人隱花色素蛋白I（hCRY1）的重組表達方法及其在制備放療保護劑中的應用的制作方法
【專利摘要】本發明涉及人隱花色素蛋白I（hCRY1）的重組表達方法及其在制備放療保護劑中的應用，所述方法包括hCRY1蛋白在原核生物中的重組表達、純化、活性及功能性檢測等步驟，通過該方法平均每升菌液可收獲hCRY1約20-25mg，產率遠高于目前已知的其他方法，而成本經計算遠低于真核表達純化方法以及化學合成多肽方法。并且由本方法純化獲得的蛋白產物經驗證具有射線吸收和放射損傷防護功能，是具有開發成為放療保護類藥物潛質的活性蛋白，可用作放療保護劑。
【專利說明】人隱花色素蛋白丨(hCRYl)的重組表達方法及其在制備放療保護劑中的應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及hCRYl蛋白的重組表達方法及其在制備放療保護劑中的應用。
【背景技術】
[0002]癌癥是人類健康的最大敵人，全世界每年死于癌癥的人數接近1000萬人。在癌癥的臨床治療中，手術、放療及化療是三種最主要的治療方法，其中放療因其適應癥比較寬泛，選擇性較大，70%以上的惡性腫瘤患者在其治療的某個階段都需要接受放療。
[0003]放射治療的目的是最大限度地將放射劑量集中到病變區(靶區)內，殺滅腫瘤細胞，而周圍正常組織或器官少受或免受不必要的照射，一些重要器官如腦干、晶體、脊髓、腎、性腺等，則需要特別保護。無論是傳統放療技術還是現代精確放療技術，都不能做到在治療腫瘤的同時完全保護正常組織，例如需要照射的腫瘤周圍存在較多的重要器官或正常組織；腫瘤與正常組織或重要器官相互交錯；腫瘤組織包繞重要器官等。因此，尋找一些盡可能地保護正常皮膚、組織、器官的方法就成為了放療過程中減輕患者痛苦、提高治療效果的關鍵所在。為此本專利申請表達并純化了重組hCRYl——一種具有修復紫外照射損傷功能的蛋白質，并初步驗證了該蛋白在射線吸收、紫外損傷防護中的作用。
[0004]現代時間生物學認為，在自然界中從單細胞動物到高等生物，以及人類的所有生命活動均存在著按照一定規律運行的、周期性的生命活動現象。經過大量的實驗研究證明，這種生命活動現象是明顯的節律性活動，稱為生物節律。1993年所發現的隱花色素基因(Cry)就是目前人們所發現的節律基因之一。隱花色素是一種能夠感受藍光和近紫外光(330-390nm)區域的光受體，在幾乎所有種類的植物中都有所發現，同時在昆蟲、哺乳動物中都有編碼隱花色素的同源基因。不同種類的隱花色素都是由接受光信號的生色團和應答光信號的脫輔基蛋白組成，脫輔基蛋白部分共有兩個結構域。其中位于N端的PHR結構域是高度保守的，該結構域與光裂解酶十分相似，是生色團的結合區域，但其卻并不具有光裂解酶活性；而(:端的DAS結構域則是一個在不同物種中長度變化較大的非保守區域，一般負責信號的輸出。
[0005]迄今為止，動物體內所發現的隱花色素主要有CRYl和CRY2兩種，它們與光裂解酶家族共同調節生物體對于紫外線和藍光小劑量照射的適應性反應，參與DNA光修復的調控，并與動物的生長、發育、磁感知及生理節律均有著密切的聯系。與CRY2相比，CRYl參與的更多是光依賴型轉錄抑制，它與Bamll/CLOCK蛋白二聚體、Perl等節律相關蛋白直接作用，并在節律性生理周期中直接起負調控作用。
[0006]紫外、X-ray等射線照射會導致細胞中產生DNA雙鏈斷裂，DNA雙鏈斷裂誘導細胞產生H2AX FOCI，后者在DNA雙鏈斷裂的修復中起重要作用，因此本實驗通過免疫熒光的觀察和量化細胞內H2AX FOCI的熒光強度來檢測細胞的損傷程度，并進一步證實了 hCRYl在放射損傷防護中的功能。
[0007]由于動物中天然狀態的CRYl含量低，分離獲得大量天然產物十分困難。而多肽合成成本過高，缺乏作為藥物生產的應用前景。迄今為止，亦無文獻報道過動物CRYl蛋白的原核表達純化方法。因此本研究探尋了一套原核表達純化hCRYl的技術路線，通過構建其原核表達載體pET28a(+)-hCRYl，在E.coliBL21 (DE3)中表達，并分離純化出較高純度的具有射線吸收及紫外損傷防護活性的重組蛋白，為進一步研究hCRYl提供了便利條件，也為將hCRYl開發成為新的放療保護劑提供了理論基礎。
【發明內容】
[0008]本發明涉及一種重組hCRYl蛋白的表達方法，特別涉及一種重組hCRYl蛋白的原核表達方法。
[0009]本發明的重組hCRYl蛋白的原核表達方法包括以下步驟:構建表達質粒，誘導重組蛋白表達，純化重組蛋白，重組蛋白活性及功能檢測。
[0010]其中優選的，上述構建表達質粒的步驟包括:將hCRYl連接入原核表達載體，如pET28a(+)。具體為:通過PCR擴增獲得hCRYl基因，再與載體pET28a(+)分別用限制性內切酶XhoI與BamlI酶切后用T4DNA連接酶連接，最終獲得重組表達質粒pET28a (+) -hCRYl。其中，優選的，hCRYl蛋白如SEQ ID N0:1所示。
[0011]其中優選的，上述誘導重組蛋白表達的步驟包括:將構建好的表達質粒轉入宿主細胞后誘導表達，其中宿主細胞優選E.coli BL2KDE3);其中優選在轉入宿主細胞后，通過SDS-PAGE篩選表達量高的克隆細胞。具體為:將pET28a(+)-hCRYl轉入感受態細胞E.coli BL2KDE3)中并涂板培養，次日挑數個(5個)不同的單菌落克隆分別接入含卡那霉素的LB培養基中，搖菌過夜后以1:100轉接到新鮮的含卡那霉素的LB培養基中進行放大培養；于三角燒瓶中搖菌并誘導6h后離心收菌；將所收菌體用PBS洗滌并重懸，加入蛋白酶抑制劑PMSF后進行超聲破碎；從每份破碎樣品中取20 μ I樣品進行SDS-PAGE分析，挑選出目標蛋白條帶較亮、雜蛋白條帶較弱(即表達量高)的克隆，_80°C保菌儲存并命名為BL21-hCRYl-b。
[0012]其中優選的，上述純化重組蛋白的步驟包括，將誘導表達的菌株破碎，離心，獲得包涵體，再將包涵體復性，經純化后獲得有活性的重組蛋白。其中，包涵體復性的步驟包括:洗漆包涵體，溶解包涵體，梯度透析，復性。具體為:用20ml新配置的包涵體洗漆液(溶液A)將包涵體重懸,離心保留沉淀；于洗漆后的沉淀中加入20ml新配置的包涵體溶解液(溶液B)，先將沉淀吹打成小塊，再進行超聲破碎助溶，破碎完畢后放置于24°C搖床、IOOrpm溶解2h，溶解完畢后離心分離并保留上清，沉淀則再用適量溶解液重復上述步驟溶解，直至沉淀體積不再明顯減少；將蛋白溶液裝入透析袋中，于5L燒杯中用2L含6M尿素、50mMTris-base、50mM NaCl的透析液透析，并逐漸將透析液中尿素濃度降至3M ;將裝有蛋白溶液的透析袋從之前的透析液移至4L蛋白復性液(溶液C)中，于4°C環境室中攪拌透析24h ;此后再將裝有蛋白溶液的透析袋移入2L上樣緩沖液(溶液D)中于4°C環境室中攪拌透析，直到透析袋內有明顯的白色絮狀析出且數量不再增多(約24-48h)。其中，包涵體洗滌液(溶液 A)的配比為:50mM Tris_base、0.5mM EDTA、50mM NaCl、l%Triton X_100、2M 尿素，用NaOH調節pH至8.0 ;包涵體溶解液(溶液B)的配比為:50mM Tris_base、0.5mM EDTA,50mM NaCl、8M尿素、ImM PMSF，用NaOH調節pH至8.0，蛋白復性液(溶液C)的配比為:100mMTris-base、400mM精氨酸、2M尿素、5mM EDTA、5mM GSH、0.5mM GSSG，用 NaOH調節 pH至 8.0 ；上樣緩沖液(溶液D)的配比為50mM Tris-base、50mM NaCl，用NaOH調節pH至8.0。其中，純化的步驟包括:鎳柱純化后，超濾置換。鎳柱純化的操作過程具體為:將透析后的蛋白液離心保留上清，用IOKD超濾管濃縮蛋白體積，于4°C環境室中上樣于預先用溶液D平衡好的Iml純化鎳柱中，收集流穿液并將其再次上樣，重復多次以保證目的蛋白與鎳柱充分結合，之后用上樣緩沖液洗柱，將純化柱側壁上的殘留樣品洗凈，用IOml含有40mM咪唑的上樣緩沖液洗去純化柱上結合的雜蛋白之后，再用IOml含有200mM咪唑的上樣緩沖液洗脫目標蛋白，多次重復洗脫，以保證洗脫效率。超濾置換的操作過程具體為:將上步所得的蛋白樣品稀釋后，再用IOkD超濾管濃縮進行超濾置換，重復多次，以去除洗脫液中咪唑，最后將蛋白溶液濃縮至5ml。[0013]其中優選的，上述重組蛋白活性及功能檢測的步驟包括，利用胞內FOCL熒光強度來檢測hCRYl蛋白的功能性。具體為:將純化獲得的hCRYl與經過處理的BSA(對照蛋白)分別以相同濃度加入含有Hela細胞的培養基中,X-ray照射后,先后用抗體Phospho-HistoneH2A.X、山羊抗兔IgG/FITC孵育細胞后，制片觀察，在完全相同的觀察條件下，肉眼可見兩組細胞中形成的FOCI熒光強度差異十分顯著。其中對BSA的處理為用咪唑配置一定濃度的BSA，經鎳柱上樣流出以及與hCRYl樣品處理時完全相同的超濾置換后，稀釋至與hCRYl濃度相同作為對照(cBSA)。
[0014]此外，為進一步證實細胞內FOCI的減少是由于hCRYl的射線防護作用，在HaCaT細胞中進行hCRYl濃度梯度實驗并設立未經X-ray照射的對照組，結果表明，當細胞培養基中的hCRYl濃度達到50μ g/ml時，FOCI的熒光強度明顯降低。此外，還分別檢測了 hCRYl和對照BSA對細胞凋亡的影響，分別用相同濃度的hCRYl和處理后的BSA處理兩組相同細胞，Ih后與另一組未加任何蛋白的細胞一起檢測細胞凋亡情況，用細胞凋亡檢測試劑盒對細胞進行雙染后用流式細胞儀進行分析；結果表明Ih之內，不論是hCRYl還是BSA都不會造成細胞凋亡，該結果進一步證明FOCI熒光強度的降低是因為細胞內DNA所受損傷的減少而非細胞的凋亡。
[0015]目前，大腸桿菌表達系統廣泛用于重組蛋白的生產，其優點是表達水平較高、操作簡單。本研究選用pET28a(+)作為表達載體，通過上述原核表達純化方法，平均每升菌液可收獲hCRYl約20-25mg，產率遠高于目前所已知的其他方法，而由于該原核表達純化方法所需要的培養基及后續純化原料相對廉價，成本經計算遠低于真核表達純化方法和化學合成多肽方法。在大規模生產應用中，該方法提供了復性原料進行重復利用的可能性，這也將極大地降低成本。另外此方法操作過程簡單，容錯率高，操作人員不需要大量的專業知識即可進行生產工作。并且由本方法純化獲得的蛋白產物經驗證具有預期的射線吸收功能和放射損傷防護活性，是具有開發成為放療保護類藥物潛質的活性蛋白。
[0016]由于通過實施例驗證了添加有hCRYl的細胞在受到射線損傷時所產生H2AX FOCI明顯減少，并且該減少并非由hCRYl對細胞造成了損傷所引起的，因此可以證實hCRYl對細胞有紫外損傷防護作用。因此本發明制備的重組hCRYl可用作放療保護劑，如制備成放療保護劑類藥物，特別是皮膚放療保護劑。本發明還提供一種組合物，該組合物含有本發明制備的重組hCRYl以及藥學上可接受的載體或輔料，該組合物可用于放療保護相關方面。
【專利附圖】
【附圖說明】[0017]現將本發明有關附圖進行描述，其中:
[0018]圖1:原核表達質粒pET28a(+)_hCRYl的構建流程圖；
[0019]圖2:左圖為PCR產物的瓊脂糖凝膠電泳檢測結果，右圖為原核表達質粒的酶切檢測結果，其中M為DNA Marker ；
[0020]圖3:高效表達hCRYl菌株的篩選結果，上圖為不同單菌落誘導表達效果檢測結果，下圖為對應條帶灰度值以及目標蛋白與雜蛋白比例結果，其中M為蛋白質Marker ；
[0021]圖4:BL21-hCRYl_b的誘導表達結果，上圖為SDS-PAGE結果，下圖為Western blot結果;
[0022]圖5:上圖為質譜鑒定目標蛋白條帶結果，下劃線部分為與hCRYl氨基酸序列相匹配的部分，下圖為以上序列在NCBI數據庫中比對結果，其中hCRYl得分最高；
[0023]圖6:左圖為鎳柱純化前后蛋白濃度的測量結果，右圖為鎳柱純化過程中，上樣前、上樣流穿液、50mM咪唑洗雜液和300mM咪唑洗脫液的SDS-PAGE分析結果，其中M為蛋白質 Marker ；
[0024]圖7:左圖為超濾置換前后蛋白濃度的測量結果，右圖為超濾置換前后的SDS-PAGE分析結果，其中M為蛋白質Marker ；
[0025]圖8:左圖為經X-ray照射后的對照組(cBSA)與實驗組(hCRYl)細胞內FOCI熒光強度比對結果，右圖為以上兩組細胞熒光強度量化結果(***P〈0.001)；
[0026]圖9:左上圖為加入不同濃度梯度hCRYl的HaCaT細胞未經X_ray照射時細胞內的FOCI熒光強度結果，左下圖為加入不同濃度梯度hCRYl的HaCaT細胞經X-ray照射后細胞內的FOCI熒光強度結果，右圖為每組細胞熒光強度量化結果(#P〈0.05，*#P〈0.001)；
[0027]圖10:hCRYl和處理之后的BSA對細胞凋亡的影響比對結果。
【具體實施方式】
[0028]實施例
[0029]本發明下面所述是以實施例對本發明進一步說明，本發明并不限于以下實施例。對于本發明所述方法的實施例如下:
[0030]1、原核表達質粒pET28a(+)_hCRYl的構建:
[0031]以實驗室保存的hCRYl真核表達質粒pcDNA3.Ι-hCRYl為模版，根據hCRYl的編碼區序列設計特異性引物:上游引物為hCRYlFW (5’ -ATACTCGAGGCTAAGCCTTCC-3’)，下游引物為hCRYlRV(5’ -CGCGGATCCTACGTTTATACT-3’)(上下游引物均由北京奧科鼎盛生物科技有限公司合成)。PCR擴增出所需目的片段(總體系25uL，94°C預變性3min，32個循環:940C 30s, 55°C 30s, 72°C 2min，最后72°C延伸10分鐘)。用限制性內切酶XhoI與BamlI(TAKARA)酶切目的片段與原核表達載體pET28a(+)，然后用T4DNA連接酶連接帶有粘性末端的載體與目的片段，最終獲得原核表達質粒pET28a(+)-hCRYl，如圖1所示。
[0032]用瓊脂糖凝膠電泳對擴增產物進行檢測，得到大小約為1900bp的條帶，如圖2左圖所示，證實目的片段已成功擴增。用電泳檢測酶切產物，可得到大小約為1900bp的目的片段條帶和大小約為5300bp的載體條帶,如圖2右圖所示,證實原核表達質粒構建成功。
[0033]2、誘導重組蛋白表達
[0034]2.1優秀克隆的篩選[0035]將上述重組質粒pET28a(+)_hCRYl轉化至感受態細胞E.coli BL21 (DE3)中，涂板培養，次日挑取5個不同的單菌落克隆，分別接入含50mg/L卡那霉素的LB培養基中，搖菌過夜后以1:100轉接到新鮮的含50mg/L卡那霉素的LB培養基中進行放大培養。于三角燒瓶中搖菌至菌液0D600值0.6-0.8之間(最好約為0.6)后，加入ImM誘導劑IPTG，24°C、200rpm誘導6h后離心收菌。將所收菌體用PBS洗滌并重懸于30ml PBS中，加入ImM蛋白酶抑制劑PMSF后進行超聲破碎。從每份破碎樣品中取20 μ I樣品進行SDS-PAGE分析，電泳結果如圖3上圖所示，分別測量目標蛋白與雜蛋白條帶灰度值并計算比例，挑選目標蛋白比例最高的b克隆(即目標蛋白條帶較亮、雜蛋白條帶較弱的克隆)(圖3下圖)，-80°C保菌儲存并命名為BL21-hCRYl-b。之后的所有實驗均使用該菌株完成。
[0036]2.2融合蛋白的誘導表達及鑒定
[0037]使用b克隆重復誘導表達實驗并放大誘導體系至1L，菌體破碎后上清與沉淀分別用SDS-PAGE分析，電泳結果如圖4上圖所示,用His抗體進行Western Blot,結果如圖4下圖所示，證明大部分目的蛋白以包涵體的形式表達。將目標條帶切下，交由中科院微生物所儀器中心進行質譜鑒定。質譜鑒定結果如圖5上圖所示，hCRYl蛋白的氨基酸序列如SEQID N0:1所示。與NCBI數據庫比對結果如圖5下圖所示，證實該蛋白確實為hCRYl。
[0038]3、純化重組蛋白
[0039]3.1包涵體的洗滌
[0040]用20ml新配置的包涵體洗漆液(溶液A,配方為:50mM Tris_base、0.5mM EDTA、50mM NaCl、l%Triton X_100、2M尿素，用NaOH調節pH至8.0)將包涵體重懸，超聲破碎，離
心保留沉淀。
[0041]3.2包涵體的溶解
[0042]于洗漆后的沉淀中加入20ml新配置的包涵體溶解液(溶液B,配方為50mMTris-base,0.5mM EDTA、50mM NaCl、8M 尿素、ImM PMSF，用 NaOH 調節 pH 至 8.0)，先將沉淀吹打成小塊，再進行超聲破碎助溶。破碎完畢后放置于24°C搖床，IOOrpm溶解2h。溶解完畢后離心分離并保留上清，沉淀則再用適量溶解液重復上述步驟溶解，直至沉淀體積不再明顯減少。最后將多次溶解后上清收集在一起，去除沉淀。
[0043]3.3梯度透析復性
[0044]透析全程在4°C環境室中進行并保持磁力攪拌。將上步所得蛋白溶液裝入IOkD透析袋中，于5L燒杯中用2L含6M尿素、50mM Tris-base、50mM NaCl的透析液透析，并逐漸將透析液中尿素濃度降至3M。將裝有蛋白溶液的透析袋從之前的透析液移至4L蛋白復性液(溶液 C，配方為 IOOmM Tris-base、400mM 精氨酸、2M 尿素、5mM EDTA、5mM GSH.0.5mM GSSG,用NaOH調節pH至8.0)中透析24h。此后再將裝有蛋白溶液的透析袋移入2L上樣緩沖液(溶液D，配方為50mM Tris-base、50mM NaCl，用NaOH調節pH至8.0)中進行透析，直到透析袋內有明顯的白色絮狀析出且數量不再增多(約24-48h )。
[0045]3.4鎳柱純化
[0046]將透析后的蛋白液離心保留上清。用IOKD超濾管將蛋白溶液總體積濃縮至20ml。取少量復性后的總蛋白樣品稀釋10倍，用Bradford蛋白含量檢測試劑盒(由南京凱基生物物質發展有限公司購買)測量蛋白濃度。于4°C環境室中上樣于預先用溶液D平衡好的Iml純化鎳柱(由上海七海復泰生物科技有限公司購買)中，收集流穿液并將其再次上樣,重復多次(至少5次)以保證目的蛋白與鎳柱充分結合。之后用上樣緩沖液(溶液D)洗柱，將純化柱側壁上的殘留樣品洗凈。用IOml含有40mM咪唑的上樣緩沖液洗去純化柱上結合的雜蛋白之后，再用IOml含有200mM咪唑的上樣緩沖液洗脫目標蛋白，多次重復洗脫以保證洗脫效率。蛋白經過鎳柱純化后，從IOml洗脫液中取少量樣品稀釋10倍后再次測量蛋白濃度(如圖6左圖所示)，可得鎳柱純化后的總蛋白回收率約為22.2%。將鎳柱純化前蛋白溶液樣品與鎳柱純化過程中收集的流穿液、洗雜液、洗脫液共同進行SDS-PAGE電泳，經考馬斯亮藍染色后如圖6右圖所示，可見雜蛋白已被顯著去除，蛋白純度已達到95%以上。
[0047]3.5超濾置換
[0048]將上步所得的蛋白樣品用上樣緩沖液稀釋10倍，再用IOKD超濾管濃縮至原體積，重復多次(至少3次)，以去除洗脫液中咪唑，最后將蛋白溶液濃縮至5ml，得到可溶性hCRYl蛋白溶液成品。置換前后分別取少量樣品稀釋10倍后用Bradford蛋白含量檢測試劑盒(由南京凱基生物物質發展有限公司購買)測量蛋白濃度，如圖7左圖所示，蛋白回收率約為93.8%。分別將超濾置換前后樣品進行SDS-PAGE電泳和考馬斯亮藍染色，如圖7右圖所示。[0049]4、重組蛋白活性及功能檢測
[0050]取純化后的蛋白溶液稀釋至500 μ g/ml以作備用，同時用300mM咪唑配置lmg/mlBSA蛋白，經鎳柱上樣流出以及與hCRYl樣品完全相同的超濾置換后，稀釋至500 μ g/ml作為對照(cBSA)。將Hela細胞爬片鋪板培養至約80%_90%細胞密度時換液，三小時后，分別將備好的hCRYl與對照蛋白按照與培養基1:1的比例加入細胞培養液，使每個孔內液體總體積為2ml,加入蛋白終濃度為250 μ g/ml ο之后立刻將兩組細胞置于X_ray照射機內進行照射，每分鐘劑量為1.132/Gy，照射時間530s，總劑量為10Gy。照射之后立刻將細胞培養液均換為實驗前的培養基(DMEM)繼續培養45分鐘后收細胞爬片。用PBS洗片3次，100%甲醇_20°C固定細胞5min，再用PBS洗3次，5%BSA封閉過夜后，用抗體Phospho-Histone H2A.X于37°C孵育細胞lh，再用PBS洗3次，再用抗體山羊抗兔IgG/FITC于37°C孵育細胞lh，PBS3次洗后封片，激光共聚焦顯微鏡觀察兩組細胞內磷光體亮度，在完全相同的拍攝條件下每片分別取3個不同視野統計平均熒光強度。在完全相同的觀察條件下，肉眼可見兩組細胞中形成的FOCI熒光強度差異十分顯著(圖8左圖)，隨機選取3個視野并將熒光強度量化，兩組之間差異極其顯著(P〈0.001)(圖8右圖)。由此可知，本專利申請制備的hCRYl降低了細胞中FOCI的熒光強度，對細胞起到了一定的保護作用，減少了 X-ray的侵害。
[0051]為進一步證實細胞內FOCI的減少是由于hCRYl的射線防護作用，本專利申請中，在HaCaT細胞中進一步進行hCRYl濃度梯度實驗并設置未經X_ray處理的對照組細胞，用上述經處理后的BSA溶液稀釋hCRYl溶液來設立濃度梯度，用同樣方法處理細胞，制片并觀察。結果表明，當細胞培養基中的hCRYl濃度達到50 μ g/ml時，FOCI的熒光強度明顯降低(圖 9)。
[0052]本專利申請還分別檢測了 hCRYl和處理之后的BSA對細胞凋亡的影響。在兩組細胞中分別加入250 μ g/ml hCRYl和250 μ g/ml處理后的BSA，Ih后與另一組未加任何蛋白的細胞一起檢測細胞凋亡情況，用細胞凋亡檢測試劑盒(由南京凱基生物物質發展有限公司購買)對細胞進行雙染后用流式細胞儀進行分析。結果表明Ih之內，不論是hCRYl還是BSA都不會造成細胞凋亡，該結果進一步證明FOCI熒光強度的降低是因為細胞內DNA所受損傷的減少而非細胞的凋亡(圖10)。[0053]表1:蛋白純化表
[0054]經統計，每升菌液可獲得約25mg hCRYl ;得率=每個步驟總hCRYl/前一步驟總蛋白量
[0055]
【權利要求】
1.一種重組人隱花色素蛋白I (hCRYl)的原核表達方法，其特征在于，包括以下步驟:構建表達質粒，誘導重組蛋白表達，純化重組蛋白，重組蛋白活性及功能檢測。
2.如權利要求1所述方法，其特征在于，其中構建表達質粒的步驟包括:將hCRYl基因片段連接入原核表達載體pET28a (+)，獲得重組表達質粒pET28a (+) -hCRYl。
3.如權利要求1所述方法，其特征在于，其中誘導重組蛋白表達的步驟包括:將構建好的表達質粒轉入宿主細胞E.coli BL2KDE3)后誘導表達；其中優選在轉入宿主細胞后，通過SDS-PAGE篩選表達量高的克隆細胞。
4.如權利要求1所述方法，其特征在于，其中純化重組蛋白的步驟包括:將誘導表達的菌株破碎，離心，獲得包涵體，再將包涵體復性，經純化后獲得有活性的重組蛋白。
5.如權利要求4所述方法，其特征在于，其中包涵體復性的步驟包括:洗滌包涵體，溶解包涵體，梯度透析復性；純化的步驟包括:鎳柱純化后進行超濾置換。
6.如權利要求1所述方法，其特征在于，其中重組蛋白活性及功能檢測的步驟包括:利用胞內FOCL熒光強度來檢測hCRYl蛋白的活性及功能。
7.權利要求1-6任一所述方法制備的重組hCRYl蛋白在制備放療保護劑中的應用。
8.組合物，含有權利要求1-6任一所述方法制備的重組hCRYl蛋白以及藥學上可接受的載體或輔料。
9.權利要求8所述組合物在制備放療保護劑中的應用。
10.如權利要求7或9所述應用，其特征在于，其中放療保護劑為皮膚放療保護劑。
【文檔編號】A61K38/17GK103834677SQ201410116197
【公開日】2014年6月4日 申請日期:2014年3月26日 優先權日:2014年3月26日
【發明者】潘長穿, 黃文林, 姚辰, 陳帥 申請人:黃文林, 潘長穿