一種厚樸總酚提取物的吸附分離制備工藝的制作方法
【專利摘要】本發明提供了一種厚樸中兩個同分異構體成分——和厚樸酚與厚樸酚的提取工藝，步驟包括吸附液的制備、大孔吸附樹脂吸附、吸附后平衡、厚樸總酚的解吸和解吸液后處理。本發明克服了吸附分離法制備厚樸總酚提取物時共存生物堿的干擾，提出了有機溶劑中酸堿隔離提取的吸附液制備方法，建立了生物堿預分離與高純度厚樸總酚吸附樹脂提取的連續工藝，經“吸附－洗脫”一個工藝流程即可得到純度高于70%的厚樸總酚提取物。吸附樹脂法提取工藝操作簡便，樹脂可重復使用，適于大規模工業化生產。
【專利說明】一種厚樸總酚提取物的吸附分離制備工藝
【技術領域】
[0001]本發明屬于天然植物中單體活性成分的提取純化【技術領域】。特別是厚樸中兩個同分異構體成分一和厚樸酚與厚樸酚的提取工藝。
【背景技術】
[0002]厚樸為常用中藥，始載于《神農本草經》，列為中品，其后歷代本草與《中國藥典》均有記載。《中國藥典》2010年版一部規定，厚樸為木蘭科木蘭屬植物厚樸Magnoliaofficinalis Rehd.et ffils.或凹葉厚樸 Magnolia officinalis Rehd.et ffils.Var.bilobaRehd.et ffils.的干燥干皮、根皮及枝皮。現代藥理試驗證明厚樸具有廣譜抗菌、抗腫瘤、抗炎、保護心腦血管、抗潰瘍以及抗凝血等作用。
[0003]厚樸中的主要活性成分為厚樸酚與和厚樸酚，結構如圖1所示。厚樸酚與和厚樸酚為同分異構體，難溶于水，可溶于稀的氫氧化鈉溶液，易溶于有機溶劑。與此同時，厚樸中還含有生物堿成分[中草大辭典:下冊[M]，軍事醫學出版社，2007，P1628-1630]，已分離得到的生物堿為9種異喹啉結構的生物堿[王洪燕，周先禮，黃帥，申向黎.凹葉厚樸中生物堿成分的研究[J].華西藥學雜志.2007，22(1)]，結構如圖2所示。[0004]厚樸中的生物堿與厚樸酚在空間構型上相互匹配，易由強的疏水性的-Ji相互作用結合在一起，成為一對結合體，這種疏水的π-JT相互作用在極性溶劑中表現的更為明顯。生物堿是植物中普遍存在的另一種活性成分，厚樸中生物堿常用于消炎滅菌、胸腹脹滿、腸梗塞、痰飲喘滿的癥。厚樸總酚提取物中，由于生物堿的存在不僅使厚樸總酚提取物的純度明顯降低，同時也給后續的藥理藥效研究帶來了不確定的影響。
[0005]厚樸酚與和厚樸酚傳統的提取方法有熱水浸提法和乙醇浸提法，但其雜質含量高，后續分離工藝復雜。現代提取技術有超聲提取法、熱浸潰提取法、堿提酸沉法、聚酰胺分離提取法、高速逆流色譜法、超臨界二氧化碳萃取法等。超聲提取法提取速度快，時間短，但其噪音大，且提取物純度不高；熱浸潰提取法提取后續步驟繁瑣，萃取、重結晶等步驟有機溶劑用量大，提取物損失嚴重；高速逆流色譜法分離制備厚樸酚與和厚樸酚，純度可滿足要求，但制備量小，不宜用于工業化擴大生產；而超臨界萃取法設備復雜，前期設備投入較大，這都限制了超臨界萃取法的大規模工業化應用。溶劑萃取法的工藝繁瑣、操作步驟多、溶劑的損失也較大。而且上述方法都面臨著提取所得的厚樸總酚中含有生物堿類成分的問題，而殘留的生物堿類成分與厚樸酚的結合作用，使得厚樸酚與和厚樸酚的同時提取很難實現。
[0006]近年來，大孔吸附樹脂法因其工藝操作簡單、環境友好、吸附樹脂可重復使用、分離成本較低等優點，在天然植物有效成分的分離純化中發揮了越來越重要的作用，吸附分離提取工藝也成為廣泛應用的工業化生產和制備天然產物的成熟方法，在厚樸的有效成分提取中，也有吸附樹脂分離的報道，但是到目前為止，所報道的方法中，制備的厚樸總酚提取物純度較低，如趙春穎等用大孔樹脂DM-301將中藥厚樸中的厚樸酚含量由7.56%提高到15.26%[趙春穎，毛曉霞，張梓倩.大孔吸附樹脂分離純化厚樸酚的方法研究[J].承德醫學院學報，2009, 26(4):358-360]，葉卉等通過調節吸附液的乙醇濃度，降低了厚樸中部分雜質在樹脂上的吸附作用隨流出液流出，從而制備了純度為46.0%的厚樸總酚提取物，但與此同時存在于厚樸中的生物堿類物質也由于乙醇濃度的提高而進入吸附液，隨吸附——解吸過程進入最終產物，造成了厚樸總酚中生物堿類成分難以分離的問題，這必然制約了厚樸酚進一步的藥理研究和藥用開發[葉卉，冉曉輝，俞凱.厚樸提取物工藝研究[J].醫藥導報.2008，27 (8): 974-975]。
[0007]這是由于傳統吸附液的制備方法通過乙醇的溶解能力將厚樸總酚提取至乙醇溶液中，然后蒸發部分乙醇以將厚樸酚與和厚樸酚轉移至低濃度的乙醇水溶液中，當乙醇降至適宜濃度時，才可上柱吸附。在這個過程中，乙醇提取厚樸總酚的同時易溶于乙醇的生物堿也被提取出來。隨著乙醇的減少，水的不加，溶液的極性逐漸增加，生物堿與厚樸酚之間的相互作用逐漸增強，通過強的相互作用成為一對結合體共同保留在吸附液中，隨著樹脂對厚樸酚的“吸附一解吸”這一連續過程使得生物堿類成分進入最終的提取產物中。
【發明內容】
[0008]本發明為了解決這一制約高純度厚樸總酚提取物制備中的關鍵問題，提出了有機溶劑中酸堿隔離提取的吸附液制備方法，建立了生物堿預分離與高純度厚樸總酚提取的連續工藝，即在酸性乙醇溶液中將厚樸原藥材加熱回流，提取生物堿與厚樸總酚，此時生物堿以鹽的狀態存在，厚樸總酚以分子狀態存在，同時在有機溶劑中生物堿與厚樸總酚的π - JI相互作用被有效的破壞，避免了兩者以結合體的狀態存在，在接下來的蒸發溶劑過程中，不斷補加酸性水溶液，以保持生物堿始終溶解于溶液中，酚類成分因不溶于酸性水溶液而以沉淀的方式析出。 經離心后將沉淀復溶于堿性水溶液中，即得到不含生物堿的吸附溶液。經樹脂吸附、解吸后，即可得到純度高于70%(w%)的厚樸總酚提取物，經檢測生物堿顯色劑甲醒一濃硫酸(Marquis試劑)檢測，提取物中成分對該試劑呈負反應，證明提取物中不含生物堿。
[0009]本發明克服了吸附分離法制備厚樸總酚提取物時共存生物堿的干擾，提出了有機溶劑中酸堿隔離提取的吸附液制備方法，建立了生物堿預分離與高純度厚樸總酚吸附樹脂提取的連續工藝，經“吸附一洗脫”一個工藝流程即可得到純度高于70%的厚樸總酚提取物。吸附樹脂法提取工藝操作簡便，樹脂可重復使用，適于大規模工業化生產。
[0010]具體工藝步驟如下:
1.吸附液的制備:厚樸粉碎，用5%-7%( v%)的鹽酸乙醇溶液，作為提取液，在55°C -70°C下提取厚樸酚與和厚樸酚，藥材質量(g)與提取液體積(mL)比為1:3~1:5，，w/v，回流2-3h，抽濾，相同操作條件下提取兩次，合并濾液、減壓蒸餾回收乙醇后，補加PH=1_3的水，保持厚樸藥材的質量(g)與溶液體積(mL)之比為1:5-1:6，離心，收集析出物。將析出固體溶于pH=ll-13的30% (v%)乙醇水溶液中，厚樸藥材質量(g)與溶液體積(mL)比為1:5_1:7，離心除去少量不溶物，得到上層清液，即為吸附液，吸附溶液將用于下一步的樹脂純化。
[0011]2.大孔吸附樹脂吸附:所用樹脂是商品化大孔吸附樹脂(牌號AB-8、HPD-722、D101、CAD-40、CAD-45)。樹脂裝入交換柱中，吸附柱的長徑比為1:5-1:20。將2_3倍床體積(BV)的上述吸附液通過裝有大孔吸附樹脂的樹脂柱進行吸附，吸附流速為0.5-2.0BV /h ；3.吸附后平衡:用2-3BV的去離子水將樹脂清洗干凈，再用2-3BV的60%(v%)乙醇水溶液繼續清洗樹脂柱，流速均為0.5-2.0BV / h ；
4.厚樸總酚的解吸:用3-5BV的80%(v%)乙醇水溶液作解吸劑，解吸速度為0.5-2.0BV / h,收集解吸液；
5.解吸液后處理:將上述解吸液經減壓蒸餾并回收乙醇，然后經濃縮、真空干燥，得到棕色厚樸總酚提取物，也可采用其他方式進行造粉或者造粒等處理。經HPLC測定，提取物中厚樸總酚純度為70%_73% (w%)，且通過Marquis試劑)檢測，該提取物中不含生物堿。
[0012]本發明的優點和積極效果:
本發明克服了吸附分離法制備高純度厚樸總酚提取物時共存生物堿的干擾，提出了有機溶劑中酸堿隔離提取吸附液的制備方法，建立了生物堿預分離與高純度厚樸總酚吸附樹脂提取的連續工藝，經“吸附一洗脫”一個工藝流程即可得到純度為70%-73% (w%)、不含生物堿的厚樸總酚提取物。本發明工藝簡單，樹脂可重復使用，生產成本低，適于大規模工業化生產。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0013]圖1厚樸酚與和厚樸酚的分子結構式。
[0014]圖2厚樸中幾種生物堿的分子結構示意圖。
【具體實施方式】
[0015]實施例1:
用商品化AB-8大孔吸附樹脂提取高純度厚樸總酚的工藝方法，步驟如下:
I)稱取中藥厚樸23g，粉碎，用5% (v%)的鹽酸乙醇溶液90mL在60°C下提取，回流2h，抽濾，提取兩次，合并濾液減壓蒸餾回收乙醇，同時補加pH=2的水，離心，收集析出物。將析出固體溶于pH=12.5的30%乙醇水溶液140mL中，離心除去少量不溶物，得到吸附液。
[0016]2)將60mL (2BV)的上述吸附液通過裝有AB-8大孔吸附樹脂的樹脂柱(柱內徑8mm,柱長250 mm,裝有30 mL濕樹脂)，吸附速度為1.0 BV/h ；
3)吸附完成后，用90mL (3BV)的去離子水將樹脂清洗干凈，用90mL (3BV)60% (v%)乙醇水溶液將樹脂上吸附能力較弱的雜質洗脫下來速度為1.0BV / h ；
4)用90mL(3BV)80% (v%)乙醇水溶液作解吸劑，解吸速度為1.0 BV / h，收集解吸 液；
5)將上述解吸液經減壓蒸餾并回收乙醇，然后經濃縮、真空干燥，得到棕色厚樸總酚提取物 0.1955g。
[0017]經HPLC分析測定，提取物中厚樸總酚含量為70.l%(w%)，且通過Marquis試劑檢測，該提取物中不含生物堿。
[0018]實施例2:
用商品化DlOl大孔吸附樹脂提取高純度厚樸總酚的工藝方法，步驟如下:
I)稱取中藥厚樸25g，粉碎，用4% (v%)的鹽酸乙醇溶液90mL在55°C下提取，回流2h，抽濾，提取兩次，合并濾液減壓蒸餾回收乙醇，同時補加pH=2.5的水，離心，收集析出物。將析出固體溶于pH=ll.5的30%乙醇水溶液145mL中，離心除去少量不溶物，得到吸附液。[0019]2)將90mL (3BV)的上述吸附液通過裝有DlOl大孔吸附樹脂的樹脂柱(柱內徑8mm,柱長250mm，裝有30 mL濕樹脂)，吸附速度為0.5 BV/h ；
3)吸附完成后，用90mL (3BV)的去離子水將樹脂清洗干凈，用90mL (3BV)60% (v%)乙醇水溶液將樹脂上吸附能力較弱的雜質洗脫下來速度為0.5BV / h ；
4)用120mL(4BV)80% (v%)乙醇水溶液作解吸劑，解吸速度為0.5BV / h，收集解吸
液；
5)將上述解吸液經減壓蒸餾并回收乙醇，然后經濃縮、真空干燥，得到棕色厚樸總酚提取物 0.3124g。
[0020]經HPLC分析測定，提取物中厚樸總酚含量為71.3% (w%)，且通過Marquis試劑檢測，該提取物中不含生物堿。
[0021]實施例3:
用商品化CAD-40大孔吸附樹脂提取高純度厚樸總酚的工藝方法，步驟如下: I)稱取中藥厚樸26g，粉碎，用6%( v%)的鹽酸乙醇溶液85mL在62°C下提取，回流2.5h，抽濾，提取兩次，合并濾液減壓蒸餾回收乙醇，同時補加pH=2的水，離心，收集析出物。將析出固體溶于pH=12的30%乙醇水溶液140mL中，離心除去不溶物，得到吸附液。
[0022]2)將90mL (3BV)的上述吸附液通過裝有CAD-40大孔吸附樹脂的樹脂柱(柱內徑8 mm，柱長250 mm，裝有30 mL濕樹脂)，吸附速度為I BV/h;
3)吸附完成后，用60mL (2BV)的去離子水將樹脂清洗干凈，用90mL (3BV)60% (v%)乙醇水溶液將樹脂上吸附能力較弱的雜質洗脫下來速度為IBV / h;
4)用120mL(4BV)80% (v%)乙醇水溶液作解吸劑，解吸速度為IBV / h，收集解吸液；
5)將上述解吸液經減壓蒸餾并回收乙醇，然后經濃縮、真空干燥，得到棕色厚樸總酚提取物 0.3391g。
[0023]經HPLC分析測定，提取物中厚樸總酚含量為71.7% (w%)，且通過Marquis試劑)檢測，該提取物中不含生物堿。
[0024]實施例4:
用商品化AB-8大孔吸附樹脂提取高純度厚樸總酚的工藝方法，步驟如下:
O稱取中藥厚樸48g，粉碎，用5% (v%)的鹽酸乙醇溶液185mL在65°C下提取厚樸酚與和厚樸酚，回流2.5h，提取兩次，抽濾，合并濾液減壓蒸餾回收乙醇，同時補加pH=2的水，離心，收集析出物。將析出固體溶于pH=13的30% (v%)乙醇水溶液240mL中，離心除去少量不溶物，得到吸附液。
[0025]2)將120mL (2BV)的上述吸附液通過裝有AB_8大孔吸附樹脂的樹脂柱(柱內徑1.2mm,柱長200 mm,裝有60 mL濕樹脂)，吸附速度為1.5 BV/h ；
3)吸附完成后，用180mL (3BV)的去離子水將樹脂清洗干凈，用180mL (3BV)體積百分比為60% (v%)乙醇水溶液將樹脂上吸附能力較弱的雜質洗脫下來速度為1.5BV / h ；
4)用240mL(4BV)體積百分比濃度為80%乙醇水溶液作解吸劑，解吸速度為1.5 BV /h，收集解吸液；
5)將上述解吸液經減壓蒸餾并回收乙醇，然后經濃縮、真空干燥，得到棕色厚樸總酚提取物 0.3934g。
[0026]經HPLC分析測定，提取物中厚樸總酚含量為72.3%，且通過Marquis試劑)檢測，該提取物中不含生物堿。
[0027]實施例5:
用商品化HPD-722大孔吸附樹脂提取高純度厚樸總酚的工藝方法，步驟如下:
I)稱取中藥厚樸48g，粉碎，用5% (v%)的鹽酸乙醇溶液180mL在65°C下提取，回流2.5h，抽濾，提取兩次，合并濾液減壓蒸餾回收乙醇，同時補加pH=2的水，離心，收集析出物。將析出固體溶于pH=13的30%乙醇水溶液240mL中，離心除去少量不溶物，得到上層清液，即為吸附液。
[0028]2)將1 20mL (2BV)的上述吸附液通過裝有HPD-722大孔吸附樹脂的樹脂柱(柱內徑12 _，柱長200 mm，裝有60 mL濕樹脂)，吸附速度為1.5 BV/h ；
3)吸附完成后，用120mL (2BV)的去離子水將樹脂清洗干凈，用120mL (2BV)60% (v%)乙醇水溶液將樹脂上吸附能力較弱的雜質洗脫下來速度為1.5BV / h ；
4)用240mL(4BV)80% (v%)乙醇水溶液作解吸劑，解吸速度為1.5BV / h，收集解吸
液；
5)將上述解吸液經減壓蒸餾并回收乙醇，然后經濃縮、真空干燥，得到棕色厚樸總酚提取物 0.3824g。
[0029]經HPLC分析測定，提取物中厚樸總酚含量為70.0% (w%)，且通過Marquis試劑)檢測，該提取物中不含生物堿。
[0030]實施例6:
用商品化CAD-45大孔吸附樹脂提取高純度厚樸總酚的工藝方法，步驟如下:
I)稱取中藥厚樸52g，粉碎，用5% (v%)的鹽酸乙醇溶液180mL在65°C下提取，回流2.5h，抽濾，提取兩次，合并濾液減壓蒸餾回收乙醇，同時補加pH=2的水，離心，收集析出物。將析出固體溶于pH=13的30%乙醇水溶液240mL中，離心除去少量不溶物，得到上層清液，即為吸附液。
[0031]2)將180mL (3BV)的上述吸附液通過裝有CAD-45大孔吸附樹脂的樹脂柱(柱內徑12_，柱長200 _，裝有60 mL濕樹脂)，吸附速度為1.5 BV/h ；
3)吸附完成后，用120mL (2BV)的去離子水將樹脂清洗干凈，用180mL (3BV)60% (v%)乙醇水溶液將樹脂上吸附能力較弱的雜質洗脫下來速度為1.5BV / h ；
4)用240mL(4BV)80% (v%)乙醇水溶液作解吸劑，解吸速度為1.5BV / h，收集解吸
液；
5)將上述解吸液經減壓蒸餾并回收乙醇，然后經濃縮、真空干燥，得到棕色厚樸總酚提取物 0.6048g。
[0032]經HPLC分析測定，提取物中厚樸總酚含量為71.6% (w%)，且通過Marquis試劑)檢測，該提取物中不含生物堿。
[0033]實施例7:
用商品化DlOl大孔吸附樹脂提取高純度厚樸總酚的工藝方法，步驟如下:
O稱取中藥厚樸107g，粉碎，用6% (v%)的鹽酸乙醇溶液350mL在65°C下提取，回流
2.5h，抽濾，提取兩次，合并濾液減壓蒸餾回收乙醇，同時補加pH=2的水，離心，收集析出物。將析出固體溶于pH=12.5的30%乙醇水溶液240mL中，離心除去少量不溶物，得到吸附液。[0034]2)將200mL (2BV)的上述吸附液通過裝有DlOl大孔吸附樹脂的樹脂柱(柱內徑15 _，柱長300 _，裝有100 mL濕樹脂)，吸附速度為1.5 BV/h ；
3)吸附完成后，用300mL(3BV)的去離子水將樹脂清洗干凈，用300mL (3BV)60% (v%)乙醇水溶液將樹脂上吸附能力較弱的雜質洗脫下來速度為1.5BV / h ；
4)用240mL(4BV) 80% (v%)乙醇水溶液作解吸劑，解吸速度為1.5BV / h，收集解吸
液；
5)將上述解吸液經減壓蒸餾并回收乙醇，然后經濃縮、真空干燥，得到棕色厚樸總酚提取物 0.9596g。
[0035]經HPLC分析測定，提取物中厚樸總酚含量為72.8% (w%)，且通過Marquis試劑)檢測，該提取物中不含生物堿。
[0036]實施例8:
用商品化AB-8大孔吸 附樹脂提取高純度厚樸總酚的工藝方法，步驟如下:
I)稱取中藥厚樸101g，粉碎，用5% (v%)的鹽酸乙醇溶液320mL在70°C下提取厚樸酚與和厚樸酚，回流2h，提取兩次，抽濾，合并濾液減壓蒸餾回收乙醇，同時補加pH=l的水，離心，收集析出物。將析出固體溶于pH=ll.5的30% (v%)乙醇水溶液240mL中，離心除去少量不溶物，得到吸附液。
[0037]2)將200mL (2BV)的上述吸附液通過裝有AB_8大孔吸附樹脂的樹脂柱(柱內徑15 _，柱長300 _，裝有100 mL濕樹脂)，吸附速度為2.0 BV/h ；
3)吸附完成后，用300mL (3BV)的去離子水將樹脂清洗干凈，用300mL (3BV)體積百分比為60%乙醇水溶液將樹脂上吸附能力較弱的雜質洗脫下來速度為2.0BV / h ；
4)用300mL(3BV)體積百分比濃度為80%乙醇水溶液作解吸劑，解吸速度為2.0 BV /h，收集解吸液；
5)將上述解吸液經減壓蒸餾并回收乙醇，然后經濃縮、真空干燥，得到棕色厚樸總酚提取物 0.9668g。
[0038]經HPLC分析測定，提取物中厚樸總酚含量為72.9% (w%)，且通過Marquis試劑)檢測，該提取物中不含生物堿。
【權利要求】
1.一種厚樸總酚提取物的吸附分離制備工藝，其特征是，步驟包括吸附液的制備、大孔吸附樹脂吸附、吸附后平衡、厚樸總酚的解吸和解吸液后處理，其中吸附液的制備方法為有機溶劑中酸堿隔離提取吸附液的制備方法。
2.根據權利要求1所述的厚樸總酚提取物的吸附分離制備工藝，其特征是，所述的有機溶劑中酸堿隔離提取吸附液的制備方法的步驟為:將厚樸粉碎，用5%-8% (v%)的鹽酸乙醇溶液，作為提取液，在55°C -70°C下提取厚樸酚與和厚樸酚，藥材質量(g)與提取液體積(mL)比為l:3~l:5，W/v，回流2-3h，抽濾，相同操作條件下提取兩次，合并濾液、減壓蒸餾回收乙醇后，補加pH=l-3的水，保持厚樸藥材的質量(g)與溶液體積(mL)之比為1:5-1: 6，離心，收集析出物，將析出固體溶于pH=ll_13的30% (v%)乙醇水溶液中，厚樸藥材質量(g)與溶液體積(mL)比為1:5-1:7，離心除去少量不溶物，得到上層清液，即為吸附液。
3.根據權利要求1所述的厚樸總酚提取物的吸附分離制備工藝，其特征是，所述的大孔吸附樹脂吸附步驟為:將2-4倍床體積(BV)的吸附液通過裝有大孔吸附樹脂的樹脂柱進行吸附，吸附流速為0.5-2.0BV / h，吸附柱的長徑比為1:5-1:20;所述的吸附后平衡的步驟為:2-3BV的去離子水將樹脂清洗干凈，再用2-4BV的60%(v%)乙醇水溶液繼續清洗樹脂柱，流速均為0.5-2.0 BV / h ;所述的厚樸總酚的解吸步驟為:用3-5BV的80% (v%)乙醇水溶液作解吸劑，解吸速度為0.5-2.0 BV / h，收集解吸液；所述的解吸液后處理步驟為:解吸液經減壓蒸餾并回收乙醇，然后經濃縮、真空干燥，得到棕色厚樸總酚提取物。
4.根據權利要求3所述的的厚樸總酚提取物的吸附分離制備工藝，其特征是，所述的大孔吸附樹脂牌號為 AB-8、HPD-722、D101、CAD-40、CAD-45。
【文檔編號】A61K36/575GK103933122SQ201410136342
【公開日】2014年7月23日 申請日期:2014年4月5日 優先權日:2014年4月5日
【發明者】王春紅 申請人:南開大學