一種仿細胞外層膜結構基因載體及其制備方法

一種仿細胞外層膜結構基因載體及其制備方法
【專利摘要】本發明公開了一種仿細胞外層膜結構基因載體，由單體和聚陽離子通過自由基聚合法制成，所述單體為含有兩性離子親水性基團的乙烯基單體和苯胺類單體；所述聚陽離子為殼聚糖、聚乙烯亞胺、聚賴氨酸或樹枝狀聚氨酯。另外，本發明還公開了該仿細胞外層膜結構基因載體的制備方法。本發明的仿細胞外層膜結構基因載體的粒徑較小，約為300nm～600nm，表面Zeta電位較高，可顯著提高其對DNA的負載能力。本發明的仿細胞外層膜結構基因載體對蛋白吸附、血小板黏附明顯降低，生物相容性顯著提高，從而延長基因載體在體內的循環時間，提高藥效。
【專利說明】一種仿細胞外層膜結構基因載體及其制備方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于納米技術和生物醫用高分子材料【技術領域】，具體涉及一種仿細胞外層膜結構基因載體及其制備方法。
【背景技術】
[0002]基因治療是采用正常功能的基因置換或增補患者體內有缺陷的基因，從而達到治療疾病的目的，已成為一種治療各種基因疾病(包括傳染病、癌癥等)的有效途徑。在眾多的基因載體中，特別是非病毒基因載體中低毒性的聚陽離子基因載體(Langmuir, 2009, 25(9):5199-5208)備受各國學者的重視，具有重要的學術價值和巨大的應用前景。
[0003]殼聚糖具有可降解性、抗菌性、無毒、無刺激、pH響應性等優點(CarbohydratePolymers, 2010, 79(3):724-730),已經被廣泛應用于生物醫學等領域。殼聚糖是天然聚陽離子，可以和聚陰離子通過靜電相互作用，使二者分子鏈相互纏繞，最終形成納米級聚集體(Carbohydrate Polymers, 2005, 62 (2): 142-158)。在基因治療領域，殼聚糖作為聚陽離子，與帶負電荷的DNA通過靜電相互作用，在負載藥物的同時，形成表面帶正電荷的納米顆粒。該納米顆粒通過減緩DNA降解、失活，黏附細胞膜提高胞吞作用，憑借質子海綿效應逃離內涵體,從而達到提高轉染率的目的(Biomacromolecules, 2009, 10(9): 2436-2445)。因此，這類殼聚糖復合聚電解質納米顆粒已經成為納米載藥體系在基因治療方面研究的重點之一。 [0004]然而，聚陽離子與DNA形成的聚電解質復合物表面帶有部分的正電荷，在體內循環中易吸附蛋白，繼而引發血小板、細胞黏附，導致形成血栓和免疫反應(Biomaterials, 2009，30(34): 6655-6664)，易被單核巨噬細胞吞噬，從而降低藥效。因此設計穩定的生物相容性納米材料是藥物載體設計的關鍵課題。
[0005]磷酰膽堿(phosphoryIcholine, PC)是組成細胞膜基本單元卵磷脂的親水端基，是細胞外層膜中的外層官能團，同時帶有正、負異種電荷，具有較強的結合水的能力和親水性能，這種結構和組成的表面與生理環境相互作用不僅不會吸附和沉積蛋白質，也不會引發血小板激活、導致凝血等不良反應，具有良好生物相容性。近幾年來的研究表明，采用磷酰膽堿在殼聚糖表面構建具有仿細胞外層膜結構，可以顯著改善材料的生物相容性。然而，這些改性方式均是采用磷酰膽堿小分子接枝的途徑(Carbohydrate Polymers, 2007, 70(1):8
2-88;ZL200410054022.2;Biomacromolecules, 2007, 8(10), 3169-3176;Biomacromolecules, 2006, 7(11):3151-3156;Journal of Applied Polymer Science, 2003，88(2):489-493;Polymer International, 2003，52(I):81-85;Journal of biomaterials science, Polymeredition, 2002, 13(5):501-510;Colloids and Surfaces B:Biointerfaces, 2009, 71 (2):268-274)，往往在材料表面的磷酰膽堿基團的密度不高，且接枝改性受基材組成、形狀及設備的影響，限制了其在生物醫用材料改性領域的應用和生物相容性的進一步提高。
[0006]日本 Ishihara 和英國 Lewis 的研究小組(Biomaterials, 2009, 30(28):4930-4938;Biomaterials, 2004, 25(19):4785-4796)對用含有陽離子、中性、陰離子的磷酰膽堿聚合物修飾材料表面的蛋白吸附和細胞粘附進行了研究。結果表明，帶電荷的磷酰膽堿類聚合物均可用于改善材料的生物相容性。聚苯乙烯磺酸鈉/聚丙烯胺鹽酸鹽(PSS/PAH)多層膜與最外層帶相反電荷的磷酰膽堿類二元隨機聚合物通過靜電吸附構建的仿細胞外層膜結構涂層，均顯著改善了靜電自組裝涂層表面的蛋白吸附、細胞黏附等生物相容性問題(Langmuir, 2009，25 (6):3610-3617;Soft Matter, 2010，6(7):1503-1512)。
[0007]用甲基丙烯酰氧乙基磷酰膽堿-甲基丙烯酸丁酯二元共聚物(poly (MPC-co-BMA)，PMB30)修飾的聚乳酸(PLA)納米粒子表面，可以抑制對蛋白的吸附，使其不易被巨噬細胞吞噬，達到提高藥效的作用(智能高分子材料.北京:化學工業出版社，2004，281-282)。張靜等人將含有磷酰膽堿基團的隨機共聚物制備成了具有仿細胞膜結構納米膠束(專利申請號:201010192087.9)。Mansouri等人將含有磷酰膽堿基團的殼聚糖自組裝體系用于包裹紅細胞，有效地避免了紅細胞被抗體A識別、溶血，提高了其生物相容性(Langmuir，2009，25(24): 14071-14078)。Goda 等人(Biomaterials, 2010，31 (8): 2380-2387)研究發現表面含有磷酰膽堿聚合物制備的納米顆粒可以直接穿透細胞膜，為提高藥效開辟了新的途徑。

【發明內容】

[0008]本發明所要解決的技術問題在于針對上述現有技術的不足，提供一種仿細胞外層膜結構基因載體。該仿細胞外層膜結構基因載體由含有兩性離子親水性基團的乙烯基單體、苯胺類單體和聚陽離子通過溶液自由基聚合法制成，對蛋白吸附、血小板黏附明顯降低，生物相容性顯著提高，從而延長結構基因在體內的循環時間，提高藥效。
[0009]為解決上述技術問題，本發明采用的技術方案是:一種仿細胞外層膜結構基因載體，由單體和聚陽離子通過自由基聚合法制成，其特征在于，所述單體為含有兩性離子親水性基團的乙烯基單體和苯胺類單體；所述聚陽離子為殼聚糖、聚乙烯亞胺、聚賴氨酸或樹枝狀聚氨酯；所述苯胺類單體為苯胺或對苯二胺。
[0010]上述的一種仿細胞外層膜結構基因載體，所述乙烯基單體為甲基丙烯酸類、丙烯酸類、甲基丙烯酰胺類或丙烯酰胺類單體。
[0011]上述的一種仿細胞外層膜結構基因載體，所述兩性離子親水性基團為磷酰膽堿基團。
[0012]上述的一種仿細胞外層膜結構基因載體，所述單體的質量為單體和聚陽離子總質量的60%~70% ;所述單體中含有兩性離子親水性基團的乙烯基單體與苯胺類單體的質量比為2~8:1。
[0013]上述的一種仿細胞外層膜結構基因載體，所述含有兩性離子親水性基團的乙烯基單體為甲基丙烯酰氧乙基磷酰膽堿，苯胺類單體為苯胺，聚陽離子為殼聚糖。
[0014]另外，本發明還提供了一種制備上述的仿細胞外層膜結構基因載體的方法，其特征在于，該方法為:將聚陽離子溶解于溶劑中，得到聚陽離子溶液；然后向所述聚陽離子溶液中加入單體和引發劑，在氮氣保護下進行聚合反應；待聚合反應結束后，對反應體系進行抽濾得到濾液，調節濾液pH值至5.5 后離心，棄去上清，向離心后的固體中加入蒸餾水反復離心分離三次，將反復離心分離后的固體冷凍干燥，得到仿細胞外層膜結構基因載體。
[0015]上述的方法，所述溶劑為體積百分比濃度為1%~5%的醋酸水溶液。
[0016]上述的方法，所述引發劑為過硫酸鉀，引發劑的質量為單體和聚陽離子總質量的0.5% ~2%O
[0017]上述的方法，所述聚合反應的反應溫度為60V~80°C，反應時間為3h~5h。
[0018]本發明與現有技術相比具有以下優點:
[0019]1、本發明的仿細胞外層膜結構基因載體由含有兩性離子親水性基團的乙烯基單體、苯胺類單體和聚陽離子通過溶液自由基聚合法制成，對蛋白吸附、血小板黏附明顯降低，生物相容性顯著提高，從而延長結構基因在體內的循環時間，提高藥效。
[0020]2、本發明的仿細胞外層膜結構基因載體的粒徑較小，約為300nm~600nm。
[0021]3、本發明的仿細胞外層膜結構基因載體表面Zeta電位較高，可顯著提高其對DNA的負載能力。
[0022]4、本發明的仿細胞外層膜結構基因載體的制備方法簡單、條件溫和，為獲得表面具有仿細胞外層膜結構的基因載體體系提供了一種新的途徑。
[0023]5、本發明的仿細胞外層膜結構基因載體在組織工程、藥物控釋、基因治療及生物傳感器等領域具有巨大的學術價值和廣闊的應用前景。
[0024]下面結合附圖和實施例，對本發明的技術方案做進一步的詳細說明。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0025]圖1為本發 明實施例1制備的仿細胞外層膜結構基因載體的粒徑分布圖。
[0026]圖2為pH值對本發明實施例1制備的仿細胞外層膜結構基因載體平均粒徑的影響。
[0027]圖3為pH值對本發明實施例1制備的仿細胞外層膜結構基因載體表面Zeta電位的影響。
【具體實施方式】
[0028]MPC可按文獻報道的方法(Polymer Journal, 1990, 22(5):355-360;Colloids andSurfaces B:Biointerfaces, 2011, 85 (I):48-55)合成。苯胺(AN)等均可從國內生產公司購買或Sigma公司購買。
[0029]實施例1
[0030]本實施例的仿細胞外層膜結構基因載體，由2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰膽堿(MPC)、苯胺和樹枝狀聚氨酯通過自由基聚合法制成，其中單體(2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰膽堿和苯胺)的質量為單體和聚陽離子(樹枝狀聚氨酯)總質量的60%，2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰膽堿與苯胺的質量比為2:1。
[0031]本實施例的制備方法為:將0.1g樹枝狀聚氨酯溶解于50mL體積百分比濃度為1%的醋酸水溶液中，攪拌24h，得到樹枝狀聚氨酯溶液；然后向樹枝狀聚氨酯溶液中加入
0.1g2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰膽堿(MPC)、0.05g苯胺和5mg的過硫酸鉀(K2S2O8, KPS)，在氮氣保護下，溫度為70°C的條件下聚合反應4h ;待聚合反應結束后，用G3漏斗對反應體系進行抽濾得到濾液，調節濾液pH值至5.5后在2°C~4°C、9000rpm條件下離心10min,棄去上清，向離心后的固體中加入蒸餾水反復離心分離三次，將反復離心分離后的固體在_50°C下冷凍干燥，得到仿細胞外層膜結構基因載體，其粒徑范圍約為380nm~600nm。
[0032]本實施例的仿細胞外層膜結構基因載體對蛋白吸附、血小板黏附明顯降低，生物相容性顯著提高，從而延長基因載體在體內的循環時間，提高藥效，在組織工程、藥物控釋、基因治療及生物傳感器等領域具有巨大的學術價值和廣闊的應用前景。
[0033]實施例2
[0034]本實施例的仿細胞外層膜結構基因載體，由2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰膽堿(MPC)、苯胺和殼聚糖通過自由基聚合法制成，其中單體(2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰膽堿和苯胺)的質量為單體和聚陽離子(殼聚糖)總質量的65%，2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰膽堿與苯胺的質量比為4:1。
[0035]本實施例的制備方法為:將0.35g殼聚糖溶解于50mL體積百分比濃度為5%的醋酸水溶液中，攪拌24h，得到殼聚糖溶液；然后向殼聚糖溶液中加入0.52g2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰膽堿、0.13g苯胺和0.02g的過硫酸鉀(K2S2O8, KPS)，在氮氣保護下，溫度為80°C的條件下聚合反應3h ;待聚合反應結束后，用G3漏斗對反應體系進行抽濾得到濾液，調節濾液pH值至5.5后在2°C~4°C、9000rpm條件下離心10min,棄去上清，向離心后的固體中加入蒸餾水反復離心分離三次，將反復離心分離后的固體在_50°C下冷凍干燥，得到仿細胞外層膜結構基因載體，其粒徑范圍約為300nm~500nm。
[0036]本實施例的仿細胞外層膜結構基因載體對蛋白吸附、血小板黏附明顯降低，生物相容性顯著提高，從而延長基因載體在體內的循環時間，提高藥效，在組織工程、藥物控釋、基因治療及生物傳感器等領域具有巨大的學術價值和廣闊的應用前景。
[0037]實施例3
[0038]本實施例的仿細胞外層膜結構基因載體，由2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰膽堿(MPC)、苯胺和殼聚糖通過自由基聚合法制成，其中單體(2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰膽堿和苯胺)的質量為單體和聚陽離子(殼聚糖)總質量的70%，2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰膽堿與苯胺的質量比為6:1。
[0039]本實施例的制備方法為:將0.3g殼聚糖溶解于50mL體積百分比濃度為3%的醋酸水溶液中，攪拌12h，得到殼聚糖溶液；然后向殼聚糖溶液中加入0.6g2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰膽堿(MPC)、0.1g苯胺和5mg的過硫酸鉀(K2S2O8, KPS)，在氮氣保護下，溫度為70°C的條件下聚合反應3h ;待聚合反應結束后，用G3漏斗對反應體系進行抽濾得到濾液，調節濾液pH值至5.5后在2°C~4°C、9000rpm條件下離心10min,棄去上清，向離心后的固體中加入蒸餾水反復離心分離三次，將反復離心分離后的固體在_50°C下冷凍干燥，得到仿細胞外層膜結構基因載體，其粒徑范圍約為400nm~600nm。
[0040]本實施例的仿細胞外層膜結構基因載體對蛋白吸附、血小板黏附明顯降低，生物相容性顯著提高，從而延長基因載體在體內的循環時間，提高藥效，在組織工程、藥物控釋、基因治療及生物傳感器等領域具有巨大的學術價值和廣闊的應用前景。
[0041]實施例4
[0042]本實施例的仿細胞外層膜結構基因載體，由丙烯酰氧乙基磷酰膽堿、苯胺和聚賴氨酸通過自由基聚合法制成，其中單體(丙烯酰氧乙基磷酰膽堿和苯胺)的質量為單體和聚陽離子(聚賴氨酸)總質量的60%，丙烯酰氧乙基磷酰膽堿與苯胺的質量比為2:1。
[0043]本實施例的制備方法為:將0.2g聚賴氨酸溶解于50mL體積百分比濃度為1%的醋酸水溶液中，攪拌15h，得到聚賴氨酸溶液；然后向聚賴氨酸溶液中加入0.2g丙烯酰氧乙基磷酰膽堿、0.1g苯胺和5mg的過硫酸鉀(K2S2O8, KPS)，在氮氣保護下，溫度為60°C的條件下聚合反應5h ;待聚合反應結束后，用G3漏斗對反應體系進行抽濾得到濾液，調節濾液pH值至5.5后在2°C~4°C、9000rpm條件下離心10min,棄去上清，向離心后的固體中加入蒸懼水反復離心分離三次，將反復離心分離后的固體在_50°C下冷凍干燥，得到仿細胞外層膜結構基因載體，其粒徑范圍約為400nm~550nm。
[0044]本實施例的仿細胞外層膜結構基因載體對蛋白吸附、血小板黏附明顯降低，生物相容性顯著提高，從而延長基因載體在體內的循環時間，提高藥效，在組織工程、藥物控釋、基因治療及生物傳感器等領域具有巨大的學術價值和廣闊的應用前景。
[0045]實施例5[0046]本實施例的仿細胞外層膜結構基因載體，由2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰膽堿(MPC)、對苯二胺和聚乙烯亞胺通過自由基聚合法制成，其中單體(2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰膽堿和對苯二胺)的質量為單體和聚陽離子(聚乙烯亞胺)總質量的63%，2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰膽堿與對苯二胺的質量比為8:1。
[0047]本實施例的制備方法為:將0.37g聚乙烯亞胺溶解于50mL體積百分比濃度為3 %的醋酸水溶液中，攪拌2 4 h，得到聚乙烯亞胺溶液；然后向聚乙烯亞胺溶液中加入
0.56g2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰膽堿、0.07g對苯二胺和0.02g的過硫酸鉀(K2S2O8,KPS)，在氮氣保護下，溫度為70°C的條件下聚合反應4h ;待聚合反應結束后，用G3漏斗對反應體系進行抽濾得到濾液，調節濾液pH值至5.5后在2°C~4°C、9000rpm條件下離心10min,棄去上清，向離心后的固體中加入蒸餾水反復離心分離三次，將反復離心分離后的固體在_50°C下冷凍干燥，得到仿細胞外層膜結構基因載體，其粒徑范圍約為400nm~600nm。
[0048]本實施例的仿細胞外層膜結構基因載體對蛋白吸附、血小板黏附明顯降低，生物相容性顯著提高，從而延長基因載體在體內的循環時間，提高藥效，在組織工程、藥物控釋、基因治療及生物傳感器等領域具有巨大的學術價值和廣闊的應用前景。
[0049]實施例6
[0050]本實施例的仿細胞外層膜結構基因載體，由2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰膽堿(MPC)、對苯二胺和殼聚糖通過自由基聚合法制成，其中單體(2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰膽堿和對苯二胺)的質量為單體和聚陽離子(殼聚糖)總質量的70%，2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰膽堿與對苯二胺的質量比為6:1。
[0051]本實施例的制備方法為:將0.3g殼聚糖溶解于50mL體積百分比濃度為5%的醋酸水溶液中，攪拌20h，得到殼聚糖溶液；然后向殼聚糖溶液中加入0.6g2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰膽堿、0.1g對苯二胺和0.01g的過硫酸鉀(K2S2O8, KPS)，在氮氣保護下，溫度為80°C的條件下聚合反應3h ;待聚合反應結束后，用G3漏斗對反應體系進行抽濾得到濾液，調節濾液pH值至5.5后在2°C~4°C、9000rpm條件下離心10min,棄去上清，向離心后的固體中加入蒸餾水反復離心分離三次，將反復離心分離后的固體在_50°C下冷凍干燥，得到仿細胞外層膜結構基因載體，其粒徑范圍約為290nm~500nm。
[0052]本實施例的仿細胞外層膜結構基因載體對蛋白吸附、血小板黏附明顯降低，生物相容性顯著提高，從而延長基因載體在體內的循環時間，提高藥效，在組織工程、藥物控釋、基因治療及生物傳感器等領域具有巨大的學術價值和廣闊的應用前景。
[0053]對本發明實施例1至實施例6制備的仿細胞外層膜結構基因載體的粒徑分布進行檢測，結果見圖1，從圖中可以看出，本發明的仿細胞外層膜結構基因載體的粒徑較小，約為300nm ~GOOnm。
[0054]在不同pH條件下，對本發明實施例1制備的仿細胞外層膜結構基因載體的粒徑和Zeta電位進行檢測，結果分別見圖2和圖3。從圖2可以看出，仿細胞外層膜結構基因載體的粒徑隨pH值的升高逐漸降低,但仍維持在300nm~600nm范圍內。從圖3中可以看出，在酸性條件下，仿細胞外層膜結構基因載體保持較高的Zeta電位，Zeta電位最高可達42mV，在pH=4.5的條件下，其Zeta電位達到38mV左右，明顯高于申請號為201210415034.8，發明名稱為“具有仿細胞外層膜結構的納米顆粒及其制備方法”的專利申請的Zeta電位。
[0055]將申請號為201210415034.8，發明名稱為“具有仿細胞外層膜結構的納米顆粒及其制備方法”的專利申請的實施例1制備的納米顆粒與本發明實施例1至實施例6制備的基因載體分別配制成等濃度的PH值為4.5的溶液，用動態光散射儀在25.(TC下測試溶液的Zeta電位，取15次測定的平均值，結果見下表:
[0056]表1納米顆粒和基因載體表面的Zeta電位(pH=4.5)
[0057]
【權利要求】
1.一種仿細胞外層膜結構基因載體，由單體和聚陽離子通過自由基聚合法制成，其特征在于，所述單體為含有兩性離子親水性基團的乙烯基單體和苯胺類單體；所述聚陽離子為殼聚糖、聚乙烯亞胺、聚賴氨酸或樹枝狀聚氨酯；所述苯胺類單體為苯胺或對苯二胺。
2.根據權利要求1所述的一種仿細胞外層膜結構基因載體，其特征在于，所述乙烯基單體為甲基丙烯酸類、丙烯酸類、甲基丙烯酰胺類或丙烯酰胺類單體。
3.根據權利要求1所述的一種仿細胞外層膜結構基因載體，其特征在于，所述兩性離子親水性基團為磷酰膽堿基團。
4.根據權利要求1所述的一種仿細胞外層膜結構基因載體，其特征在于，所述單體的質量為單體和聚陽離子總質量的60%~70% ;所述單體中含有兩性離子親水性基團的乙烯基單體與苯胺類單體的質量比為(2~8):1。
5.根據權利要求1所述的一種仿細胞外層膜結構基因載體，其特征在于，所述含有兩性離子親水性基團的乙烯基單體為甲基丙烯酰氧乙基磷酰膽堿，苯胺類單體為苯胺，聚陽離子為殼聚糖。
6.一種制備如權利要求1至5中任一權利要求所述的仿細胞外層膜結構基因載體的方法，其特征在于，該方法為:將聚陽離子溶解于溶劑中，得到聚陽離子溶液；然后向所述聚陽離子溶液中加入單體和引發劑，在氮氣保護下進行聚合反應；待聚合反應結束后，對反應體系進行抽濾得到濾液，調節濾液PH值至5.5后離心，棄去上清，向離心后的固體中加入蒸餾水反復離心分離三次，將反復離心分離后的固體冷凍干燥，得到仿細胞外層膜結構基因載體。
7.根據權利要求6所述的方法，其特征在于，所述溶劑為體積百分比濃度為1%~5%的醋酸水溶液。
8.根據權利要求6所述的方法，其特征在于，所述引發劑為過硫酸鉀，引發劑的質量為單體和聚陽尚子總質量的0.5%~2%。
9.根據權利要求6所述的方法，其特征在于，所述聚合反應的反應溫度為60°C~80°C，反應時間為3h~5h。
【文檔編號】A61K48/00GK103877583SQ201410136235
【公開日】2014年6月25日 申請日期:2014年4月6日 優先權日:2014年4月6日
【發明者】吳伯華, 宮銘, 張永, 徐金鑫, 熊善新 申請人:西安科技大學