IL-2晶體結構的比較是不明顯的。IL-2Rα主要在B螺旋和D螺旋的部分上結合至IL-2。MD模擬表明IL-2Rα與IL-2的結合可以使螺旋B剛性化的可能性，并且這種結構穩定化可以傳播到B-C環和螺旋C。原則上，類似于IL-2突變蛋白中的進化突變的表觀效應。

來自每種蛋白質的模擬的最高填充的構象的可視化顯示，螺旋C在IL-2中比在IL-2突變蛋白中遠更有柔性，并且IL-2突變蛋白中的突變也確實穩定受體結合樣構象。

實施例11：部分IL-2激動劑和拮抗劑

先前開發了由于增強的對IL-2Rβ的結合親和力而具有提升作用的IL-2“超級因子”(Levin等人，Nature 484：529(2012))。假設此高親和力超級因子/IL-2Rβ復合物可以充當顯性陰性支架以創建“受體信號傳導夾”，從而阻斷內源信號傳導。這些超級IL-2“完全激動劑”減少與γ_c的結合的定向突變將減弱IL-2Rβ-γ_c異二聚化并且代表新一類的基于機制的IL-2部分激動劑和非信號傳導(中性)分子，所述分子通過阻斷內源性細胞因子并且自身不施加作用而功能性地用作拮抗劑(參見圖1中的示意圖)。

基于IL-2-IL-2R晶體結構，鑒定了IL-2-γ_c界面處的四個關鍵殘基(圖12A)，并且產生了H9變體，每個H9變體含有一個(Q126T)、兩個(L18R，Q22E)、三個(L18R、Q22E和Q126T)或四個(L18R、Q22E、Q126T和S130R)突變(分別表示為H9-T、H9-RE、H9-RET和H9-RETR，基于新引入的氨基酸)。通過表面等離子體共振，重組H9和H9-RET蛋白質對IL-2Rβ具有相似的親和力。然而，盡管H9-IL-2Rβ復合物有效地結合γ_c(圖12B)，但H9-RET-IL-2Rβ不然(圖12C)。

為了測定H9變體的活性，純化NK樣YT-1細胞的CD25⁺和CD25^-亞-群，并定量信號傳導。H9突變體表現為IL-2部分激動劑，產生從STAT5的磷酸化的野生型E_max(最大可能效應)水平的約90％下降到約10％的信號傳導功效的范圍(圖13A)，其中每種類似物的活性的水平與γ_c界面處的突變程度負相關。信號傳導效能相對獨立于IL-2Rα，如通過CD25⁺(圖13B)對比CD25^-(圖13C)YT-1細胞上的H9-RET和H9-RETR的相對E_max值證明，表明了改變的對IL-2Rβ和γ_c的結合主要負責H9變體的行為。

H9-RET和H9-RETR也展現其它IL-2信號傳導途徑的減少的誘導，包括CD25⁺YT-1細胞中的pERK1/ERK2(圖14A)。由于受體內化是信號傳導中的關鍵事件，還評估了響應于IL-2變體的YT-1細胞中的IL-2Rβ和IL-2Rγ的表面表達。與IL-2和H9一樣，H9-RET和H9-RETR兩者都驅動快速和完全的IL-2Rβ內化(圖13B)，但是這些部分激動劑在促進γ_c的內化方面效率低得多(圖13C)，這與它們對γ_c的結合降低一致。因此，可變地破壞H9的γ_c-結合界面可以產生多種IL-2部分激動劑，潛在地具有廣泛的一大批信號傳導功效。

接下來，分析這些分子在原代細胞中的效果。確定H9-RET和H9-RETR都不能在新鮮分離的CD8⁺T細胞(圖13，E和F，上圖)中誘導pSTAT5，所述新鮮分離的CD8⁺T細胞比活化的CD8⁺T細胞表達更少的IL-2β和IL-2Rγ(圖14b，上圖對比下圖)和幾乎無或無IL-2Rα(圖13E，左上圖)。然而，顯著地，在用抗-CD3+抗CD28活化CD8⁺T細胞后，H9-RET可以誘導STAT5(圖13E，右下圖；圖13F，下圖；圖13G)和S6核糖體蛋白(圖13H)(PI 3-激酶信號傳導途徑的成員)的弱/部分磷酸化，而H9-RETR基本上保持惰性。有趣的是，H9-T在新鮮分離的CD8⁺T細胞中顯著誘導pSTAT5(圖13E，右上圖)，并且這在預活化的T細胞中顯著增加，雖然仍然達不到用IL-2、H9或H9-RE觀察到的水平(圖13E，右下圖和圖13G)。因此，H9-T和H9-RET展現出表明真正的部分激動劑的中間活性。

鑒于由H9-RET和H9-RETR誘導的弱pSTAT5表達，進一步研究了這些分子對淋巴細胞增殖的影響。既然IL-2和H9強烈誘導原代CD8⁺T細胞的增殖并且H9-T在其作用中是中間的，H9-RET和H9-RETR都不誘導這些細胞的增殖，如通過羧基熒光素二乙酸琥珀酰亞胺基二酯(CFSE)稀釋(圖15)或通過[³H]-胸苷摻入(圖16A，上圖)評估。然而，當使用預活化的細胞時，H9-RETR仍然沒有效果，但是H9-RET可再現地誘導增殖(圖16B，下圖)，揭示了H9-RET可以在不同的細胞亞群中誘導不同的功能結果，與H9-RET對新鮮分離的對比預活化的CD8⁺T細胞中的pSTAT5的差異影響一致(圖13E)。如預期的，IL-2和H9可以在預活化的CD8⁺T細胞中有效誘導IL-2Rα表達，并且H9-T在其IL-2Rα誘導水平上是中間的，而H9-RET和H9-RETR顯著降低IL-2Rα表達，實際上降低到低于對照水平，推測反映它們與內源性IL-2的有效競爭(圖17)。RNA-Seq接下來用于進一步闡明H9-RET和H9-RETR在預活化的CD8⁺T細胞中的弱作用的基礎(圖16，B和C)。如預期的，IL-2和H9誘導控制細胞周期或參與細胞因子信號傳導的基因(例如CCND2、IL2RA、CISH和CDK6)但抑制許多其它基因(例如IL7R、BCL6)，而H9-RET僅具有弱刺激活性，并且H9-RETR幾乎沒有效果(圖16B和表S1，揭示了完全和部分激動劑信號之間的基因表達的定量和定性差異兩者。IL-2和H9誘導的基因多于它們抑制的基因，而H9-RETR抑制的基因多于它誘導的基因，盡管其總體作用是最小的(圖16C)。由于STAT5是IL-2誘導的轉錄的關鍵介質，染色質免疫沉淀和下一代測序(ChIP-Seq)用于全局評估基因組STAT5結合。H9-RET和H9-RETR-誘導的STAT5與共有TTCnnnGAA基序的結合，但是在比用IL-2或H9觀察到的位點少得多的位點處(圖16D)。基于熱圖聚簇，僅約35％的IL-2誘導的STAT5位點也由H9-RET誘導，而H9-RETR幾乎無影響(圖16E)。通過RT-PCR證實了由IL-2和H9對預活化的CD8⁺T細胞中的幾種STAT5靶基因的誘導(IL2RA、CISH、LTA)或抑制(IL7RA、BCL6)(圖16F)，而H9-RET和H9-RETR都沒有作用，除了有趣的是，與RETR不同，RET再現性地降低了BCL6表達(圖16F)。

上述研究建立了H9-RET的減弱的活性和H9-RETR的可忽略的活性，其有效地是IL-2的顯性陰性拮抗劑。鑒于它們對IL-2Rβ的增強的結合和降低預活化的T細胞上的IL-2Rα表達的能力，假設這些分子將不僅會抑制內源性IL-2，而且還抑制IL-15，其也經由IL-2Rβ和γ_c信號傳導。實際上，H9-RET和H9-RETR兩者都抑制CD8⁺T細胞中的IL-2-誘導的(圖18A)和IL-15-誘導的(圖18B)pSTAT5，其中H9-RETR更有效。通過H9-RET和H9-RETR處理對pSTAT5的抑制與它們將TCR-誘導的(圖17)和IL-2-誘導的(圖19A)CD25表達降低至低于在未刺激的對照細胞中觀察到的那些水平的水平相關。相應地，H9-RET和H9-RETR在預活化的人CD8⁺T細胞中抑制IL-2-誘導的IL2RA mRNA表達(圖19B)以及IL-2-和IL-15-誘導的增殖(圖19C)。

因為H9-RETR抑制IL-2信號傳導，所以推測H9-RETR也會抑制TCR-誘導的細胞增殖，這取決于IL-2，并且情況確實如此(圖20A)并且與減少的CD25表達相關(圖20B)。類似地，由于IL-2可以促進Th1、Th9和Treg分化但抑制Th17分化(Liao等人，Immunity 38：13(2013))，檢查了H9-RET和H9-RETR對這些過程的影響。引人注目的是，H9-RET和H9-RETR兩者都抑制Th1、Th9和Treg分化，但加強了Th17分化(圖21)，從而強調了它們作為IL-2的有效拮抗劑的作用。

H9-RETR也有效阻斷由IL-2對原代人NK細胞的活化，如通過IL-2-誘導的CD69表達(圖22A)和對乳腺癌細胞系HER18(圖22B)和慢性骨髓性白血病細胞系K562(圖22C)的細胞毒性測量。H9-RET和H9-RETR都不刺激原代NK細胞進行的CD69表達或細胞毒性(圖22A)。

實施例12：部分IL-2激動劑和拮抗劑-體內作用

鑒于H9-RETR在體外作為IL-2/IL-15拮抗劑的有效性，我們研究了其在體內拮抗內源細胞因子的作用的能力。由于IL-2具有短的血清半衰期(Boyman等人，Nature Reviews Immunology 12：180(2012))，H9-RETR融合至人IgG4的Fc片段(Fc4)，所述Fc片段是具有降低的抗體依賴性細胞性細胞毒性/吞噬(ADCC/ADCP)的同種型(Strohl，Current Opinion in Biotechnology 20：685(2009))。引人注目的是，與針對CD25的抗-Tac mAb和針對IL-2Rβ的Mikβ1mAb(Morris等人，Proc Natl Acad Sci US A 103：401(2006))相比，H9-RETR-Fc4有效得多地阻斷預活化的人CD8⁺T細胞中的IL-2-(圖18C)和IL-15-介導的(圖18D)pSTAT5誘導，并且抑制IL-2-(圖18E)和IL-15-(圖18F)誘導的人CD8⁺T細胞增殖。重要的是，H9-RETR-Fc4在阻斷IL-2增殖(圖18E)中與抗Tac和Mikβ1的組合一樣有效，并且在抑制IL-15-誘導的增殖中比Mikβ1更有效(圖18F)。

接下來評估H9-RETR-Fc的體內有效性。在穩態條件下，Treg細胞是表達高親和力IL-2受體的原代細胞的主要群體，并且可以起IL-2信號傳導的系統性‘晴雨表’的作用。在施用IL-2或IL-15之前用H9-RETR-Fc4預處理小鼠顯著抑制CD4⁺FoxP3⁺Treg細胞中STAT5的磷酸化，如離體評估(圖23和圖18G)，指示H9-RETR-Fc4作為IL-2拮抗劑的體內潛力。由于IL-2和IL-15信號傳導促成實驗鼠模型中的急性GVHD(Ferrara等人，Journal of Immunology 137：1874(1986)；和Blaser等人，Blood 105：894(2005))，假設H9-RETR-Fc4可以在完全-MHC錯配的骨髓移植的T細胞-介導的C57BL/6-到-BALB/C模型中抑制致死性GVHD。實際上，用H9-RETR-Fc4處理10天的小鼠比用同種型對照Fc4蛋白處理的小鼠具有更長的存活期(P＜0.001)(圖18H)。

人T細胞嗜淋巴細胞病毒-I(HTLV-I)引起成人T細胞白血病(ATL)，即CD4⁺T細胞的惡性擴增，所述CD4⁺T細胞展現出牽涉通過IL-2和IL-15的自分泌信號和通過IL-9的旁分泌信號的早期生長階段。此類細胞因子依賴性增殖在患有慢性和郁積型，但不是急性ATL的患者中是明顯的(Ju等人，Blood 117，1938(2011))。因此，測試了該系統中H9-RETR的功效。首先使用ATL-洐生的細胞系ED40515，其生長在體外通過添加外源IL-2支持。H9-RETR有效抑制這些細胞的增殖，并且優于達利珠單抗和Mikβ1(圖18I)。在那里，接下來使用從具有郁積型ATL的患者新鮮分離的細胞，并在6天測定中測定自發增殖。10μg/ml的RETR比達利珠單抗略有效，并且比Mikβ1有效得相當多(圖18J)，強調其在控制這些強力增殖的惡性細胞中的潛在效用。

部分激動，定義為在配體飽和時減少的信號傳導幅度(E_max)，是通常與靶向GPCR、通道和其它多通跨膜蛋白的小分子相關的藥理學性質。還沒有證明通過I型跨膜受體二聚體響應于蛋白質生長因子、如細胞因子的可調信號傳導(部分激動)的概念。基于結構信息，如下工程化IL-2變體，即通過增強在一個受體結合位點(IL-2Rβ)處的親和力，同時減弱在第二受體結合位點(γ_c)處的相互作用以操縱二聚化和信號啟動。由于增強的IL-2Rβ結合，這些分子相對于內源性IL-2占優勢，并且它們的γ_c相互作用水平設置由細胞察知的信號的強度，從而在部分激動劑的Emax水平上“夾住”信號傳導幅度。使用這些部分激動劑，證明了新鮮分離的對比預活化的CD8⁺T細胞具有IL-2信號傳導強度的截然不同的活化閾值，如通過H9-T和H9-RET對這些細胞的差異作用證明，而H9-RETR(其是一種極弱的部分激動劑，如pSTAT誘導所示)具有顯著的抑制性質，具有作為新一類免疫抑制劑的潛力。特別地，它可以阻斷如離體評估的IL-2Rα誘導，延長在GVHD模型中存活，并且有效地抑制來自患有郁積型ATL的患者的外周血T細胞的自發增殖。除了其對T細胞的影響外，H9-RETR還抑制NK-介導的細胞毒性。考慮到部分激動劑的差異活性，較大的一批IL-2變體可以揭示甚至更寬的獨特信號傳導活性譜，范圍從部分激動到完全拮抗并且潛在地包括對T細胞亞群、如Treg對比效應T細胞具有獨特作用的另外的分子。此外，我們已經使用的合理設計方法可以適合于其它γ_c家族細胞因子，并且實際上也適合于更寬范圍的細胞因子和生長因子。另外的部分激動劑細胞因子類似物潛在可以剖析其它方面多向性免疫途徑的功能并且根據上下文具有獨特的治療益處。

材料與方法

蛋白質表達和純化

分泌人IL-2(氨基酸1-133)及其變體、人IL-2Rβ胞外域(氨基酸1-214)和γ_c胞外域(氨基酸34-232)，并且使用桿狀病毒表達系統純化，如先前所述(Morgan等人，Science 193：1007(1976年9月10日))。簡言之，將所有構建體序列克隆到具有N-末端gp67信號肽和C-末端六組氨酸標簽的pAcGP67A載體(BD Biosciences)中。用質粒構建體轉染在SF900 II SFM培養基(Invitrogen)中在28℃下培養的草地貪夜蛾(Sf9)昆蟲細胞，以建立高滴度重組病毒，隨后將其擴增。用高滴度病毒感染在昆蟲Xpress培養基(Lonza)中于28℃下生長的粉紋夜蛾昆蟲細胞(Invitrogen)以表達重組蛋白(Zhu等人，Annual Review of Immunology 28：445(2010)和W.Liao等人，Nat Immunol 9：1288(2008))。在用重組病毒感染后三天，經由Ni-NTA(Qiagen)親和色譜提取蛋白質、濃縮，并且用在10mM HEPES(pH7.3)和150mM NaCl中平衡的Superdex 200分篩柱(GE Healthcare)進一步純化至＞98％同質性。還通過將人IgG4 Fc結構域(Fc4)或后面有C末端人IgG4 Fc結構域的人IL-2RETR變體(Fc4-RETR)克隆到含有N末端gp67信號肽和C末端六組氨酸標簽的pAcGP67A載體中，使用該桿狀病毒表達系統分泌和純化Fc4和Fc4-RETR融合蛋白。從具有工程化的Ser228 Pro突變的經修飾的pFUSE-hIgG4-Fc載體(Invivogen)獲得人IgG4 Fc結構域(Liao等人，Nat Immunol 12：551(2011))。對于體內實驗，如先前所述(Cheng等人，Immunol Rev 241：63(2011))使用Triton X-114從制備的蛋白質中去除內毒素，并且用LAL生色內毒素定量試劑盒(Thermo Scientific)確認內毒素去除。

對于生物素化的蛋白質表達，表達具有C-末端生物素受體肽(BAP)-LNDIFEAQKIEWHE的γ_c，并經由Ni-NTA(Qiagen)親和色譜純化，然后用0.SmM Bicine pH8.3，100mM ATP，100mM乙酸鎂和500mM生物素(Sigma)中的可溶性BirA連接酶生物素化。通過在10mM HEPES(pH 7.3)和150mM NaCl中平衡的Superdex 200柱(GE Healthcare)上的尺寸排阻色譜純化蛋白質。

表面等離子體共振結合測量

經由在Biacore T100儀器上使用Biacore SA傳感器芯片(GE Healthcare)的表面等離子體共振(SPR)研究表征結合相互作用。以低密度(RU_max＜100個響應單位)將γ_c固定于芯片表面，并將H9：IL-2Rβ或H9-RET：IL-2Rβ復合物的連續稀釋液暴露于表面60秒。然后跟蹤解離200秒。將無關的生物素化蛋白質固定在參考通道中以從測量中減去非特異性結合。在25℃下在補充有0.2％BSA的HBS-P+緩沖液(GE Healthcare)中進行實驗。所有結合研究以30mL/min的流速進行以使質量運輸貢獻最小化并防止分析物的再結合。對于所有測量，假定1∶1 Langmuir結合模型，使用Biacore T100評估軟件2.0版實施數據分析及平衡和動力學參數的測定。

CD25⁺YT-1細胞的組織培養和磁性純化

在RPMI完全培養基(補充有10％胎牛血清、2mM L-谷氨酰胺、最低非必需氨基酸、丙酮酸鈉、25mM HEPES和青霉素-鏈霉素(Gibco)的RPMI 1640培養基)中培養未修飾的YT9(Zhu等人，AnnualReview of Immunology 28：445(2010))和CD25⁺YT-1天然殺傷樣細胞(Liao等人，Nat Immunol 9：1288(2008))。在37℃下在具有5％CO₂的濕潤氣氛中維持這兩種細胞系。

如先前詳述(Liao等人，Immunity 38：13(2013))，經由磁性選擇純化表達或不表達CD25的YT-1細胞的亞群。用FACS緩沖液(含有0.1％牛血清白蛋白的磷酸鹽緩沖鹽水pH 7.2)洗滌1000萬個未分選的CD25⁺YT-1細胞，隨后在4℃下與FACS緩沖液中的PE-綴合的抗人CD25抗體(Biolegend，克隆BC96)孵育2小時。然后將PE-染色的CD25⁺細胞在4℃下用綴合至抗-PE IgG的順磁性微珠標記20分鐘，用冷FACS緩沖液洗滌一次，并根據制造商的方案使用LS MACS分離柱(Miltenyi Biotec)分選。將洗脫的細胞重懸并在RPMI完全培養基中生長，并使用Accuri C6流式細胞儀評價CD25⁺細胞的富集。通過使用PE-綴合的抗人CD25抗體的流式細胞術分析監測分選的CD25⁺YT-1細胞上的CD25表達的持久性。

細胞內磷酸-STAT5和磷酸-ERK1/2的流式細胞術分析將大約2x10⁵個YT或CD25⁺YT-1細胞在96孔板的每個孔中涂鋪，用FACS緩沖液洗滌，并重懸于FACS緩沖液中，所述FACS緩沖液含有IL-2、H9、H9-RET或H9-RETR的連續稀釋液。將細胞在37℃下刺激20分鐘，并立即通過加入甲醛至1.5％固定，然后在室溫下孵育10分鐘。然后將細胞用100％冰冷的甲醇在4℃下透化30分鐘以允許檢測細胞內信號效應物。將固定且透化的細胞用FACS緩沖液洗滌兩次，并在室溫下與在FACS緩沖液中稀釋的Alexa488-綴合的抗-STAT5 pY694(BD Biosciences)或Alexa488-綴合的抗ERK1/2 pT202/pY204(BD Biosciences)孵育2小時。然后將細胞在FACS緩沖液中洗滌兩次，并在Accuri C6流式細胞儀(BD Biosciences)上定量平均熒光強度(MFI)。產生劑量-響應曲線，并且在扣除未刺激細胞的MFI并相對于通過細胞因子刺激誘導的最大信號強度歸一化之后使用GraphPad Prism數據分析軟件計算EC₅₀和E_max值。

人CD8⁺T細胞分離及pSTAT5和pS6-核糖體蛋白的細胞內染色

從來自NIH血庫的健康供體獲得血沉棕黃層(buffy coat)，并使用淋巴細胞分離培養基(Mediatech，Inc.，VA)通過梯度離心分離外周血單核細胞(PBMC)。使用人CD8⁺T細胞分離試劑盒I(Miltenyi Biotec，Germany)分離細胞。對于預活化細胞，用2μg/ml板結合的抗-CD3mAb(BD Biosciences)預包被6孔板。將細胞以1x10⁶個細胞/ml接種于具有1μg/ml可溶性抗-CD28mAb(BD Biosciences)的完全培養基(補充有谷氨酰胺、青霉素、鏈霉素和10％FBS的RPMI培養基)中3天，然后在新鮮培養基中靜置48小時。如先前所述(Liao等人，Immunity 38：13(2013))對原代人CD8⁺T細胞進行劑量響應實驗；簡言之，將細胞用IL-2、H9、H9-RET、H9-RETR的連續稀釋液處理，然后在室溫下用Phosflow Fix Buffer I固定10分鐘(BD Biosciences)，并用FACS緩沖液洗滌一次。然后通過緩慢加入冷的BD PhosflowTM Perm緩沖液III使細胞透化，并在冰上孵育30分鐘。洗滌細胞，并在室溫下在黑暗中用PE-綴合的抗STAT5 pY694(BD Biosciences)或APC-綴合的抗磷酸-S6核糖體蛋白(Ser235/236)(克隆D57.2.2E)染色30分鐘，再次用FACS緩沖液洗滌，并在FACSCanto II流式細胞儀(BD Biosciences)上獲得數據，并使用FlowJo(Tree Star)分析。

STAT5磷酸化的離體分析

C57BL/6小鼠來自Jackson實驗室。動物方案由NHLBI動物護理和使用委員會批準并遵循NIH指南，“Using Animals in Intramural Research”。使用制造商的方案(BD Bioscience)測定STAT5磷酸化。簡言之，將IL-2或IL-15i.p.注射到C57BL/6小鼠中，分離總體脾細胞，立即使用BD Phosphoflow^TM Lyse/Fix緩沖液固定，用冰冷的PBS洗滌兩次，使用抗CD4和抗CD25抗體(Biolegend)染色，然后使用BD PhosFlow Perm緩沖液III在冰上在黑暗中透化30分鐘。然后用冰冷的FACS緩沖液洗滌細胞兩次，用抗FoxP3按照制造商的方案(eBioscience)染色，用冰冷的FACS緩沖液洗滌兩次，并用抗磷酸-STAT5-PE(1：30)(BD)在室溫下在黑暗中染色30分鐘。用FACS緩沖液洗滌細胞三次，并在FACS Canto流式細胞儀(BD)上獲得數據并使用FlowJo(Tree Star)分析。

IL-2受體內化實驗

將IL-2、H9、H9-RET或H9RETR(1μM)與96孔板中的3x10⁵個YT-1細胞孵育2、5、10、15、30、60、90、120、180或240分鐘。將細胞立即轉移到冰上以防止進一步的受體內化，并用冰冷的PBSA緩沖液(PBS中的0.1％BSA)洗滌兩次。在冰上用PBSA緩沖液中的別藻藍蛋白-綴合的抗人IL-2Rβ抗體(TU27；Biolegend)和藻紅蛋白-綴合的抗人IL-2Rγ抗體(TUGh4；Biolegend)的1：50稀釋液同時染色細胞30分鐘。在冰冷的PBSA緩沖液中再洗滌兩次后，將細胞在室溫下用在PBSA中的1.5％多聚甲醛固定10分鐘，最后洗滌一次，并重懸于PBSA緩沖液中。用Accuri C6流式細胞儀定量平均細胞熒光。用Prism軟件包(GraphPad)使用非線性最小二乘方回歸將內化數據擬合成單指數衰減模型。

對IL-2誘導的pSTAT5的抑制

在缺乏或存在H9-RET或H9-RETR的情況下用IL-2刺激新鮮分離的和預活化的人CD8⁺T細胞，并評估pSTAT5水平。將細胞與或不與抗-Tac或Mikβ1或Fc4-H9-RETR孵育1小時，然后用一系列劑量的IL-2或IL-15刺激30分鐘，并通過流式細胞術測量pSTAT5水平。對于NK細胞實驗，在存在或缺乏指定的IL-2變體的情況下用IL-15的連續稀釋液刺激新鮮分離的人NK細胞(NK細胞分離試劑盒II，Miltenyi Biotech)，并評估pSTAT5。

蛋白質印跡分析

在含有1％IGEPAL CA-630(Sigma)的RIPA緩沖液中裂解用或不用細胞因子刺激的細胞。在4至12％Bis-Tris NuPAGE凝膠(Invitrogen)上解析等量的裂解物，轉移至膜，并且將膜與針對pSTAT5(Y694)(Cell Signaling Technology，Inc.，Beverly，MA)或STAT5(BD Transduction Laboratories，San Diego，CA)的抗體在室溫下孵育1小時。用山羊抗兔IgG(H+L)-HRP綴合物(1：5,000稀釋)和用山羊抗小鼠IgG(H+L)-HRP綴合物(1：10,000稀釋)(Biorad)檢測結合的抗體。使用增強的化學發光(ECL，GE healthcare)顯現免疫印跡。在一些實驗中，在室溫下在剝離緩沖液(Millipore)中孵育15分鐘后再使用膜。

CFSE稀釋和EdU增殖測定

在室溫下用PBS中的2.5μM CFSE(Molecular Probes)將新鮮分離或預活化的CD8⁺T細胞(20x 10⁶/ml)標記7分鐘，并立即用100％FBS(2ml/樣品)洗滌一次，然后在完全RMPI中洗滌兩次。在缺乏或存在野生型IL-2、H9、H9-RET、H9-RETR或IL-2+H9-RETR的情況下培養2x10⁶/ml經CFSE標記的細胞。通過在指定時間點的CFSE稀釋的流式細胞術分析來評估細胞增殖。對于EdU增殖測定，如上所述培養預活化的CD8⁺T細胞。在收獲前16小時，添加10mM EdU，如指示對細胞進行表面抗原染色，然后根據制造商的方案(BD Biosciences)進行細胞內EdU染色。通過流式細胞術評估細胞增殖。

ED40515細胞和來自患有郁積型ATL的患者的細胞的增殖

用PBS洗滌IL-2-依賴性ED40515(+)(Lenardo，Nature 353：858(1991))細胞兩次。將細胞以1x10⁴個細胞/100μl/孔的具有或沒有IL-2和具有或沒有試劑的RPMI 1640培養基接種到96孔板中，然后在37℃下孵育3天。

來自ATL患者的血液樣品在Clinical Trials Team，Lymphoid Malignancies Branch，NCI，NIH的護理下獲得。本研究方案由美國國家癌癥研究所的機構審查委員會(Institutional Review Board of National Cancer Institute)批準。根據赫爾辛基宣言獲得知情同意。來自ATL患者的外周血單核細胞(PBMC)通過Ficoll-Hypaque密度梯度離心從它們的肝素化血液中分離。將1x10⁵個細胞/100μl/孔的等分試樣在補充有10％FBS且具有或沒有試劑的RPMI 1640培養基中離體培養6天。

在培養的最后6小時期間，用1μCi(0.037MBq)[³H]胸苷脈沖ED40515(+)細胞或ATL PBMC，然后用細胞收獲器(Tomtec，Hamden，CT)收獲細胞，用MicroBeta2微板計數器(PerkEmer)計數。該測定一式三份進行。

NK細胞的活化

將外周血單核細胞(PBMC)在1μg/mL IL-2類似物存在下培養24小時。然后用APC-綴合的抗-CD56(BD Biosciences)、Pacific Blue-綴合的抗-CD3(BioLegend)和FITC-綴合的抗-CD69(BD Biosciences)對細胞染色。使用FACSAria II(BD Biosciences)通過流式細胞術分析樣品。NK細胞門控為CD3陰性，CD56陽性。

使用Ficoll-Paque Premium(GE Life Sciences)通過梯度離心分離PBMC，然后使用人類NK細胞分離試劑盒(Miltenyi)純化未接觸的NK細胞，隨后使用autoMACS(Miltenyi)分離。每1x10⁶個細胞用150μCi ⁵¹Cr(Perkin Elmer)標記HER18靶細胞2小時。將NK細胞以10∶1效應子：靶物比率添加到10,000個HER18細胞。在不同濃度的IL-2類似物存在下培養4小時后測定特異性裂解。

通過原代NK細胞對K562細胞的裂解如描述進行(Yuan等人，Immunol Rev 259，103(2014))。簡言之，使用人NK分離試劑盒(STEMCELL)純化未接觸的人NK細胞。用PKH67綠色熒光細胞接頭試劑盒(SigmaAldrich)標記K562細胞，將NK細胞以10∶1比率添加到5,000個K562細胞，在不同濃度的IL-2類似物存在下在37℃下培養4小時，并置于冰上以防止進一步的反應性。然后用碘化丙啶(PI)(Sigma-Aldrich)對細胞染色，并通過流式細胞術測定PI⁺PKH67⁺K562細胞的百分比。

T輔助極化和胞內細胞因子染色

在缺乏或存在指定的細胞因子的情況下，在不同的T輔助極化條件下分化首次接觸實驗的CD4⁺C57BL/6T細胞。4天后，首先針對如指定的表面抗原對細胞染色，然后用在BD細胞固定(cytofix)和細胞透化(cytoperm)中的針對IFNγ(eBioscience)，IL-17A(eBioscience)、IL-4(BioLegend)、IL-9(BioLegend)或FoxP3(eBioscience)的抗體，或eBioscience FoxP3染色緩沖液試劑盒，根據制造商的方案染色細胞。使用FlowJo軟件(Tree Star，Inc)在FACSCanto II流式細胞儀(Becton Dickinson)上分析染色的細胞。所有小鼠細胞因子來自Peprotech。

RNA-Seq分析

將預活化的人CD8⁺T細胞在完全培養基中靜置兩天，用1μg/ml野生型IL-2、H9、H9-RET或H9-RETR刺激24小時，并且分離來自5x10⁶個細胞的總RNA(RNeasy試劑盒，Qiagen，Valencia，CA)。匯集來自5個供體的RNA，并使用1μg匯集的RNA合成cDNA。如先前所述(Liao等人，Immunity 38：13(2013)，制備RNA-seq文庫。使用Illuminna HiSeq2000平臺對PCR擴增產物進行條形碼化并測序。使用Bowtie 0.12.4(Leonard，Nature Reviews.Immunology1：200(2001))將測序讀段與人類基因組(hg18，NCBI版本36.1)比對。保留獨特定位的讀段，并且使用RPKM(每百萬定位讀段每千堿基的讀段)計算基因的數字表達水平。使用R包edgeR鑒定差異表達的基因，并且在未處理或用IL-2變體處理24小時的細胞之間比較倍數變化(以log2標度)差異。

ChIP-Seq文庫制備和分析

將預活化的CD8⁺T細胞用不同的細胞因子處理90分鐘，然后用1％多聚甲醛化學交聯。將來自1-2千萬個細胞的染色質超聲處理成250-500bp的片段，用抗-STAT5B(Invitrogen)免疫沉淀，并且處理以進行測序，如先前所述(Noguchi等，Cell 73：147(1993))。使用Bowtie 0.12.4(Leonard，Nature Reviews.Immunology 1：200(2001))將所有讀段與人類基因組(hg18，NCBI版本36.1)比對。將獨特定位的讀段轉換為瀏覽器可擴展數據(BED)文件，并且過濾重復讀段(相同基因組位置中的多個讀段)。然后，將過濾的(非冗余的)BED文件轉換成二進制數據(binary tiled data)(.tdf)，并使用Integrative Genome Viewer(Broad Institute)可視化。

通過RT-PCR進行的基因表達分析

使用RNeasy Plus微型試劑盒(Qiagen)分離總RNA，并且與寡聚物dT(Invitrogen)和Omniscript逆轉錄試劑盒(Quiagen)一起使用200ng以合成cDNA。使用ABI 7900HD序列檢測系統進行定量RT-PCR。RT引物和探針來自Applied Biosystems。相對于RPL7歸一化表達水平。

對同種異體宿主的骨髓移植

將來自NCI-Frederick癌癥研究室(Cancer Research Facility)的7周齡雌性C57BL/6(H₂K^b)和BALB/c(H₂K^d)小鼠維持在無特定病原體的設施中，并根據由NCI動物護理和使用委員會批準的批準動物方案處理。用950cGy全身輻照條件化BALB/c小鼠，然后用單獨的或與200萬個經Treg消耗的泛-T細胞一起的來自C57BL/6小鼠的1000萬個T細胞消耗的骨髓細胞重建。使用來自Miltenyi Biotec的試劑盒，用抗CD90[Thy1.2]微珠(總T細胞消耗)或抗CD25(Treg消耗)進行T細胞消耗。另外，用Fc4或H9-RETR-Fc4(100μg i.p.兩次/天，持續10天)處理接受泛-T細胞的小鼠。全身輻照后，飲用水從第-1天至第+14天補充環丙沙星。監測存活和體重減輕。根據Kaplan-Meier法分析存活，并使用對數秩檢驗比較存活曲線。使用GraphPad Prism 4軟件進行統計分析。

其它實施方案

應當理解，雖然本發明已經結合其詳細描述進行了描述，但是前面描述旨在說明而不是限制本發明的范圍，其由所附權利要求書的范圍限定。其它方面、優點和修改在所附權利要求書的范圍內。例如，盡管在整個說明書中提及IL-2，但是本領域技術人員將理解，本文中所述的方法和組合物同樣適用于具有此特性的其它細胞因子，例如粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、IL-2、IL-3、IL-5、IL-6或IL-15。因此，本發明還包括與野生型相比對其各自的受體具有增加的結合親和力的GM-CSF、IL-2、IL-3、IL-5、IL-6和IL-15的突變體，以及用于鑒定和使用那些突變體的方法。