穩定用于冷凍儲藏的重組蛋白液體溶液的方法
【專利摘要】本發明涉及穩定用于冷凍儲藏的重組蛋白液體溶液的方法。本發明涉及一種穩定用于冷凍儲藏的重組蛋白本體溶液的方法，其包括提供部分純化的具有至少100mM單價鹽濃度的重組蛋白溶液，和以足以使溶液在冷凍后具有-56℃或更高玻璃轉化溫度的量向所述溶液中加入碳水化合物。
【專利說明】穩定用于冷凍儲藏的重組蛋白液體溶液的方法
[0001]本申請是申請號為200880013538.9、申請日為2008年4月22日的發明專利申請
的分案申請。
[0002]本申請要求2007年4月26日提交的，臨時專利申請60 / 926，698的權益，其公開內容引入作為參考。
【技術領域】
[0003]本發明涉及重組蛋白液體溶液、優選本體溶液的冷凍和儲藏。
【背景技術】
[0004]在細胞培養物中生產重組蛋白通常包括一系列的純化步驟，通過這些步驟從重組宿主細胞和/或相關培養基中回收所需的蛋白產品。許多重要的重組蛋白采用大工業規模進行生產。對藥物蛋白而言，例如，為了獲得所需水平的產品純度，使用一個以上的純化步驟并不罕見。
[0005]在最終純化以用于制劑之前，儲藏已初始純化過但未最終純化的重組蛋白的本體溶液可能是必需的。例如，重組發酵反應的含蛋白產物可在親和柱或離子交換柱中初始純化。在最初通過柱后，蛋白產物僅是部分純化的，溶液仍然包含例如細胞培育殘留物和其他蛋白的污染物。在最終配制形成藥物產品之前，本體溶液必須進一步處理以得到滿意純度的蛋白。
[0006]通常，用于從首次通過純化處理中回收蛋白的溶液，例如洗脫緩沖液，是高鹽溶液。對于柱洗脫液，需要高鹽濃度來從柱上釋放蛋白。因此，從首次通過純化處理中回收的“本體”溶液可能包含具有高濃度單價鹽的溶液，該單價鹽通常是氯化鈉，但也可能是氯化鉀或其他鹽。
[0007]由于溶液的高鹽濃度和非常低的蛋白濃度，對重組蛋白“本體”溶液的儲藏提出了獨特的挑戰。理想地，蛋白儲藏在低于玻璃轉化溫度下以確保穩定，因為在玻璃態時，在制藥期間蛋白的失活和變性非常緩慢。另一方面，溶液中高濃度鹽的存在往往會降低其玻璃轉化溫度，并且在具有高鹽濃度和低蛋白濃度的溶液中，需要非常低的溫度來實現這種狀態。
[0008]出于成本和效率原因，但同時需要保持蛋白的穩定性和活性，需要在較高溫度下冷凍儲藏大體積量的本體溶液。
【發明內容】
[0009]發明概沭
[0010] 本發明是穩定用于冷凍儲藏的重組蛋白液體溶液的方法，其包括:提供重組蛋白的溶液，其中所述溶液具有至少IOOmM的單價鹽濃度，例如NaCl和/或KCl ;以足以使溶液在冷凍后具有_56°C或更高玻璃轉化溫度的量向所述溶液中加入碳水化合物，和冷凍用于儲藏的所述溶液。[0011]本發明還提供重組蛋白的液體溶液，將其穩定化以便冷凍儲藏，該溶液包括足以使溶液在冷凍后具有-56 V或更高玻璃轉化溫度的量的碳水化合物。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0012]圖1顯示了向重組因子VIII本體溶液中加入碳水化合物，并且帶有或不帶有本文中描述的其他輔料對保持重組蛋白活性的影響。四種不同的制劑指定為F1、F2、F3和F4。在冷凍和在-30°C下儲藏后在所示的不同時間點測定因子VIII的活性，直至24周。在加入碳水化合物前，除了如本文所述進行稀釋的F3，本體溶液包括約600mM NaClUOmM CaCl2,20mM咪唑和0.1 %聚乙二醇辛基苯基醚(triton X-100)。以時間對凝固能力(1U / mL)作圖。
[0013]圖2顯示了在冷凍和在_70°C和_30°C儲藏后圖1所示的但是不含穩定化輔料的實驗中所用的本體因子VIII溶液的重組因子VIII活性的損失。標示“ln2至-70°c”表示在儲藏于-70°C前樣品在液氮中冷凍，"LN2至-30°c”表示在儲藏于-30°C前樣品在液氮中冷凍。“EVA至-70°C ”表示樣品在聚合物儲藏包中冷凍并儲藏于_70°C。
[0014]優選實施方案的描述
[0015]重組蛋白的液體溶液可以包含使用親和層析、離子交換色譜或類似方法從重組細胞培養物中獲得的任何重組蛋白的溶液。在優選的實施方案中，溶液是本體溶液，其包括部分純化的溶液。在所有實施方案中，液體溶液是高鹽溶液，優選水溶液。
[0016]重組蛋白包括，例如但不限于，凝血因子、病毒抗原、細菌抗原、真菌抗原、原蟲抗原、肽類激素、趨化因子、細胞因子、生長因子、酶類、血蛋白類如血紅蛋白、α-1-抗胰蛋白酶，纖維蛋白原、人血清白蛋白、凝血酶原/凝血酶、抗體、血液凝固和/或凝血因子，和其生物學活性片段；如因子V、因子V1、因子VI1、因子VIII和其衍生物，例如B-域缺失的因子VII1、因子IX、因子X、因子X1、因子XI1、因子XII1、菲萊徹(Fletcher)因子、菲茨杰拉德(Fitzgerald)因子和von Willebrand因子；乳蛋白質類例如酪蛋白、乳鐵蛋白、溶菌酶、α-1抗胰蛋白酶、蛋白因子、免疫蛋白，和其生物活性片段；和抗體，包括單克隆抗體、單鏈抗體、抗體片段、嵌合抗體、人源化抗體，和其他能于重組細胞培養物中產生的抗體變異分子。
[0017]當前優選的重組蛋白是重組因子VIII，本文應用的因子VIII包括因子VI11工程改造的的變體，如因子VIII的B-域缺失的變體。
[0018]在本發明意義上“本體”溶液包括部分但未完全純化的重組蛋白的液體溶液，其包括至少IOOmM的單價鹽。單價鹽優選為通常用于從純化柱上洗脫重組蛋白的NaCl。然而，NaCl可以被KCl全部或部分地替換。本體溶液也可以包括不同量的其他鹽，如包括氯化鈣在內的二價鹽。
[0019]“部分但未完全純化”是指液體溶液已經經過至少一次純化步驟，但液體溶液仍然包含大量的殘留雜質，在最終產品制劑之前需要至少一次進一步的純化步驟。例如，重組因子VIII的“本體”溶液在最 終制劑之前必須進一步純化，在因子VIII和其他蛋白質的情況下該純化可以包括凍干法。
[0020]液體溶液包括至少IOOmM單價鹽,優選IOOmM NaCl,更優選至少300mMNaCl,更優選至少500mM NaCl，更優選至少560mM NaCl和再更優選至少600mM NaCl。重組蛋白的本體溶液在初始的純化步驟后具有如此高單價鹽濃度并不罕見。
[0021]在本發明進一步的實施方案中，液體溶液包含100-200mMNaCl、100-300mMNaCl、200-300mMNaCl、100_400mMNaCl、100_500mMNaCl、100-600mMNaClU00-800mM NaCl、300-500mM NaCl、300_600mM NaCl、300_800mM NaCl、400_600mM NaCl、400_800mM NaCl、500-600mM NaCl、560-700mM NaCl 和 500-800mM NaCl。
[0022]本發明的“本體”溶液特征還在于其非常低的蛋白濃度。在本發明的實施方案中，本體溶液中重組蛋白的濃度可以低至0.0001微摩爾、0.001微摩爾或0.01微摩爾。在本發明的實施方案中，本體溶液中重組蛋白的濃度可以高達10微摩爾、I微摩爾或0.1微摩爾。在這些上下限度任意組合內的任何濃度的蛋白質都是本發明意義上的“本體”溶液的具體實施方案。
[0023]在冷凍前向液體溶液中加入碳水化合物，其量足以使溶液在冷凍后具有_56°C或更高的玻璃轉化溫度，更優選至少_34°C，或任何介于其間的用整數或分數表示的溫度。高鹽、低蛋白本體溶液的標準玻璃轉化溫度基本上低于-56°C，例如，-60至-70°C。提高玻璃轉化溫度至_56°C所需加入的碳水化合物的量需要將蛋白濃度作為一個因素加以考慮。更高的蛋白濃度往往會自身提高本體溶液的玻璃轉化溫度。作為另外的因素，碳水化合物的量不應過多地增加溶液的粘度，且優選保持粘度低于約9.0cp。溶液的電導系數會通過加入碳水化合物而改變，優選地，保持低于約39mS / cm。
[0024]在本發明的上下文中，冷凍溶液是指冷凍本體液體溶液，并且要區別于包含不同技術考慮的冷凍干燥。
[0025]碳水化合物可 以為藥物制劑中通常使用的類型的碳水化合物，包括糖類和二糖、寡聚糖和多糖。實例包括右旋糖酐、環糊精、殼聚糖、淀粉、透明質酸、纖維素、棉子糖、麥芽糖、乳糖、水蘇糖和其組合。優選的實例是批準用于注射的碳水化合物，包括蔗糖、海藻糖、羥乙基淀粉、右旋糖酐，或其組合。藥用級的碳水化合物能夠從許多供應商那里購買到。
[0026]可以容易地確定冷凍中為了保護溶液所需要的碳水化合物的精確量，例如通過示差掃描量熱法，并且該精確量取決于特定的蛋白和特定的碳水化合物。基于液體溶液的重量，一般優選的碳水化合物的量是8-25% (w / W)。
[0027]在本發明的具體實施方案中，基于液體溶液的重量，碳水化合物的量是約8-15%、12-20%、16-20%、15-25%和 20-25% (w / w)。
[0028]來源于初始純化(例如洗脫)的其他成分可以存在于本體溶液中，包括表面活性劑(例如吐溫80或聚乙二醇辛基苯基醚)、氯化鈣或咪唑。其他輔料可以加入到液體溶液中。如下面的制劑所示，附加表面活性劑可以作為賦形劑加入。氨基酸(例如甘氨酸)可以作為另外的賦形劑加入。
【具體實施方式】
[0029]實施例
[0030]使用示例性的重組蛋白、重組因子VIII舉例說明本發明。重組因子VIII通過本領域已知方法生產，例如US專利號5，576，194 ;5，804，420 ;和5，733，873中所描述的。在優選的實施方案中，在哺乳動物細胞中，在大規模的發酵反應器內于不含血清和/或不含蛋白的培養基中生產重組因子VIII。優選通過重組細胞將重組因子VIII分泌到介質中。[0031]通過宿主細胞表達重組因子VIII (全長)并通過膜吸附色譜從凈化的組織培養物液體中純化。膜吸附器處理通過結合和洗脫從細胞培養物液體中分離和濃縮重組因子VIII (通常如 Suck 等，J.Biotechnology, 121 =361-367,2006 中所述)。洗脫液分成四批并且將每批轉移到無菌瓶中(每瓶400mL)。除了因子VIII和殘留的雜質外，洗脫液(本體溶液)含有約600mM NaClUOmM CaCl2、20mM咪唑和0.1 %聚乙二醇辛基苯基醚(TritonX-100)。洗脫液中重組因子VIII的濃度為大約0.067微摩爾。
[0032]隨后，在室溫下以如下表1中制劑1、2、3和4所示的量將碳水化合物或碳水化合物的組合，連同其他所示的輔料加入到每個瓶子中。
[0033]表1
[0034]
【權利要求】
1.一種被穩定的用于冷凍儲藏的重組蛋白的本體液體溶液，其包含至少IOOmM的NaCl和/或KCl濃度和0.0001-1.0微摩爾的重組蛋白濃度，包括足以使溶液在冷凍后具有_56°C或更高玻璃轉化溫度的量的碳水化合物，其中碳水化合物是以8-25%溶液的重量存在的。
2.如權利要求1所述的重組蛋白的本體液體溶液，其中所述液體溶液包含至少IOOmM的NaCl濃度。
3.如權利要求1所述的重組蛋白的本體液體溶液，其中所述碳水化合物選自蔗糖、海藻糖、羥乙基淀粉、右旋糖酐和它們的組合。
4.如權利要求1所述的重組蛋白的本體液體溶液，其中所述液體溶液包含至少300mM的NaCl濃度。
5.如權利要求1所述的重組蛋白的本體液體溶液，其中所述液體溶液包含至少600mM的NaCl濃度。
6.如權利要求1所述的重組蛋白的本體液體溶液，其中所述重組蛋白是因子VIII或其衍生物。
7.如權利要求1所述的重組蛋白的本體液體溶液，其中所述玻璃轉化溫度在_56°C和_35°C之間。
【文檔編號】A61K38/37GK103990116SQ201410074690
【公開日】2014年8月20日 申請日期:2008年4月22日 優先權日:2007年4月26日
【發明者】N.奇韋特科瓦, O.喬施, P.吳, 汪德潛, A.德斯蓬 申請人:拜爾健康護理有限責任公司